Summary
Yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak, fare beyin ventriküller içinde yer alan hareketli ependim kirpikler dayak bir ex vivo gözlem canlı görüntüleme ile gösterilmiştir. teknik, özel bir siliyer atan frekansının kayıt ve dayak açısı aynı zamanda bunların hücre içi kalsiyum salınım ilerleme hızı özellikleri sağlar.
Abstract
Multiciliated ependimal hücreler erişkin beyninde ventrikül sıralanıyor. Anormal işlevi veya ependim kirpikler yapısı çeşitli nörolojik defisitler ile ilişkilidir. hareketli ependim kirpikler tekniğinin ex vivo canlı görüntüleme mevcut birkaç adım takip siliyer dinamikleri ayrıntılı çalışma için izin verir. Bu adımlar şunlardır: farelere karbon dioksid ile ötenazi Toledo Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Üniversitesi protokollerine göre; bir vibratome veya keskin bıçak ile beyin kaldırma ve sagital beyin diseksiyonu ardından kraniektominin ependim kirpikler görüntülenmiştir beyin lateral ventriküller, üzerinden çok ince kesitler elde etmek. % 95 /% 5 O mevcudiyetinde 2 / CO2 karışımı, 37 ° C'de Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) / Yüksek glikoz içeren özel bir cam alt plaka beynin dilimlerin Kuluçka canlı doku tutmak esastır sırasındadeney. Kirpikler dayak bir video daha sonra yüksek çözünürlüklü diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak kaydedilir. video sonra siliyer dayak frekansı hesaplamak için kare kare analiz edilir. Bu onların siliyer dayak sıklığı ve açısına göre üç kategoriye veya tipe ependimal hücrelerin farklı sınıflandırma verir. Ayrıca, bu tekniğin ependimal hücrelerin özel hücre içi kalsiyum salınım özelliklerinin yanısıra, kalsiyum salınımlarına farmakolojik ajanların etkisi ve siliyer atan frekans karakterize etmek için yüksek hızlı flüoresan görüntüleme analizi kullanımına izin verir. Buna ek olarak, bu teknik, siliyer yapı ve siliyer protein lokalizasyonu çalışmaları için immünofloresan görüntüleme için uygundur. Bu hastalık teşhis ve fenotip çalışmalarında özellikle önemlidir. Beyin dokusu ölmek başladığında tekniğin ana sınırlama canlı hareketli kirpikler hareketinde azalma atfedilir.
Introduction
Silyum hücre dışı ortama hücre yüzeyinden uzanan duyu mikrotübül tabanlı organellerdir. "9 + 0" ya da "9 + 2" - kendi mikrotübül Kuruluşunuza bağlı olarak, kirpikler iki tip olarak kategorize edilebilir. Fonksiyonel, onların hareketliliği dayanarak, bu hareketli veya non-motil kirpikler 1 olarak kabul edilebilir. Birincil kirpikler genellikle "9 + 0" non-motil kirpikler belirtmek için kullanılan bir terimdir. Bunlar ('9' ile gösterilir), dokuz paralel çifti mikrotübülleri ve mikrotübüller merkezi çifti ('0' ile gösterilir), merkezi kılıf içinde yoktur. Ancak, embriyo lateraliteyi düzenleyen gibi düğüm kirpikler gibi bazı "9 + 0" kirpikler, 2 hareketli vardır. Diğer yandan, hareketli silia mikrotübül çifti, bir ilave merkezi çift dokuz paralel mikrotübül çifti ek olarak karakterize edilmiştir ve motilite kolaylaştırmak için dinein motor protein ile bağlantılı. Buna ek olarak, bazı "9Böyle koku cilia olarak +2 "kirpikler 3 olmayan hareketli vardır. Beyin ventriküller ve omuriliğin merkezi kanal döşeyen hücreler ependimal beyin ventriküller 4 boyunca beyin omurilik sıvısı (BOS) itmek hareketli kirpikler ile karakterizedir.
Bu yöntemin genel amacı kirpikler dinamikleri ve yapısal anomaliler hareketli okuyan kolaylaştırmaktır. Beynin sağlığı ve gelişimi ağır beyin ventriküllerin içinde BOS etkin dolaşımı bağlıdır. Örneğin, normal bir BOS akım ve sıvı dengesi normale dayak ve sırayla nöronal hücrelerin yönlü hareketini düzenleyen kritik rol oynayan ve hücre göçü 7 kök fonksiyonel ependim kirpikler 5,6 gerektirir. Böyle anormal ependim kirpikler işlevi veya hidrosefali ile ilişkili anormal BOS akışına yol açabilir yapısı, tıbbi bir durum olduğu b ventrikül BOS anormal birikimi varYağmur. Bu sonuç kafa içi basınç ve baş, konvülziyon, tünel görme ilerici genişleme ve zihinsel engelli 8 arttı neden olabilir.
