Summary
El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.
Abstract
Células ependimarias Multiciliated alinean los ventrículos en el cerebro adulto. Función o estructura de los cilios ependymal anormal se asocia con diversos déficits neurológicos. La corriente de imágenes ex vivo en directo de la técnica de los cilios ependymal móviles permite un estudio detallado de la dinámica ciliares siguiendo varios pasos. Estos pasos incluyen: ratones eutanasia con dióxido de carbono de acuerdo con los protocolos de la Universidad de Animal Care Institucional de Toledo y el empleo Comisión (IACUC); craniectomía seguido de la eliminación del cerebro y la disección del cerebro sagital con un vibratome o cuchilla afilada para obtener secciones muy finas a través de los ventrículos laterales del cerebro, donde los cilios ependymal puede ser visualizado. La incubación de las rebanadas del cerebro en un plato con fondo de cristal personalizado que contiene medio de Eagle modificado (DMEM) / alta glucosa de Dulbecco a 37 ° C en presencia de 95% / 5% O 2 / CO mezcla 2 es esencial para mantener vivo el tejido duranteel experimento. Un video de la paliza cilios se registra a continuación, utilizando una alta resolución de microscopio de contraste de interferencia diferencial. El vídeo se analiza a continuación, cuadro por cuadro para calcular la frecuencia de latido ciliar. Esto permite distinta clasificación de las células ependimarias en tres categorías o tipos en función de su frecuencia de latido ciliar y el ángulo. Además, esta técnica permite el uso de análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad para caracterizar las propiedades únicas intracelulares de oscilación de calcio de células ependimarias, así como el efecto de agentes farmacológicos en las oscilaciones de calcio y la frecuencia de latido ciliar. Además, esta técnica es adecuada para formación de imágenes de inmunofluorescencia para la estructura ciliar y ciliar proteína de localización de estudios. Esto es particularmente importante en los estudios de diagnóstico de enfermedades y fenotipo. La principal limitación de la técnica se atribuye a la disminución en el movimiento cilios móviles en vivo como el tejido cerebral comienza a morir.
Introduction
Los cilios son orgánulos basado-microtúbulos sensoriales que se extienden desde la superficie de la célula con el medio ambiente extracelular. Dependiendo de su nivel de organización de los microtúbulos, los cilios se pueden clasificar en dos tipos - "9 + 0" o "9 + 2". Funcionalmente, en base a su motilidad, éstos pueden ser clasificados como móviles o no móviles cilios 1. Cilios primaria es un término comúnmente utilizado para referirse a "9 + 0" cilios no móviles. Estos tienen nueve microtúbulos doblete paralelas (denotados por '9') y un par central de microtúbulos está ausente dentro de la vaina central (denotado por '0'). Sin embargo, algunos "9 + 0" cilios, como cilios nodales, que regulan la lateralidad embrionaria son móviles 2. Por otro lado, cilios móviles se caracterizan, además de los nueve dobletes de microtúbulos paralelos, por un par central adicional de dobletes de microtúbulos y se asocia con proteínas motoras dineína para facilitar la motilidad. Además, algunos "92 "cilios como cilios olfativos son no móviles 3. Las células ependimarias que recubren los ventrículos cerebrales y el canal central de la médula espinal se caracterizan por cilios móviles que propulsar el líquido cefalorraquídeo (LCR) a lo largo de los ventrículos cerebrales 4.
El objetivo general de este método es el de facilitar el estudio de la dinámica de los cilios móviles y anormalidades estructurales. La salud y el desarrollo del cerebro en gran medida dependen de la circulación eficiente de LCR dentro de los ventrículos cerebrales. Por ejemplo, el flujo de LCR normal y el equilibrio de líquidos requieren latido normal y cilios ependymal funcional 5,6, que a su vez juega un papel crítico en la regulación del movimiento direccional de las células neuronales y la migración de células madre 7. Como tal, la función de los cilios ependymal anormal o estructura puede conducir a flujo del LCR anormal, que se asocia con la hidrocefalia, una condición médica en la que hay una acumulación anormal de LCR en los ventrículos del blluvia. En consecuencia, esto puede causar un aumento de la presión intracraneal y la ampliación progresiva de la cabeza, convulsiones, visión de túnel, y la discapacidad mental 8.
