Summary
Использование высокого разрешения дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии, экс естественных условиях наблюдение избиения подвижных ресничек эпендимных расположенном в желудочки головного мозга мыши демонстрируют живого изображения. Методика позволяет запись уникальной частотой цилиарного размола и угол бил, а также их внутриклеточный кальций свойства колебаний стимуляции.
Abstract
Multiciliated эпендимные клетки выстилают желудочки во взрослом мозге. Нарушение функции или структуры эпендимных ресничек связана с различными неврологическими дефицита. Тока экс естественных условиях живут изображений подвижных ресничек эпендимных техники позволяет для детального изучения динамики цилиарных после нескольких шагов. Эти шаги включают в себя: мыши эвтаназии диоксидом углерода в соответствии с протоколами университета Уходу за животными Толедо и использование комитета (IACUC); удаление фрагментов костей черепа с последующим удалением головного мозга и сагиттальном вскрытия головного мозга с vibratome или острым лезвием, чтобы получить очень тонкие срезы через боковые желудочки головного мозга, где эпендимных реснички могут быть визуализированы. Инкубация ломтиками мозга в индивидуальных стеклянным дном пластины, содержащие модифицированные Игла среды (DMEM) / High-глюкоза Дульбекко при 37 ° С в присутствии 95% / 5% O 2 / CO 2 смеси важно, чтобы ткань живых в течениеэксперимент. Видео ресничек избиения затем записываются с использованием высокого разрешения дифференциального интерференционного контрастного микроскопа. Видео затем анализируют кадр за кадром, чтобы вычислить частоту цилиарного биение. Это позволяет отличный классификацию эпендимных клеток в трех видов или категорий в зависимости от их частоты мерцательная избиения и угла. Кроме того, этот метод позволяет использовать высокоскоростной анализа флуоресцентной томографии для характеристики уникальные внутриклеточные колебаний кальция свойства эпендимных клеток, а также влияния фармакологических агентов на колебания кальция и частоту цилиарного избиение. Кроме того, этот метод подходит для иммунофлуоресценции изображений для структуры цилиарного и локализации белка мерцательная исследований. Это особенно важно в диагностике болезни и фенотипа исследований. Основным ограничением методики связано с уменьшением в живом подвижных ресничек, как движения ткани мозга начинает умирать.
Introduction
Реснички сенсорные микротрубочек на основе органеллы, которые простираются от поверхности клетки во внеклеточную среду. В зависимости от их микротрубочек организации, реснички могут быть классифицированы на два типа - "9 + 0" или "9 + 2". Функционально, в зависимости от их подвижности, они могут быть классифицированы как подвижных или неподвижных ресничек 1. Первичная ресничек термин обычно используется для обозначения "9 + 0" неподвижные реснички. Они имеют девять параллельных микротрубочек дублетные (обозначается '9') и центральная пара микротрубочек отсутствует в центральной оболочкой (обозначение «0»). Тем не менее, некоторые "9 + 0" реснички, такие как узловой ресничек, которые регулируют эмбриона латерализацию подвижны 2. С другой стороны, подвижные реснички характеризуется, в дополнение к девяти параллельных дублетов микротрубочек, дополнительным центральной пары микротрубочек дублетов и связанные с динеин моторных белков, чтобы облегчить подвижность. Кроме того, некоторые "9+2 »Реснички, такие как обонятельные реснички неподвижны 3. Эпендимных клетки, выстилающие желудочки мозга и центральный канал спинного мозга характеризуются подвижных ресничек, которые продвигают спинномозговой жидкости (ликвора) вдоль желудочков головного мозга 4.
Общая цель этого метода заключается в содействии изучению подвижных динамика реснички и структурные аномалии. Здоровье и развитие мозга в значительной степени зависят от эффективной циркуляции ликвора в желудочках головного мозга. Например, нормальный поток CSF и баланс жидкости требует нормальной избиения и функциональный эпендимных реснички 5,6, который, в свою очередь сыграть решающую роль в регулировании направленное движение нервных клеток и клеточной миграции 7 Шток. В качестве такого, ненормального эпендимных функции ресничек или структуры может привести к ненормальной потока CSF, который связан с гидроцефалией, медицинское состояние, в котором есть ненормальное накопление спинномозговой жидкости в желудочках бдождь. Это может привести к увеличению, следовательно, внутричерепное давление и прогрессивное увеличение головы, судороги, туннельное зрение, и психической инвалидности 8.
Преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, что она позволила впервые через три различных видов клеток: эпендимных I, II, III и, в зависимости от их уникальной частоте мерцательная избиения и угол бить. Эти клетки эпендимные локализованы в отдельных регионах в желудочки головного мозга. Кроме того, эффекты возраста и фармакологических агентов, таких как алкоголь и цилостазола на изменении эпендимных типов клеток или их локализации может быть продемонстрировано, что было невозможно ранее этой классификации эпендимных клеток. Cilostazol является ингибитором фосфодиэстеразы-3, фермент, который усваивает цАМФ в АМФ, и это также регулирует внутриклеточный кальций 9. Использование высокоскоростной анализ флуоресценции позволяет визуализации и количественной оценки уникального внутриклеточногоколебаний кальция свойства эпендимных клеток. Например, как алкоголь и цилостазол значительно изменили эпендимных частоту цилиарного биение, а также внутриклеточные свойства колебаний кальция, который, в свою очередь, может привести к изменению в цереброспинальной жидкости замещения объема по эпендимных ресничек 10. В целом, этот метод является ключевым, чтобы обеспечить первое доказательство трех различных типов клеток эпендимных с различными свойствами колебаний кальция.
В следующем разделе, детальное шаг за шагом обзор процедуры обеспечивается, обращая особое внимание на подготовку ткани и обработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры для использования животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета Толедо в в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Институциональная в Национальных институтах здравоохранения и Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Мозг Добыча, Секционирование и тканей Подготовка
- Жертвоприношение штамма дикого типа мыши C57BL / 6 с глубоко эвтаназии с СО 2 удушья в течение 5 мин. Убедитесь, смерть путем смещения шейных позвонков.
- Почистите головку мыши с 70% этанола.
- Выполните удаление фрагментов костей черепа, используя стерильные ножницы и пинцет, сначала потянув шкуру, начиная с верхней части головы, чтобы выставить череп.
- Затем, когда череп подвергается, удалить череп пилинг костный фрагмент-на-кусок, начиная с задней стороны и движется в сторону передней стороны. Будьте осторожны, чтобы не разрушить желудочки мозга.
- Соберите весь мозг.
- Поместите мозг в 100 мм чашки Петри, содержащей DMEM / High-глюкоза с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствор пенициллина / стрептомицина, содержащий 10000 ед / мл пенициллина и 10000 мкг / мл стрептомицина и подогретого до 37 ° С.
- Нарежьте мозг на средней сагиттальной плоскости вручную с острым лезвием, и получить первый 100-200 мм раздел из каждой половины, используя vibratome.
- Промойте ткань мозга с подогретого С фосфатным буферным раствором (PBS) 1x решения 37 °.
- Сразу же место в разделе мозга в DMEM / высокого Глюкоза СМИ предварительно нагревают до 37 ° С.
2. Живая съемка Конфигурация и настройка
- Поместите срезы ткани головного мозга в 30 мм с прозрачным дном культуры блюд, содержащих 1 мл DMEM / высоких-Глюкоза СМИ. Регулировка закрытой камере среду микроскопа до 37 ° С, 95% / 5% О2 / СО2 контента (фиг.1
- Использование 60X объективное масло погружения линзы, собирать эпендимные клеток / реснички изображения, поместив сначала капли масла на 60X объектива и фокусировка на клетках с регулярной ДВС передается свет.
- Затем выполните направление движения DMEM пузыря в качестве ориентира для расположения подвижных ресничек, как эпендимных цилиарные избиения создать своего рода движения пузырьков в области. Выберите область, содержащую здоровые клетки с подвижных ресничек в боковой желудочек мозга с помощью фильтра ДВС. После эпендимных реснички найдено, отрегулировать свет и фокус, чтобы получить удовлетворительное изображение.