Mevcut yöntemlere göre bu tekniğin avantajları üç farklı ependim hücre tiplerini bildirmek için ilk kez izin olduğunu: Ben, onların eşsiz siliyer dayak sıklığı ve açı yenerek dayanan II ve III. Bu ependimal hücreler beyin ventriküllerinde belli bölgeler içinde lokalize. Ayrıca, yaş ve alkol ve ependim hücre tiplerini veya lokalizasyonu değiştirerek üzerinde silostazolün olarak farmakolojik ajanların etkileri ependimal hücrelerin bu sınıflandırmaya önce mümkün değildi, ispat edilebilir. Silostazol, fosfodiesteraz-3 inhibitörü, AMP cAMP'yi metabolize eden bir enzimdir ve bu, aynı zamanda, hücre içi kalsiyum 9 düzenler. Yüksek hızlı floresan görüntüleme analizi kullanılarak eşsiz hücre içi görüntüleme ve niceleme veriyorependim hücrelerin kalsiyum salınımı özellikleri. Örneğin, alkol ve silostazol hem anlamlı sırayla, ependim kirpikler 10 ile beyin omurilik sıvısı volüm replasmanı bir değişikliğe yol açabilecek ependim siliyer dayak frekansı yanı sıra hücre içi kalsiyum salınımlar özellikleri, değiştirilemez. Özet olarak bu teknik, farklı kalsiyum salınım özellikleri olan ependimal hücrelerinin üç farklı tip ilk kanıt sağlamak için önemli idi.
Aşağıdaki bölümde, prosedürün ayrıntılı bir adım-adım genel doku hazırlanması ve kullanımdan yakından ilgilenerek, sağlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan kullanımı için prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Bakım ve Kullanımı Kılavuzu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönergelerine uygun olarak Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuvar Hayvanları.
1. Beyin Ekstraksiyon, Kesit ve Doku Hazırlama
- Derin 5 dakika için CO2 ile boğularak ile ötenazi yabani-tip fare soyu C57BL / 6 Kurban. Servikal dislokasyon ile ölüm emin olunuz.
- % 70 etanol ile fare kafasını temizleyin.
- İlk kafatası açığa çıkarmak için başın üstünden başlayarak, kapalı cilt çekerek steril makas ve forseps kullanarak kraniyektomi.
- Sonra, kafatası maruz kaldığında, kemik parçası-by-parça soyma arka tarafında başlayan ve ön tarafına doğru hareket ettirerek kafatası çıkarın. Beyin ventriküllerin yok etmek değil dikkatli olun.
- Tüm beyin toplayın.
- Penisilin 10,000 ünite / ml ve streptomisin ve önceden ısıtılmış 10,000 ug / ml ihtiva eden% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek glikoz ve% 1 penisilin / streptomisin solüsyonu içeren bir 100 mm Petri kabındaki beyin yerleştirin 37 ° C arasındadır.
- Keskin bir bıçak ile elle medyan sagital düzlemde beyin dilimleyin ve bir vibratome kullanarak her yarısından itibaren ilk 100-200 mm bölümünü edinin.
- Önceden ısıtılmış 37 ° C, fosfat tamponlu tuzlu su (1 x PBS) çözeltisi ile beyin dokusu durulayın.
- Hemen, DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış beyin bölümü yerleştirin.
2. Canlı Görüntüleme Yapılandırma ve Kurulum
- DMEM / Yüksek Glikoz ortamı 1 ml içeren 30 mm cam alt kültür tabaklarında beyin dokusu kesitleri yerleştirin. % 95 /% 5 O2 / CO2 içeriği 37 ° C, (Şekil 1 'e mikroskop Kapalı bir odanın ortam ayarlama
- 60X objektif immersiyon yağı lens kullanarak, ilk 60X objektif lens üzerinde bir yağ damla yerleştirme ve düzenli DIC ile hücrelerin odaklanarak ependimal hücre / kirpikler görüntüleri toplamak ışık iletti.
- Silier dayak alanında kabarcık hareketinin bir tür oluşturmak Sonra, hareketli ependim kirpikler konumu için bir rehber olarak DMEM kabarcık hareket yönünü takip edin. DIC filtresi kullanılarak beynin lateral ventrikül içinde hareketli kirpikler ile sağlıklı hücreleri içeren bir alan seçin. Ependim kirpikler bulunduktan sonra, ışık ayarı ve tatmin edici bir görüntü elde etmek odaklanır.