Las ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes es que se permitió por primera vez a reportar tres distintos tipos de células ependimarias: I, II, y III, en función de su única frecuencia de golpeo ciliar y golpeando ángulo. Estas células ependimarias se localizan dentro de ciertas regiones de los ventrículos cerebrales. Además, los efectos de la edad y agentes farmacológicos tales como alcohol y cilostazol en la modificación de los tipos de células ependimarias o sus localizaciones se pueden demostrar, que no era posible antes de esta clasificación de células ependimarias. Cilostazol es un inhibidor de la fosfodiesterasa-3, una enzima que metaboliza cAMP a AMP y también regula el calcio intracelular 9. Utilizando el análisis de imágenes de fluorescencia de alta velocidad permite obtener imágenes y cuantificación de la intracelular únicopropiedades de oscilación de calcio de las células ependimarias. Por ejemplo, tanto el alcohol y el cilostazol alteraron significativamente la frecuencia de golpeo ciliar ependimarias, así como las oscilaciones de calcio intracelulares propiedades, que a su vez, podría conducir a un cambio en la reposición de volumen de líquido cefalorraquídeo por cilios ependymal 10. En resumen, esta técnica fue clave para proporcionar la primera evidencia de tres tipos distintos de células ependimarias con diferentes propiedades de oscilación de calcio.
En la siguiente sección, se proporciona una visión detallada paso a paso del procedimiento, prestando especial atención a la preparación y manipulación de tejidos.
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Protocol
Los procedimientos para el uso de los animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Toledo, de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de los Institutos Nacionales de Salud y la Guía para el Cuidado y Uso de animales de laboratorio.
1. Extracción del cerebro, Seccionamiento y Tejidos Preparación
- Sacrificio de tipo salvaje cepa de ratón C57BL / 6 por profundamente eutanasia con CO2 asfixia durante 5 min. Asegurar la muerte por dislocación cervical.
- Limpie el cabezal de ratón con etanol al 70%.
- Realizar craniectomía usando tijeras y pinzas estériles por primera tira de la piel de, a partir de la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
- Entonces, cuando se expone el cráneo, retire el cráneo por el pelado de la pieza por pieza de hueso, comenzando desde el lado posterior y en movimiento hacia el lado anterior. Tenga cuidado de no destruir los ventrículos cerebrales.
- Recoge todo el cerebro.
- Coloque el cerebro en un plato de 100 mm de Petri que contiene DMEM / de alta glucosa suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina / estreptomicina 1% que contiene 10.000 unidades / ml de penicilina y 10.000 g / ml de estreptomicina y pre-calentado a 37 ° C.
- Cortar el cerebro en el plano sagital mediano a mano con una cuchilla afilada, y obtener la primera sección de 100-200 mm de cada medio usando un vibratome.
- Enjuague el tejido cerebral con C salina tamponada con fosfato (PBS 1x) solución de 37 ° pre-calentado.
- Coloque inmediatamente la sección del cerebro en DMEM / media-alta de la glucosa pre-calentado a 37 ° C.
2. Vivo Configuración de imagen y configuración
- Coloque las secciones de tejidos cerebrales en 30 mm placas de cultivo con fondo de cristal que contienen 1 ml de DMEM / medios-altos de glucosa. Ajustar entorno de cámara cerrada del microscopio a 37 ° C, 95% / 5% O 2 / CO contenido de 2 (Figura 1
- El uso de un lente objetivo de inmersión en aceite 60X, recoger las células ependimarias / imágenes cilios colocando primero una gota de aceite en la lente objetivo de 60X y se centra en las células con DIC regularmente transmiten luz.
- A continuación, siga la dirección del movimiento de la burbuja DMEM como una guía para la ubicación de los cilios ependymal móviles como golpes ciliares crear una especie de movimiento de la burbuja en la zona. Elija un área que contiene las células sanas con cilios móviles en el ventrículo lateral del cerebro utilizando el filtro DIC. Una vez que los cilios ependymal se encuentran, ajustar la luz y el enfoque para obtener una imagen satisfactoria.
- Establezca los parámetros de imagen en vivo de acuerdo con un propósito específico utilizando el software de imágenes Metamorph. En la presente manifestación, adquirir veinte imágenes de cuatro bits con el conjunto de intervalos cámara a 1 x 1 en combinación con 60X objetiva y tiempo de exposición 5/10 ms.
