Summary
Ved hjelp av høyoppløselige kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikroskopi, er en ex vivo observasjon av juling av motile ependymal flimmerhårene ligger innenfor muse hjernen ventriklene demonstrert av levende-avbildning. Teknikken gjør et opptak av den unike stråle juling frekvens og slo vinkel samt deres intracellulær kalsium pendling pace egenskaper.
Abstract
Multiciliated ependymal celler linje ventriklene i den voksne hjernen. Unormal funksjon eller struktur av ependymal flimmerhårene er assosiert med ulike nevrologiske utfall. Den nåværende ex vivo levende avbildning av motile ependymal flimmerhårene teknikk muliggjør en detaljert studie av ciliary dynamikk følge flere trinn. Disse trinnene er: mus dødshjelp med karbondioksid i henhold til protokoller fra The University of Toledo Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC); craniectomy fulgt av hjernen fjerning og sagittal hjernen disseksjon med en vibratome eller skarp kniv for å få svært tynne snitt gjennom hjerne sideventriklene, der ependymal flimmerhårene kan visualiseres. Inkubasjon av hjernens skivene i en tilpasset glass-bunnplate inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) / høy-glukose ved 37 ° C i nærvær av 95% / 5% O 2 / CO 2-blanding er viktig for å holde vevet i live underforsøket. En video av flimmerhårene juling blir deretter tatt opp med en høy oppløsning kontrast differensial forstyrrelser mikroskop. Video blir deretter analysert ramme for ramme til å beregne Ciliary vibrerende frekvens. Dette gjør tydelig klassifisering av ependymal celler i tre kategorier eller typer basert på deres ciliær juling frekvens og vinkel. Videre gir denne teknikken bruk av high-speed fluorescens bildebehandling analyse for å karakterisere den unike intracellulære kalsium vibrasjons- egenskapene ependymal celler samt effekten av farmakologiske midler på kalsium svingninger og ciliary juling frekvens. Dessuten er denne teknikken er egnet for avbildning immunofluorescens for ciliær struktur og ciliare protein lokaliseringsstudier. Dette er spesielt viktig i sykdomsdiagnose og fenotype studier. Den største begrensningen av teknikken er knyttet til reduksjon i levende bevegelige flimmerhårene bevegelse som hjernevevet begynner å dø.
Introduction
Cilia er sensoriske mikrotubul-baserte organeller som strekker seg fra celleoverflaten til det ekstracellulære miljø. Avhengig av mikrotubulus organisasjon kan være cilia kategoriseres i to typer - "9 + 0" og "9 + 2". Funksjonelt, basert på deres motilitet, disse kan bli klassifisert som bevegelig eller ikke-motile cilia 1. Primær cilia er et begrep som vanligvis brukes for å betegne "9 + 0« ikke-motile cilia. Disse har ni parallelle doublet mikrotubuli (angitt ved "9"), og et sentralt par av mikrotubuli er fraværende innenfor den sentrale skjede (betegnet med "0"). Imidlertid, noen "9 + 0" cilia, slik som nodal cilia, som regulerer embryo laterality er motile 2. På den annen side er motile cilia karakterisert, i tillegg til de ni parallelle mikrotubul dubletter, ved en ytterligere sentral par mikrotubul dubletter og forbundet med dynein motor proteiner for å lette motilitet. I tillegg har noen "92 "flimmerhårene som olfactory flimmerhårene er ubevegelige tre. Ependymal celler lining hjernen ventriklene og sentralkanalen i ryggmargen er preget av motile flimmerhårene som drive cerebrospinalvæsken (CSF) sammen hjernen ventriklene 4.
Det overordnede målet med denne metoden er å legge til rette for å studere motile cilia dynamikk og strukturelle abnormiteter. Hjernens helse og utvikling sterkt avhengig av effektiv sirkulasjon av CSF i hjernen ventriklene. For eksempel, normal CSF strømning og væskebalanse krever normal vibrerende og funksjonell ependymal cilia 5,6, som i sin tur spiller avgjørende roller i regulering av retningsbevegelse av nerveceller og stamcelle migrasjon 7. Som sådan unormal ependymal cilia funksjon eller struktur som kan føre til unormal CSF strømning, som er forbundet med vann, en medisinsk tilstand hvor det er en unormal oppsamling av CSF i ventriklene i bregn. Dette kan dermed føre til økt intrakranielt trykk og progressiv utvidelse av hodet, kramper, tunnelsyn, og psykisk funksjonshemming 8.