- Установите живые параметры изображения в соответствии с конкретной целью, используя программное обеспечение обработки изображений Metamorph. В настоящее демонстрации, приобрести двадцать четыре-битных изображений с камеры биннинга набора 1 х 1 в сочетании с объективным и 60X 5-10 мс время экспозиции.
- Сбор изображений ДИК, открыв отверстие микроскопа до оптимального уровня, чтобы иметь минимальную ехрosure время. Соблюдайте живые изображения потока в камере, чтобы обеспечить быстрый и непосредственный получения изображения без задержки. Рассчитать скорость ресничек избиения на основе требований минимальных времени экспозиции, чтобы получить достаточную контрастность изображения.
3. Визуализация и анализ данных
- Рассчитать количество ресничек побоев путем подсчета количества побоев в 1 мин. Сделайте это путем уменьшения скорости видео и подсчета количества ударов, используя счетчик клеток или подобный инструмент.
- Для расчета частоты избиения, умножьте время экспозиции, при котором видео, записанного числа кадров или покадровой изображений, полученных, чтобы получить количество секунд. (Пример: время экспозиции 5 мс 200 кадров = 1000 мс или 1 сек).
- Рассчитать количество избиений в одну секунду, чтобы получить частоту, которая выражается как число биений на одну секунду. Сделайте это путем деления числа ресничек избиения в течение одного-второго времени междуВал (Пример: реснички бьет 50 раз в 200 кадров при записи видео во время экспозиции 5 мс т.е. 5 мс х 200 кадров = 1 сек, а теперь делят 50 ударов на 1 сек = 50 Гц).
- Рассчитать угол мерцательная избиение вычисления пути, принятое эпендимных ресничек во время обоих силовых и восстановительных ударов. Выполнение этого в соответствии с описанным ранее способом, с незначительными изменениями 11. Точное движение индивидуального ресничек наблюдается в течение всего цикла биений.
- На ацетата листом, помещенным на мониторе, провести горизонтальную линию вдоль края эпендимных и вертикальной линии, проходящей через срединном положении ресничек в начале рабочего хода.
- Участок точное положение реснички кадр за кадром, как она движется вперед во время рабочего хода. Аналогичным образом, участок движения ресничек в течение обратного хода.
- Рассчитать угол мерцательная избиение от максимального отклонения реснички от средней линии во время тон рабочий ход, а также ход восстановления.
4. Кальций сигнал Запись
- После нарезки мозг, кратко промыть срез мозга с 1x PBS или PBS Дульбекко (рН 7,0). Подготовьте свежий Fluo-2, чтобы избежать тушение флуоресценции и получить хорошее соотношение сигнал-шум.
- Готовят 1 мМ исходный раствор Fluo-2 раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО), перемешивают и вихрь решение, по крайней мере, 5 мин, чтобы обеспечить Fluo-2 однородно растворяли в ДМСО.
- Развести Fluo-2 маточного раствора в 500 мл DMEM / High-глюкозы, дополненной 2% B27 подогретого до 37 ° С до конечной концентрации 20 мг / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: В-27 оптимизирован бессывороточная добавка, содержащая витамин А, антиоксидантным коктейлем и инсулина, используемого для поддержки кратко- или долгосрочной жизнеспособности гиппокампа и других нейронов ЦНС. - Сразу инкубировать срез мозга с 20 мг / мл Fluo-2 в течение 30 мин при 37 ° С в стеклянным дном пластины.
- Для определения оптимальной концентрации нагрузки флуорофорных кальция Fluo-2 и чтобы избежать токсичности клеток красителя кальция, вызов клетки с АТФ и проверить жизнеспособность клеток путем определения времени курс и пик величины сигналов кальция в ответ на АТФ.
- Запись видео для колебаний кальция со скоростью захвата 5 мс в течение минимум 1 сек (200 кадров в секунду), с возбуждения и излучения длиной волны 488 нм и 515 нм, соответственно (Movie 2).
- Чтобы отличить Fluo-2 сигнал кальция автофлюоресценции или движения артефактов, убедитесь, что интенсивности, испускаемые при 515 нм контролируется отдельно.