- Recoge las imágenes DIC abriendo la abertura microscopio para un nivel óptimo con el fin de tener un mínimo de exptiempo osure. Observar las imágenes en directo corriente a la cámara para proporcionar la adquisición de imágenes rápido e inmediato sin demora. Calcular la velocidad de latido cilios basado en el requisito de los tiempos de exposición mínimos para obtener suficiente contraste de la imagen.
3. Visualización y análisis de datos
- Calcular el número de golpes cilios contando el número de golpes en 1 min. Para ello, la disminución de la velocidad del vídeo y contando el número de pulsaciones utilizando un contador de células o una herramienta similar.
- Para calcular la frecuencia de las palizas, multiplique el tiempo de exposición a la que el vídeo se graba por el número de los marcos o imágenes en tiempo lapso adquiridos para obtener el número de segundos. (Ejemplo: tiempo de exposición 5 ms 200 marcos = 1000 ms o 1 segundo).
- Calcular el número de golpes en un segundo para obtener la frecuencia que se expresa como el número de golpes por uno sec. Para ello, dividiendo el número de golpes cilios más de un segundo entre el tiempoval (Ejemplo: cilios late 50 veces en un video de 200 marcos grabado en tiempo de exposición de 5 ms es decir 5 ms x 200 fotogramas = 1 seg; ahora dividir 50 latidos por 1 seg = 50 Hz).
- Calcular el ángulo de golpeo ciliar mediante la evaluación del camino recorrido por los cilios ependymal durante tanto las carreras de trabajo y recuperación. Realice esto de acuerdo con un método descrito previamente, con modificaciones menores 11. Se observa el movimiento preciso de los cilios individuo durante el ciclo de latido completo.
- En una hoja de acetato colocado sobre el monitor, dibujar una línea horizontal a lo largo del borde ependimarias y una línea vertical a través de la posición de la línea media de los cilios en el inicio de la carrera de potencia.
- Trazar la posición precisa de la trama cilio por trama a medida que se mueve hacia adelante durante la carrera de potencia. De una manera similar, trazar el movimiento de los cilios durante la carrera de recuperación.
- Calcular el ángulo de golpeo ciliar de la desviación máxima del cilio de la línea media durante tél carrera de potencia, así como la carrera de recuperación.
4. El calcio de grabación de la señal
- Después de cortar el cerebro, enjuagar brevemente el corte de cerebro con 1x PBS o PBS de Dulbecco (pH 7,0). Preparar fresco Fluo-2 para evitar la extinción de la fluorescencia y para obtener una buena relación señal-ruido.
- Preparar 1 mM solución madre de Fluo-2 solución en dimetilsulfóxido (DMSO), mezclar y agitar la solución durante al menos 5 min para asegurar que Fluo-2 se disuelve homogéneamente en DMSO.
- Diluir la solución madre de Fluo-2 en 500 ml de DMEM / de alta glucosa suplementado con 2% B27 pre-calentado a 37 ° C a una concentración final de 20 mg / ml.
NOTA: B-27 es un suplemento libre de suero optimizado que contiene vitamina A, cóctel antioxidante y la insulina utilizada para apoyar la viabilidad a corto o largo plazo del hipocampo y otras neuronas del SNC. - Incubar inmediatamente el corte de cerebro con 20 mg / ml Fluo-2 durante 30 minutos a 37 ° C en un plato con fondo de cristal.
- Para determinar la concentración de carga óptima de fluoróforo calcio Fluo-2 y para evitar la toxicidad celular tinte de calcio, las células de desafío con el ATP, y comprobar la viabilidad celular mediante la determinación de la evolución en el tiempo y la magnitud máxima de señales de calcio en respuesta a ATP.
- Grabar el vídeo para la oscilación de calcio a una velocidad de captura de 5 mseg durante un mínimo de 1 seg (200 fotogramas por segundo), con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 515 nm, respectivamente (Película 2).
- Para distinguir la señal de calcio Fluo-2 de autofluorescencia o artefactos de movimiento, asegúrese de que las intensidades emitidas a 515 nm se controla por separado.