Fordelene ved denne teknikk i forhold til eksisterende metoder er at det er mulig for første gang å rapportere tre distinkte ependymal celletyper: I, II, og III, på grunnlag av deres unike ciliær vibrerende frekvens og slå vinkel. Disse ependymal cellene er lokalisert innenfor visse områder i hjernen ventriklene. Videre kan effektene av alder og farmakologiske midler slik som alkohol og cilostazol på å endre ependymal celletyper eller deres lokaliseringer påvises, noe som ikke var mulig før denne klassifiseringen av ependymal celler. Cilostazol er en hemmer av fosfodiesterase-3, et enzym som metaboliserer cAMP til AMP og det også regulerer intracellulær kalsium 9. Ved hjelp av høyhastighets fluorescens bildebehandling analyse tillater avbildning og kvantifisering av den unike intracellulærekalsium vibrasjons- egenskapene til ependymal celler. For eksempel, både alkohol og cilostazol vesentlig endret ependymal stråle vibrerende frekvens, så vel som de intracellulære kalsium Svingninger egenskaper, noe som i sin tur kan føre til en endring i cerebrospinalvæsken volumet erstattet med ependymal cilia 10. I sammendraget, denne teknikken var nøkkelen til å gi det første bevis på tre forskjellige typer ependymal celler med ulike kalsium vibrasjons- egenskaper.
I neste avsnitt, er en detaljert steg-for-steg oversikt over prosedyren gitt, vier oppmerksomhet til vev forberedelse og håndtering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrene for bruk av dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra The University of Toledo i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk komité ved National Institutes of Health og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Brain Utvinning, Seksjonering og Vevspreparering
- Ofre villtype mus belastning C57BL / 6 ved dypt euthanizing med CO 2 kvelning i 5 min. Forsikre døden ved halshugging.
- Rengjør musehode med 70% etanol.
- Utfør craniectomy bruker steril saks og pinsett ved først å trekke skinnet av, og starter med toppen av hodet for å avsløre skallen.
- Deretter, når skallen er eksponert, fjerner skallen ved å trekke benet bit-for-bit, som starter fra den bakre side og beveger seg mot den fremre side. Vær forsiktig for ikke å ødelegge hjernen ventriklene.
- Samle hele hjernen.
- Plasser hjernen i en 100 mm petriskål inneholdende DMEM / høy-glukose supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin løsning som inneholdt 10 000 enheter / ml penicillin og 10 000 ug / ml streptomycin og forvarmet til 37 ° C.
- Skjær hjernen på median sagittale plan for hånd med en skarp kniv, og tak i den første seksjon 100 til 200 mm fra hver halvdel ved hjelp av en vibratome.
- Skyll hjernevev med forvarmet 37 ° C fosfatbufret saltløsning (1 x PBS) løsning.
- Umiddelbart plassere hjernen delen i DMEM / High-Glucose media forvarmes til 37 ° C.
2. Levende Imaging Configuration and Setup
- Plasser hjernevevet seksjoner i 30 mm glassbunn kultur retter som inneholder 1 ml DMEM / høy Glukose media. Juster til mikroskopet lukket kammer miljø til 37 ° C, 95% / 5% O2 / CO2 innhold (Figur 1
- Ved hjelp av en 60X objektiv olje nedsenking linse, samle ependymal celler / cilia bilder ved først å plassere en oljedråpe på 60X objektiv og fokusere på cellene med vanlig DIC overført lys.
- Deretter følger retningen av DMEM boble bevegelse som en guide til plasseringen av motile ependymal flimmerhårene som ciliary slag skape en slags boble bevegelse i området. Velg et område som inneholder sunne celler med bevegelig flimmerhårene i hjernens laterale ventrikkel med DIC filter. Når ependymal cilia er funnet, justere lys og fokus for å oppnå et tilfredsstillende bilde.
- Still live bildeparametre i henhold til et bestemt formål ved hjelp Metamorph bildebehandlingsprogrammer. I den aktuelle demonstrasjonen, erverve tjuefire-bits bilder med kameraet binning satt til 1 x 1 kombinert med 60X objektiv og 5-10 msek eksponeringstid.