Примечание: Fluo-2 не fluoremetric кальция пригодны для количественного внутриклеточный кальций. Тем не менее, это отличный краситель динамического кальция для обнаружения быстрой смены кальция, такие как кальций колебаний. Для более точного количественного кальция, Фура-2 рекомендуется. Тем не менее, динамические изменения Фура-2 ограничены его ЛогометрическийХарактер красителя. - Следуйте формулы, предусмотренные заводом-изготовителем для расчета точных бесплатно внутриклеточные значения кальция. Пример [Са 2+] = К д × (R - R мин) / (R макс - R). Где К д является константа диссоциации красителя от выпущенного кальция, R является измеренное флуоресценции при 488 и R мин и макс R являются отношения флуоресценции при минимальной и максимальной концентрации ионов 12.
5. Иммунофлуоресценции микроскопия
- Исправление срезах головного мозга с фосфатным буферным солевым раствором, содержащим 4% параформальдегида (PFA) и 2% сахарозы в течение 10 мин. Кроме того, исправить весь мозг с 4% PFA, а затем раздел в 50 мм секции, используя криостат.
- Промыть ткань три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
- Выдержите кусочек мозга с Solutiна 0,1% Triton-X в 1x PBS в течение 5 мин, затем промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
- Инкубируйте срез мозга мыши с первичным антителом, antiacetylated в-тубулина, используемый в разведении 1: 5000 в 10% FBS в 1x PBS в течение одного часа при комнатной температуре (RT) или в течение ночи при 4 ° С.
- Промыть ткань три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
- Инкубируйте срез мозга в вторичными антителами, анти-флуоресцеин мыши IgG в разведении 1: 500 в 10% FBS в 1X PBS растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Перед наблюдения под флуоресцентным микроскопом, контрастное секции с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин, чтобы окрасить ядро (или ДНК) 13. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания, изображение разделы сразу с минимальным временем возможного воздействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Измерение эпендимных функцию ресничек в живом мозге мыши
Метод, описанный в этом протоколе используется для мониторинга эпендимных функцию ресничек и структуру в свежей ткани расчлененный от мозга мыши, а также для мониторинга и изучения реснички частоту биений. Выполняемые для достижения полного эксперимент изображены в схематическом блок-схемы (рис 1). Настоятельно рекомендуется, что эксперимент проводится в течение короткого времени для того, чтобы сохранить подвижные реснички так активно, как это возможно. Представитель покадровой фильм, и образы эпендимных клеток и их подвижных ресничек также показаны (Фильм 1 и 2а). Анализ данных, полученных в потоке осуществляется путем подсчета избиение и угол шаблон движущегося ресничек. Критерии деления реснички на три типа представлены в таблице 1. Наличие эпендимных ресничек Confirmed с мерцательной маркера, ацетилированный-в-тубулина, и эпендимные клетки контрастно с DAPI (ДНК-маркера), чтобы показать, ядро (фиг.2В). Основываясь на наших наблюдениях эпендимных клеток в головном мозге бокового желудочка по меньшей мере из 22 независимых экспериментов, мы были способны классифицировать эпендимных клетки в трех типов в зависимости от их частоты мерцательная биений. Кроме того, мы показали, что этанол в концентрации 0,25% существенно подавляется частоту реснички избиение независимо от их типа (рисунок 3). Более того, эти данные находятся в консистенции с нашими предыдущими выводами 10.
Измерение сигналов кальция в эпендимных ресничек
Ранее было показано, что изгиб ресничек может вызвать ресничку-зависимой внутриклеточный кальций сигнализации 14-16. Этот метод позволяет исследователям изучить и измерить внутриклеточный сигнал кальция внутри желудочков головного мозга
Рисунок 1:. Эпендимных блок-схема протокола визуализации реснички протокол изображения эпендимных реснички иллюстрирует шаги для завершения эксперимента, начиная с мыши brainextraction, секционирования и приготовления ткани для приобретения и анализа изображений. Приблизительная один час шкала представлены шаг за шагом процедуры.