NOTA: Fluo-2 no es el fluoremetric calcio adecuado para cuantificar el calcio intracelular. Sin embargo, es un excelente tinte de calcio dinámica para detectar cambios rápidos de calcio, tales como oscilaciones de calcio. Para la cuantificación de calcio más precisa, se recomienda Fura-2. Sin embargo, los cambios dinámicos de Fura-2 están limitados por su radiométricala naturaleza del colorante. - Siga las fórmulas proporcionadas por el fabricante para calcular los valores exactos de calcio intracelular libres. Ejemplo [Ca 2 +] = Kd × (R - R min) / (R max - R). Donde K d es la constante de disociación del colorante desde el calcio liberado, R es la fluorescencia medida a 488, y R y R min max son las relaciones de fluorescencia a concentración máxima de iones mínimo y 12.
5. Inmunofluorescencia Microscopía
- Fijar las secciones de cerebro con solución salina tamponada con fosfato que contiene 4% de paraformaldehído (PFA) y 2% de sacarosa durante 10 min. Alternativamente, arreglar todo el cerebro con 4% PFA sección y luego en 50 secciones mm utilizando un criostato.
- Lavar el tejido tres veces con 1x PBS durante 5 min cada vez.
- Incubar la rebanada cerebro con un solutien 0,1% de Triton-X en 1X PBS durante 5 min, luego enjuagar tres veces con 1x PBS durante 5 min cada vez.
- Incubar los cortes de cerebro con el anticuerpo primario de ratón, antiacetylated a-tubulina, utilizado a una dilución de 1: 5000 en 10% de FBS en 1x PBS durante una hora a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar el tejido tres veces con 1x PBS durante 5 min cada vez.
- Incubar la rebanada del cerebro en anticuerpo secundario, IgG anti-ratón fluoresceína a una dilución de 1: 500 en 10% de FBS en PBS 1x solución durante 1 hora a RT.
- Antes de la observación bajo un microscopio fluorescente, contratinción la sección con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min para teñir el núcleo (o ADN) 13. Para minimizar fotoblanqueo, la imagen de las secciones de inmediato con el tiempo de exposición mínimo posible.
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Representative Results
Medición de la función cilios ependymal en cerebro de ratón vivo
El método descrito en este protocolo se utiliza para controlar la función cilios ependymal y estructura en el tejido fresco diseccionado desde el cerebro del ratón, así como para vigilar y estudiar los cilios frecuencia paliza. Los pasos seguidos para llevar a cabo un experimento completo se representan en un diagrama de flujo esquemático (Figura 1). Es muy recomendable que el experimento se lleva a cabo dentro de un corto período de tiempo con el fin de mantener el cilios móviles lo más activo posible. Una película e imágenes de las células ependimarias y sus cilios móviles time-lapse representante también se muestran (Película 1 y la Figura 2a). Análisis de los datos en la corriente obtenida se logra contando el patrón de golpeo y el ángulo de los cilios en movimiento. Los criterios para dividir los cilios en tres tipos se presentan en la Tabla 1. La presencia de los cilios ependymal es confirmó con un marcador ciliar, acetilada-a-tubulina, y las células ependimarias se contratiñeron con DAPI (marcador de ADN) para mostrar el núcleo (Figura 2b). Sobre la base de nuestras observaciones de células ependimales en el cerebro ventrículo lateral de al menos 22 experimentos independientes, hemos sido capaces de clasificar las células ependimarias en tres tipos en función de su frecuencia de latido ciliar. Por otra parte, hemos demostrado que el etanol a una concentración de 0,25% reprimió significativamente la frecuencia de latidos cilios independientemente de su tipo (Figura 3). Más importante, estos datos están en consistencia con nuestros hallazgos anteriores 10.
Medición de la señalización de calcio por los cilios ependymal
Se ha demostrado previamente que la flexión de los cilios puede desencadenar un cilio calcio intracelular dependiente de señalización 14-16. Esta técnica permite a los investigadores examinar y medir la señal de calcio intracelular dentro de los ventrículos cerebrales
Figura 1:. Ependimarios diagrama de flujo del protocolo de imágenes cilios protocolo imágenes cilios ependimarios ilustra pasos para completar un experimento a partir de brainextraction ratón, el corte y preparación de tejido para la adquisición y análisis de imágenes. Una línea de tiempo aproximado de una hora ha presentado con el procedimiento paso a paso.