- Samle DIC bildene ved å åpne mikroskop åpning til et optimalt nivå for å ha et minimum exposure tid. Observere levende bilder strømmen til kameraet for å gi rask og umiddelbar image oppkjøpet uten forsinkelse. Beregne hastigheten på flimmerhårene juling basert på kravet om minimal eksponeringstider for å oppnå tilstrekkelig bildekontrast.
3. Data Visualisering og analyse
- Beregne antall cilia slag ved å telle antall slag i 1 min. Gjør dette ved å redusere hastigheten på video og telle antall slag ved hjelp av en celleteller eller lignende verktøy.
- For å beregne hyppigheten av slag, multiplisere eksponeringstiden hvor videoen er spilt inn med antall rammene eller time-lapse bilder ervervet å få antall sek. (Eksempel: eksponeringstid 5 msek 200 bilder = 1000 ms eller 1 sek).
- Beregne antallet slag i ett sekund for å oppnå den frekvens som blir uttrykt som antall av å slå en per sek. Gjør dette ved å dele antall cilia slag over en ett-gang interval (Eksempel: cilier slår 50 ganger på 200 rammer video spilt inn på eksponeringstid på 5 ms ie 5 ms x 200 bilder = 1 sek, nå dele 50 slag etter 1 sek = 50 Hz).
- Beregne stråle juling vinkel ved å evaluere banen tatt av ependymal flimmerhårene under både strøm og utvinning slag. Utføre dette i henhold til en tidligere beskrevet metode, med mindre modifikasjoner 11. Den presise bevegelser av individuelle cilia observeres under hele valdet syklus.
- På et acetat ark plassert over skjermen, trekke en horisontal linje langs ependymal kant og en loddrett linje gjennom midtlinjen plasseringen av cilia ved begynnelsen av arbeidsslaget.
- Plotte den nøyaktige plasseringen av cilium bilde for bilde når den beveger seg fremover i løpet av arbeidsslag. På lignende måte, plotte bevegelse av cilia under utvinning slag.
- Beregne stråle juling vinkel fra maksimalt avvik av cilium fra midtlinjen under tHan arbeidsslag, så vel som utvinning slag.
4. Kalsium Signal Recording
- Etter kutting av hjernen, kort renset hjernen skive med 1 x PBS eller Dulbeccos PBS (pH 7,0). Forbered frisk Fluo-2 for å unngå fluorescensslukking, og for å oppnå godt signal-til-støy-forhold.
- Forbered 1 mM stamløsning av Fluo-2-løsning i dimetylsulfoksyd (DMSO), bland og virvle oppløsningen i minst 5 minutter for å sikre at Fluo-2 er homogent oppløst i DMSO.
- Fortynn Fluo-2 stamløsning i 500 ml DMEM / høy-glukose supplert med 2% B27 forvarmet til 37 ° C til en endelig konsentrasjon på 20 mg / ml.
MERK: B-27 er en optimalisert serumfritt supplement inneholder vitamin A, antioksidant cocktail og insulin brukes til å støtte kort- eller langsiktig levedyktighet av hippocampus og andre CNS nevroner. - Umiddelbart inkuber hjernen skive med 20 mg / ml Fluo-2 i 30 min ved 37 ° C i et glass-bunnplate.
- For å bestemme optimal lasting konsentrasjonen av kalsium fluorophore Fluo-2 og for å unngå kalsium fargestoff celle toksisitet, utfordrer celler med ATP, og sjekk cellen levedyktighet ved å bestemme tidsforløpet og peak omfanget av kalsium signaler som respons på ATP.
- Ta opp video for kalsium oscillasjon ved en opptakshastighet på 5 msek for et minimum av 1 sek (200 rammer per sekund), med eksitasjons- og emisjonsbølgelengder på 488 nm og 515 nm, henholdsvis (Film 2).
- Å skille Fluo-2 kalsium signal fra autofluorescence eller bevegelse gjenstander, sikre at intensiteter slippes på 515 nm blir overvåket separat.