- Metamorph görüntüleme yazılımı kullanarak belirli bir amaç doğrultusunda canlı görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Mevcut gösteri, objektif 60X ve 5-10 msn maruz kalma süresi ile birlikte, 1 x 1 kamera binning seti ile yirmidört-bit görüntüleri kazanır.
- Asgari exp olması için optimal düzeye mikroskop diyafram açarak DIC görüntüleri toplayınosure zaman. Gecikmeden hızlı ve anında görüntü alımını sağlamak için kameraya canlı görüntüleri akışı gözlemleyin. Yeterli görüntü kontrastını elde etmek için en az pozlama süreleri gereksinimi dayalı kirpikler dayak hızını hesaplayınız.
3. Veri Görselleştirme ve Analiz
- 1 dakika içinde dayak sayısını sayarak kirpikler dayak sayısını hesaplayın. Video hızını azaltarak ve hücre sayacı veya benzeri bir alet kullanarak vuruş sayısını sayarak bunu yapın.
- Dayak sıklığını hesaplamak için, video sn numarasını almak için edinilen kare ya da time-lapse görüntü sayısına göre kaydedilen hangi pozlama süresini çarpın. (Örnek: pozlama süresi 5 msn 200 kare = 1,000 milisaniye veya 1 sn).
- Tek saniyede yenerek sayısı olarak ifade edilir frekansı elde etmek için bir saniye içinde dayak sayısını hesaplayın. Tek ikinci kez Inter, üzerinde kirpikler dayak sayısına bölünmesiyle yapınval (Örnek: kirpikler = 1 sn 5 msn yani 5 msn x 200 kare pozlama süresi kaydedilen 200 kare video 50 kez yendi, şimdi 1 sn = 50 Hz ile 50 atım bölmek).
- Her iki güç ve kurtarma vuruş sırasında ependim kirpikler tarafından alınan yolu değerlendirerek siliyer dayak açısını hesaplayın. Küçük değişikliklerle 11, daha önce tarif edilen yönteme uygun olarak, bu gerçekleştirme. Bireysel kirpikler kesin hareketi tam yendi döngüsü sırasında görülmektedir.
- Monitörün üzerine yerleştirilen bir asetat sayfasında, ependimal kenarı ve güç inme başlangıcında kirpikler orta hat pozisyonuna yoluyla dikey bir çizgi boyunca yatay bir çizgi çizin.
- Güç inme sırasında ileri hareket ederken kare cilium çerçevenin kesin konumunu çiziniz. Benzer bir tarzda, geri stroku esnasında Sil hareketi çizilir.
- T sırasında orta hattan cilium maksimum sapma gelen siliyer dayak açısını hesaplamakgüç inme yanı sıra kurtarma inme o.
4. Kalsiyum sinyal kayıt
- Beyin dilimleme sonra, kısa bir süre için 1 x PBS veya Dulbecco PBS (pH 7.0), beyin dilim yıkayın. Floresanlık sönmesini önlemek için ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, taze Fluo-2 hazırlayın.
- , Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde Fluo-2 çözeltisi, 1 mM stok çözelti hazırlayın karıştırmak ve Fluo-2 homojen DMSO içinde eritildi sağlamak için, en az 5 dakika boyunca çözeltiden vorteks.
- % 2 B27 ile takviye edilmiş DMEM / Yüksek Glikoz 500 ml Fluo-2 stok solüsyonu ile seyreltilir, 20 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılır.
NOT: B-27 vitamini, antioksidan kokteyli ve hipokampus ve diğer merkezi sinir sistemi nöronlarının kısa veya uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan insülin içeren optimize edilmiş serum serbest ekidir. - Hemen bir cam alt plaka 37 ° C'de 30 dakika süre ile 20 mg / ml Fluo-2 beyin dilim inkübe edin.
- Kalsiyum fluorofor Flu-2 optimal yükleme konsantrasyonunu belirlemek için ve ATP ile kalsiyum boya hücre toksisite, meydan hücreleri önlemek için, ve ATP cevaben zaman ders ve kalsiyum sinyallerinin tepe büyüklüğünü belirleyerek hücre canlılığı kontrol ediniz.
- 488 nm ve 515 nm, sırasıyla, (Film 2) eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile, 1 saniye (sn 200 kare) bir en az 5 msn bir yakalama oranında kalsiyum salınım için video kaydedin.