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Figura 2:. Localización de los cilios ependimarios en los ventrículos cerebrales Aquí se presentan las células ependimarias del ventrículo lateral del cerebro de un ratón. (A) se muestran imágenes DIC de células individuales ependimarias (flechas inferiores) y los cilios (top flechas). (B) Una imagen superpuesta de una sección del cerebro se tiñe con anticuerpo contra un marcador ciliar, acetilado a-tubulina, se muestra en verde (arriba flechas) y counterstained con un marcador nuclear / ADN, DAPI, se muestra en azul (flechas inferiores) . Tenga en cuenta que los paneles ayb representan diferentes secciones del cerebro.
Figura 3:. El alcohol y las diferencias en los cilios baten frecuencias entre tipos de células ependimarias del ventrículo lateral del cerebro de ratón La rebanada del cerebro ex vivo se incubó sin (control) o con (ETHANOL) 0,25% de alcohol durante 5 min. Comparado con el control, el tratamiento del alcohol disminuyó significativamente cilios frecuencia de golpeo, como se indica por un asterisco. Al menos 10.5 preparaciones independientes se utilizaron para cada grupo de tipo y tratamiento con células ependimarias.
Película 1: Grabación de los cilios ependymal de tipo III células ependimarias Aquí se presentan grabaciones de cilios ependymal, caracterizados por golpear a frecuencia y ángulo único de tipo III células ependimarias del tercer ventrículo del cerebro.. Esta cifra se ha informado anteriormente 10 y se reutiliza con permiso.
Película 2: oscilaciones de calcio intracelular en las células ependimarias muestra aquí son grabaciones de las oscilaciones de calcio de las células ependimarias través de una sección de ven lateral del cerebro.tricle después de la incubación de la rebanada de cerebro con 20 mg / ml indicador de calcio, Fluo-2, durante 30 min a 37 ° C. El nivel de calcio en la sección de cerebro fue estudiado y coloreado pseudo. La barra de color indica el nivel de calcio de las células ependimarias; donde-negro púrpura y rojo-amarillo representan bajos y altos niveles de calcio, respectivamente. Para la cuantificación de calcio intracelular, calcio celular ependimarias se calcula a partir de varias células ependimarias individuales, como se menciona en el texto del protocolo y un promedio entre los grupos de control y tratamiento. El vídeo de oscilación de calcio se registró a 200 fotogramas por segundo con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 515 nm, respectivamente. Esta cifra se ha informado anteriormente 10 y se reutiliza con permiso.
| Tipo de células ependimales | Los cilios frecuencia paliza | Ángulo de golpeo cilios |
| Tipo I | > 60 Hz | <90 ° |
| Tipo II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Tipo III | <30 Hz | > 135 ° |
Tabla 1:. Tipos de cilios ependymal La clasificación de los cilios ependymal en tipo I, II o III se basó principalmente en la frecuencia de latidos y golpeando ángulo de cilios ependymal ubicada dentro de las regiones distintas del tercer ventrículo del cerebro. Partes de estos datos se ha informado anteriormente y fueron reutilizados aquí con permiso.
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Discussion
Describe aquí es un protocolo para la preparación de tejido cerebral de ratón tanto para formación de imágenes en vivo y microscopía de fluorescencia que proporciona una rápida y sensible estrecha observación de los cilios ependymal dentro de los ventrículos cerebrales. Esta técnica no se limita a sólo el ventrículo lateral; que podría ser utilizado para observar los cilios en otros ventrículos cerebrales. Esta técnica de imagen proporciona una transmisión en vivo que se asemeja el movimiento del LCR por paliza ciliar en un entorno ex vivo. Por otra parte, permite el análisis del movimiento direccional de los cilios. Esto se ve facilitado principalmente por el uso de una alta resolución DIC y sistema de imágenes de fluorescencia. Una ventaja de este sistema es que el microscopio está encerrado en una cámara ambiental, lo que permite una regulación fina de la temperatura, la humedad y CO 2 niveles. Estos son parámetros muy importantes que deben ser considerados para la supervivencia de las células y los tejidos al realizar exper imágenes en vivoiments. El sistema también está equipado con módulos de XY y Z automático, así como un selector de longitud de onda de la cámara y filtro digital, todos los cuales son características importantes para facilitar la obtención de imágenes de comportamientos celulares dinámicos como los movimientos de los cilios. El microscopio está conectado a un ordenador y la adquisición de imágenes de alta calidad se ve facilitada por la formación de imágenes de software.