MERK: Fluo-2 er ikke kalsium fluoremetric egnet til å kvantifisere intracellulær kalsium. Imidlertid er det en utmerket dynamisk kalsium fargestoff til å detektere raske kalsium endringer, for eksempel kalsium svingninger. For mer nøyaktig kalsium kvantifisering, er Fura-2 anbefales. Imidlertid er de dynamiske endringer av Fura-2 begrenset av dens ratiometriskarten av fargestoffet. - Følg formlene gitt av produsenten for å beregne de eksakte gratis intracellulære kalsiumverdiene. Eksempel [Ca2 +] = K x D (R - R min) / (R max - R). Hvor K d er dissosiasjonskonstanten av fargestoffet fra den frigjorte kalsium, R er den målte fluorescens ved 488, og R minutter og R max er fluorescens-forhold på minimum og maksimum ionekonsentrasjon 12.
5. Immunofluorescence Mikros
- Fest hjerneseksjoner med fosfat-bufret saltoppløsning inneholdende 4% paraformaldehyd (PFA) og 2% sukrose i 10 min. Alternativt fikse hele hjernen med 4% PFA og deretter delen inn 50 mm seksjoner ved hjelp av en kryostat.
- Vask vevet tre ganger med 1 x PBS i 5 min hver gang.
- Inkuber hjernen skive med en solutipå 0,1% Triton-X i 1 x PBS i 5 min, deretter spyles tre ganger med 1 x PBS i 5 min hver gang.
- Inkuber hjernen skive med mus primært antistoff, antiacetylated a-tubulin, anvendt ved en fortynning på 1: 5000 i 10% FBS i 1 x PBS i en time ved romtemperatur (RT), eller over natten ved 4 ° C.
- Vask vevet tre ganger med 1 x PBS i 5 min hver gang.
- Inkuber hjernen skive i sekundært antistoff, fluorescein anti-muse-IgG ved en fortynning på 1: 500 i 10% FBS i 1 x PBS-oppløsning i 1 time ved RT.
- Før observasjon under et fluorescerende mikroskop, counterstain delen med 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minutter for å farge kjernen (eller DNA) 13. For å minimere bleking, image seksjonene umiddelbart med minimum eksponeringstid mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Måling ependymal flimmerhårene funksjon i levende mus hjernen
Metoden som beskrives i denne protokollen blir brukt for å overvåke ependymal cilia funksjon og struktur i den friske vev dissekert fra musehjerne, så vel som til å overvåke og studere cilia vibrerende frekvens. Trinnene følges for å oppnå en fullstendig eksperiment er vist i et skjematisk flytdiagram (figur 1). Det anbefales sterkt at forsøket er gjennomført innenfor en kort tidsramme for å holde bevegelige flimmerhårene så aktiv som mulig. En representant time-lapse film og bilder av ependymal celler og deres bevegelige cilier er også vist (Movie 1 og figur 2a). Analyse av data i det oppnådde strømmen oppnås ved å telle det vibrerende og vinkel mønster av de bevegelige cilia. Kriteriene for å dele cilia i tre typer er presentert i tabell 1. Tilstedeværelsen av ependymal cilia er konfiRMED med en ciliær markør, acetylert-a-tubulin, og ependymal cellene er motfarget med DAPI (DNA-markør) for å vise kjernen (figur 2b). Basert på våre observasjoner av ependymal celler i hjernen laterale ventrikkel fra minst 22 uavhengige forsøk, var vi i stand til å klassifisere ependymal celler inn i tre typer basert på deres ciliare juling frekvens. Videre demonstrerte vi at etanol ved 0.25% konsentrasjon betydelig undertrykt cilia vibrerende frekvens uavhengig av type (figur 3). Enda viktigere, disse dataene er i konsistens med våre tidligere funn 10.
Måling kalsium signale av ependymal cilia
Det har tidligere vært vist at bøying av cilia kan utløse en cilium-avhengig intracellulær kalsiumsignale 14-16. Denne teknikken tillater forskere å undersøke og måle den intracellulære kalsium signal i hjernen ventriklene
Figur 1:. Ependymal cilier bildebehandling protokollen flyt Ependymal cilier bildebehandling protokollen illustrerer trinnene for å full et eksperiment fra mus brainextraction, seksjonering og vev forberedelse til bilde oppkjøpet og analyse. Et tilnærmet én time tidslinje presenteres med trinn-for-trinn prosedyre.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Figur 2:. Ependymal flimmerhårene lokalisering i hjernen ventriklene Vist her er ependymal celler fra den laterale ventrikkel med musen hjernen. (A) DIC bilder av individuelle ependymal celler (bunn piler) og flimmerhårene (topp piler) er vist. (B) Et overlay-bilde av en hjerne delen er farget med antistoff mot en ciliær markør, acetylert a-tubulin, vist i grønt (topp piler), og motfarget med et kjernefysisk / DNA-markør, DAPI, vist i blått (nederst piler) . Vær oppmerksom på at panelene a og b representerer ulike hjerne seksjoner.