е 2 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Рисунок 2:. Эпендимных локализации реснички в желудочках головного мозга Здесь показаны эпендимные клетки из бокового желудочка головного мозга мыши. () DIC изображения отдельных клеток (эпендимных нижние стрелки) и ресничек (топ стрелки) показаны. (Б) наложение изображений секции мозга окрашивали антителами против маркера мерцательной, ацетилированный а-тубулина, изображена зеленым цветом (топ стрелками), и контрастно с ядерным маркером / ДНК, DAPI, показанном на синий (нижней стрелки) , Пожалуйста, обратите внимание, что панели и б представляют различные разделы мозга.
Рисунок 3:. Спирт и различия в ресничек бьют частоты среди видов эпендимных клеток мозга мыши бокового желудочка мозга исключая виво срез инкубируют без (контроль) или (Ethanol) 0,25% спирта в течение 5 мин. По сравнению с контролем, лечение алкоголя значительно уменьшилось реснички частоту биений, как указано звездочкой. По крайней мере, 5-10 независимые препараты были использованы для каждой эпендимных типа и лечение клеток группы.
Фильм 1: Запись эпендимных ресничек в III типа эпендимных клеток Здесь показаны записи эпендимных ресничек, характеризующихся избиение частоту и угол уникальный ввести III эпендимных клетки от третьего желудочка мозга.. Эта цифра уже сообщалось ранее 10 и был повторно с разрешения.
Фильм 2: внутриклеточная колебаний кальция в клетках эпендимных Здесь показаны записи кальция колебаний эпендимных клеток через раздел боковой ве мозга.tricle после инкубации срез мозга с 20 мг / мл индикатора кальция, Fluo-2, в течение 30 мин при 37 ° С. Уровень кальция в разделе мозга изучалась и псевдо-цветной. Цветная полоса указывает уровень кальция эпендимных клеток; где черным по-фиолетовый и красно-желтый представляют низкие и высокие уровни кальция, соответственно. Для внутриклеточного кальция количественного, эпендимных кальция клеток будет рассчитываться из нескольких отдельных эпендимных клеток, как указано в тексте протокола и в среднем от контроля и лечения групп. Видео колебаний кальция был записан в 200 кадров в секунду с возбуждения и излучения длиной волны 488 нм и 515 нм, соответственно. Эта цифра уже сообщалось ранее 10 и был повторно с разрешения.
| Эпендимных тип клеток | Реснички частота биения | Реснички угол избиение |
| Тип I | > 60 Гц | <90 ° |
| Тип II | 30-60 Гц | 90-135 ° |
| Тип III | <30 Гц | > 135 ° |
Таблица 1:. Виды эпендимных ресничек классификация эпендимных ресничек в тип I, II или III был основан в первую очередь на частоте избиения и угол эпендимных ресничек, расположенного в различных регионах третьего желудочка мозга биться. Части этих данных были ранее сообщалось и были повторно здесь с разрешения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол для подготовки ткани мозга мыши, как для живого изображения и флуоресцентной микроскопии, который обеспечивает быстрый и чувствительный тщательное наблюдение за эпендимных ресничек в желудочки головного мозга. Этот метод не ограничивается только бокового желудочка; он может быть использован для наблюдения за реснички в других желудочков головного мозга. Этот метод визуализации обеспечивает живой поток, который напоминает движение ресничек CSF по избиению в обстановке экс естественных условиях. Кроме того, это дает возможность анализа направленного движения ресничек. Это, главным образом, облегчается использованием высоким разрешением DIC и системы визуализации флуоресценции. Преимущество этой системы в том, что микроскоп заключена в климатической камере, что позволяет тонкой регуляции температуры, влажности и CO 2 уровнях. Это очень важные параметры, которые должны быть рассмотрены для выживания клеток и тканей при выполнении живой Exper изображенийпериментов. Система также оснащена автоматическим XY и Z модулей, а также цифровой камеры и длина волны фильтра коммутатора, все из которых являются важными особенностями, чтобы облегчить визуализацию динамических клеточных поведения, такие как движения ресничек. Микроскоп подключается к компьютеру и получение изображений высокого качества способствует визуализации программного обеспечения.