Usando esta técnica para clasificar células ependimarias en tipos distintos ofrece un avance significativo respecto a los métodos existentes / anteriores utilizados para estudiar los cilios ependimarias. Por ejemplo, el efecto de ciertos agentes farmacológicos o tóxicos como el alcohol podría ser minimizado o anulado si las células ependimarias son considerados como una población 17 lo contrario. Es importante tener en cuenta que, a pesar del hecho de que las características de los cilios baten frecuencias y ángulos son muy diferentes entre estos tres tipos de cilios ependymal, sólo hemos empezado a entender la fisiología de estas células. Por lo tanto, De acuerdo con nuestro anterior trabajo, nuestra clasificación es lo suficientemente robusta como si el procedimiento se realiza correctamente, como se describe en este protocolo.
La identificación de los cilios ependymal distinta es fundamental para obtener una comprensión básica de la fisiología ependimarias. Este método hace que sea posible distinguir entre tres tipos distintos de células ependimarias única y específicamente posicionado dentro del tercer ventrículo en lo que respecta a la frecuencia de latido y el ángulo, dando lugar a la clasificación en tres tipos diferentes (Tabla 1). Con el fin de confirmar que las diferencias en los cilios baten frecuencias no se deben a diferencias en la viabilidad de las células ependimarias o a diferencias en la edad del animal, se recomienda que las tiras ependimarias solamente intactas y no separadas o rodajas que se adjuntan a tejido neuronal y en Se utilizan por lo menos 100 mm de espesor. Por otra parte, la frecuencia ciliar paliza debe medirse en diferentes lugares a lo largo de cada sección ependimaria. Hemos demostrado anteriormente que los datos de frecuencia de batido ciliar generados usando esta técnica ha sido consistentemente reproducible entre 87 observaciones experimentales 10. Por lo tanto, las células ependimarias se clasifican con precisión en función de su movimiento ciliar. Por otra parte, cuando el uso de agentes farmacológicos que son conocidos por disminuir la frecuencia de latido ciliar, la frecuencia de latido cilios debería teóricamente volver a latir frecuencia normal después de la eliminación de esos agentes farmacológicos.
Un paso crítico en este protocolo se relaciona principalmente con el manejo del tejido cerebral y el tiempo necesario para completar el experimento. Es imperativo para manejar el tejido cerebral suavemente a fin de preservar la estructura y función de los cilios ependymal así como para reducir el trauma al tejido frágil. Más importante, y para evitar el deterioro y la muerte del tejido cerebral, lo que podría ser un factor limitante para el éxito de esta técnica, es altamente recommended que los pasos relacionados con esta técnica se llevan a cabo en tan cerca a una hora como sea posible. Sin embargo, esta limitación podría superarse en el futuro con los avances en el cultivo y crecimiento ependimarias o tipos de células similares con cilios móviles in vitro o con el uso de medios de comunicación nutritiva alternativa. El uso de medios nutritivos alternativos tales como LCRa y sales de Earle para la incubación de los cortes de cerebro se ha demostrado en la literatura 5. Sin embargo, en nuestras manos, el uso de DMEM / de alta glucosa fue más beneficioso que LCRa posiblemente debido a la presencia de gran cantidad de glucosa (4.500 mg / ml) en el medio como una fuente de energía potencial. Por lo tanto, el principal criterio utilizado para evaluar la viabilidad del tejido y por lo tanto la validez del enfoque está evaluando golpes cilios, ya que esto es una señal representativa de células vivas.
Imágenes en vivo de los cilios ependymal ofrece una poderosa herramienta para analizar las vías de señalización corriente abajo de la activación de los ciliostales como la señalización de calcio y oscilaciones. Por ejemplo, el uso de imágenes de fluorescencia en vivo, se ha demostrado que, independientemente del tipo de células / cilios ependimarias, células ependimarias se caracterizan por propiedades de oscilación único de calcio 10. Con todo, este protocolo es relevante tanto para el conocimiento científico básico y la práctica clínica. Desde la perspectiva de la ciencia básica, esta técnica ofrece una evaluación de los roles funcionales y fisiológicos de la estructura de los cilios ependymal, función y vías de señalización mecanicistas aguas abajo. Desde la perspectiva de la práctica clínica, este método es de gran importancia para la búsqueda de fármacos que se dirigen a los cilios ependimarias como una nueva diana terapéutica para los trastornos neurológicos como la hidrocefalia y el abuso del alcohol.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
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