Fig. 3: Alkohol og forskjeller i cilia slår frekvenser mellom typer ependymal celler i mus hjernen lateral ventrikkel for ex vivo hjernen skive ble inkubert uten (kontroll) eller med (Ethanol) 0,25% alkohol i 5 minutter. Sammenlignet med kontrollgruppen, alkohol behandling signifikant redusert cilia vibrerende frekvens, som angitt med en stjerne. Minst 5-10 uavhengige preparater ble benyttet for hver ependymal celletype og behandlingsgruppe.
Film 1: Opptak av ependymal flimmerhårene i type III ependymal celler Vist her er opptak av ependymal flimmerhårene, preget av å slå frekvens og vinkel unikt å skrive III ependymal celler fra hjernens tredje ventrikkel.. Dette tallet er tidligere blitt rapportert 10 og er gjengitt med tillatelse.
Film 2: Intracellulær kalsium svingning i ependymal celler Vist her er opptak av kalsium svingninger ependymal celler gjennom en del av hjernens lateral ven.tricle etter inkubering av hjernen skive med 20 mg / ml kalsium indikator, Fluo-2, i 30 minutter ved 37 ° C. Hjernen delen kalsium nivået ble studert og pseudo-farget. Fargen bar indikerer ependymal cellenes kalsiumnivå; hvor svart-lilla og rød-gul representerer lave og høye kalsiumnivåer, henholdsvis. For intracellulære kalsium kvantifisering, vil ependymal celle kalsium beregnes ut fra flere individuelle ependymal celler, som nevnt i teksten protokollen og i gjennomsnitt mellom kontroll- og behandlingsgrupper. Videoen av kalsium pendling ble registrert på 200 bilder per sekund med eksitasjon og emisjonsbølgelengder av 488 nm og 515 nm, henholdsvis. Dette tallet er tidligere blitt rapportert 10 og er gjengitt med tillatelse.
| Ependymal celletype | Cilia juling frekvens | Cilia juling vinkel |
| Type I | > 60 Hz | <90 ° |
| Type II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Type III | <30 Hz | > 135 ° |
Tabell 1:. Typer ependymal flimmerhårene klassifisering ependymal flimmerhårene i type I, ble II eller III primært basert på juling frekvens og slo vinkelen ependymal flimmerhårene ligger innenfor forskjellige regioner av hjernen tredje ventrikkel. Deler av disse dataene har tidligere blitt rapportert, og ble gjenbrukt her med tillatelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en protokoll for fremstilling av muse-hjernevev for både live-avbildning og fluorescensmikroskopi som gir en hurtig og følsom nøye observasjon av ependymal cilia i hjernen ventriklene. Denne teknikken er ikke begrenset til den laterale ventrikkel bare; Det kan benyttes for å observere cilia i andre hjerne ventriklene. Dette avbildningsteknikk gir en live stream som ligner bevegelsen av CSF ved stråle juling i en ex vivo setting. Videre, det gir analyse av retningsbestemt bevegelse av cilia. Dette er hovedsakelig lettes ved bruk av en høy oppløsning DIC og fluorescens avbildningssystem. En fordel med dette systemet er at mikroskopet er innesluttet i et miljøkammer, som gjør det mulig for en fin regulering av temperatur, fuktighet og CO2-nivåer. Disse er svært kritiske parametere som bør vurderes for overlevelsen av celler og vev når opptre live avbildning experiments. Systemet er også utstyrt med automatiske XY og Z-moduler samt et digitalt kamera og bølgelengde filter switcher, som alle er viktige funksjoner for å lette avbildning av dynamiske cellulære atferd som cilia bevegelser. Mikroskopet er koblet til en datamaskin og oppkjøpet av bilder av høy kvalitet er tilrettelagt av bilderedigeringsprogrammer.