Используя эту технику, чтобы классифицировать эпендимных клеток в различных типах предлагает значительный прогресс по сравнению с существующими / предыдущих методов, используемых для изучения эпендимных реснички. Например, действие некоторых фармакологических или токсических агентов, таких как алкоголь может быть минимизировано или иначе устраненной, если эпендимные клетки считаются одной популяции 17. Важно иметь в виду, что, несмотря на то, что характеристики ресничек избиение частот и углов отличается среди этих трех типов эпендимных ресничек, мы только начали понимать физиологию этих клеток. Следовательно, В соответствии с нашей предыдущей работе, наша классификация достаточно прочный, если процедура проводится должным образом, как описано в данном протоколе.
Определение явное эпендимных реснички принципиально важно, чтобы получить общее представление о эпендимных физиологии. Этот метод дает возможность провести различие между тремя различными типами клеток эпендимных однозначно и определенно, размещенных внутри третьего желудочка в отношении частоты размола и угла, что приводит к классификации на три различных типа (таблица 1). Для того, чтобы подтвердить, что различия в ресничками избиения частоты не из-за различий в жизнеспособности клеток эпендимных или различий в возрасте животного, рекомендуется только неповрежденные и неотделимых эпендимные полоски или ломтики, которые прикреплены к нервной ткани и в используются толстые не менее 100 мм. Кроме того, мерцательная частота биения должна измеряться в разных местах вдоль каждой эпендимных разделе, Ранее мы уже показали, что частота биений мерцательная данные, полученные с помощью этой методики была последовательно воспроизводимые среди 87 экспериментальных наблюдений 10. Следовательно, эпендимные клетки точно классифицируются в зависимости от их ресничного избиения. Кроме того, при использовании фармакологических агентов, которые, как известно, уменьшить частоту цилиарного биение, частота ресничек биение теоретически должна возвращать к нормальной частоте размола после удаления этих фармакологических агентов.
Важным шагом в этом протоколе, в основном, связанных с использованием ткани мозга и время, необходимое для завершения эксперимента. Крайне важно, чтобы обрабатывать ткань головного мозга осторожно, чтобы сохранить структуру и функцию эпендимных ресничек, а также для уменьшения травмы хрупкой ткани. Более важным, и, чтобы избежать ухудшения и смерть мозговой ткани, что может быть ограничивающим фактором для успеха этой методики, это очень Рекомендовад, что шаги, связанные с этой техникой выполняются, как почти час, как это возможно. Тем не менее, это ограничение можно преодолеть в будущем с достижениями в культивирования и роста эпендимных или аналогичных типов клеток с подвижных ресничек в пробирке или с использованием альтернативной питательной СМИ. Использование альтернативных питательных сред, таких как ACSF и солей Эрла для инкубации срезов головного мозга была продемонстрирована в литературе 5. Тем не менее, в наших руках, использование DMEM / High-глюкозы было более выгодным, чем ACSF возможно из-за наличия большого количества глюкозы (4,500 мг / мл) в среде в качестве потенциального источника энергии. Таким образом, главным критерием используется для оценки жизнеспособности ткани и, следовательно, действия подхода является оценка ресничек избиения, так как это представитель признаком живых клеток.
Живая съемка эпендимных ресничек предлагает мощный инструмент для анализа вниз по течению сигнальных путей активации ресничектаких как кальциевой сигнализации и колебаний. Например, при использовании живой флуоресценции, было продемонстрировано, что независимо от типа клеток эпендимных / ресничек, эпендимные клетки характеризуются уникальными свойствами кальция колебаний 10. В целом, этот протокол имеет отношение к так фундаментальных научных знаний и клинической практике. С точки зрения основной науки, этот метод предлагает оценку функциональных и физиологических ролей эпендимных структуры ресничек, функции и вниз по течению механистической сигнальных путей. С точки зрения клинической практики, этот метод является весьма актуальным для поиска лекарственных средств, предназначенных эпендимных реснички как новый терапевтической мишени для неврологических расстройств, таких, как злоупотребление алкоголем и гидроцефалия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