Ved hjelp av denne teknikken til å klassifisere ependymal celler inn i forskjellige typer gir en betydelig forbedring i forhold til eksisterende / tidligere metoder som brukes for å studere ependymal flimmerhårene. For eksempel kan virkningen av visse farmakologiske eller toksiske midler, slik som alkohol på annen måte reduseres til et minimum eller oppheves hvis ependymal celler er ansett som en 17 populasjon. Det er viktig å huske på at, til tross for at de samme egenskapene av flimmerhårene juling frekvenser og vinkler er svært forskjellig mellom disse tre typene ependymal flimmerhårene, har vi nettopp begynt å forstå fysiologi av disse cellene. DeravIfølge tidligere arbeidet vårt, er vår klassifisering robust nok hvis prosedyren utføres riktig som beskrevet i denne protokollen.
Identifisere distinkte ependymal flimmerhårene er fundamentalt viktig for å få en grunnleggende forståelse av ependymal fysiologi. Denne metoden gjør det mulig å skille mellom tre forskjellige typer av celler ependymal unikt og spesielt plassert inne i den tredje ventrikkel i forhold til det vibrerende frekvens og vinkel, som fører til inndeling i tre forskjellige typer (tabell 1). For å bekrefte at forskjellene i flimmerhårene slo frekvenser er ikke på grunn av forskjeller i levedyktigheten av de ependymal celler eller forskjeller i dyret alder, anbefales det at bare intakte og undetached ependymal strimler eller skiver som er knyttet til nervevev og på minst 100 mm tykke brukes. Videre bør ciliær vibrerende frekvens måles på forskjellige steder langs hver seksjon ependymal. Vi har tidligere vist at stråle takt frekvens data generert ved hjelp av denne teknikken har vært konsekvent reproduserbar blant 87 eksperimentelle observasjonene 10. Derfor er ependymal celler nøyaktig klassifisert avhengig av deres ciliare juling. Dessuten, ved bruk av farmakologiske midler som er kjent for å redusere Ciliary vibrerende frekvens, cilia vibrerende frekvens skal teoretisk tilbake til normal vibrerende frekvens etter fjerning av slike farmakologiske midler.
Et viktig skritt i denne protokollen er i hovedsak knyttet til håndtering av hjernevev og tiden det tar å fullføre eksperimentet. Det er viktig å behandle hjernevevet forsiktig for å bevare strukturen og funksjonen av ependymal cilia så vel som for å redusere skade på skjøre vev. Mer viktig, og for å unngå forverring og død av hjernevevet, noe som kan være en begrensende faktor for å lykkes med denne teknikken, er det svært recommended at trinnene i forbindelse med denne teknikken utføres i så nær en time som mulig. Imidlertid kan denne begrensningen overvinnes i fremtiden med fremskritt i dyrkingen og vokser ependymal eller lignende celletyper med motile cilia in vitro, eller ved bruk av alternative næringsmedier. Bruken av alternative næringsmedier som aCSF og Earls salter for inkubering av hjerneskiver har blitt vist i litteraturen 5. Men i våre hender, anvendelse av DMEM / High-glukose var mer fordelaktig enn aCSF muligens på grunn av tilstedeværelse av høye mengden av glukose (4500 mg / ml) i medium som en potensiell energikilde. Dermed det viktigste kriteriet for å vurdere levedyktigheten av vevet og dermed gyldigheten av tilnærmingen vurderer flimmerhårene juling, da dette er en representant tegn på levende celler.
Live-avbildning av ependymal flimmerhårene tilbyr et kraftig verktøy for å analysere nedstrøms signalveier av flimmerhårene aktiveringslik som kalsium signalering og svingninger. For eksempel bruker levende fluorescens bildebehandling, det har vist seg at uavhengig av ependymal celle / flimmerhårene type, er ependymal celler preget av unikt kalsium vibrasjons- egenskaper 10. Alt i alt er dette protokollen relevant for både grunnleggende vitenskapelig kunnskap og klinisk praksis. Fra grunnleggende vitenskap perspektiv, tilbyr denne teknikken en vurdering av de funksjonelle og fysiologiske roller ependymal flimmerhårene struktur, funksjon og nedstrøms mekanistiske signalveier. Fra klinisk praksis perspektiv, er denne metoden svært relevant for søket etter medikamenter som mål ependymal flimmerhårene som en ny terapeutisk mål for nevrologiske lidelser som hydrocephalus og alkoholmisbruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