- Otofloresans veya hareket eserler arasından Flu-2 kalsiyum sinyalini ayırt etmek, 515 nm yayılan şiddetleri ayrı izlenir emin olun.
Not: Flu-2 hücre içi kalsiyum ölçmek için uygun bir kalsiyum fluoremetric değildir. Bununla birlikte, örneğin kalsiyum salınımları hızlı kalsiyum değişiklikleri tespit etmek için mükemmel bir dinamik kalsiyum boyadır. Daha doğru bir kalsiyum ölçümü için, Fura-2 tavsiye edilir. Bununla birlikte, Fura-2'nin dinamik değişimler de rasyometrik ile sınırlıdırboya doğası. - Tam serbest hücre içi kalsiyum değerlerini hesaplamak için üretici tarafından sağlanan formüller izleyin. Örnek [Ca 2 +] = Kd × (R - R dk) / (R max - R). Kd serbest kalsiyum boyanın ayrışma sabiti olduğu durumlarda, R, 488 ölçülen floresans olduğu, ve R 've R max dakika minimum ve maksimum iyon konsantrasyonu 12 floresan oranlarıdır.
5. İmmünofloresan Mikroskopi
- % 4 paraformaldehit (PFA) ile 10 dakika süre ile,% 2 sukroz ihtiva eden fosfat tamponlu tuz çözeltisi ile beyin bölümleri sabitleyin. Seçenek olarak ise, bir kriyostat kullanarak 50 mm bölüme% 4 daha sonra PFA ve bölüm ile bütün beyin sabitleyin.
- 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın.
- Bir soluti beyin dilim inkübe5 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X ile, daha sonra 5 dakika, her seferinde 1 x PBS ile üç kez yıkayın.
- Gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında (RT) ya da bir saat boyunca 1 x PBS içinde% 10 FBS içinde 5000: fare primer antikor ile beyin dilim inkübe 1 bir seyreltmede kullanılan a-tubulin, antiacetylated.
- 5 dakika her zaman için 1x PBS ile dokuya üç kez yıkayın.
- Sekonder antikor beyin dilim inkübe 1 bir seyreltme floresein anti-fare IgG: oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1 x PBS çözeltisi içinde 500,% 10 FBS.
- 5 dakika çekirdeği (veya DNA) 13 leke 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile bölüm counterstain bir floresan mikroskobu altında gözlem, önce. Mümkün olan minimum pozlama süresi ile bölümler hemen photobleaching, görüntüyü en aza indirmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı fare beyninde ependim kirpikler fonksiyonu Ölçme
Bu protokol açıklanan yöntem fare beyninin yanı sıra izleme ve kirpikler dayak frekansı incelemek için disseke taze dokuda ependim kirpikler işlev ve yapısını izlemek için kullanılır. Tam bir deney gerçekleştirmek için, ardından adım şematik bir akış şeması (Şekil 1) 'de tasvir edilmektedir. Oldukça deneme mümkün olduğunca aktif hareketli kirpikler tutmak için kısa bir zaman dilimi içinde yapılır tavsiye edilir. Temsili time-lapse film ve ependimal hücreleri ve bunların hareketli kirpikler görüntüleri de gösterilmiştir (Film 1 Şekil 2a). Elde edilen akımında veri analizi hareket kirpikler dövülmesi ve açı desen sayımı ile gerçekleştirilir. üç tipe kirpikler bölünmesi kriterleri ependim kirpikler varlığı confi Tablo 1'de sunulmuşturbir çekirdeğin bir siliyer işaretleyici, asetile-a-tubulin ile rmed ve ependimal hücreler DAPI (DNA işaretleyici) ile karşı (Şekil 2b). En az 22 bağımsız deneyler beyin lateral ventrikül içinde ependim hücrelerin bizim gözlemlere dayanarak, biz onların siliyer atan sıklığına göre üç tipe ependimal hücreleri sınıflandırmak mümkün. Ayrıca,% 0.25 bir konsantrasyonda etanol önemli ölçüde tip (Şekil 3) bağımsız olarak kirpikler dayak frekans bastırılmış olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, bu veriler önceki bulgularla 10 ile uyumlu olarak bulunmaktadır.
Ependim kirpikler tarafından Ölçme kalsiyum sinyal
Daha önce kirpikler eğilme 14-16 sinyalizasyon bir cilium bağımlı hücre içi kalsiyum tetikleyebilir gösterilmiştir. Bu teknik araştırmacılar incelemek ve beyin ventriküller içinde hücre içi kalsiyum sinyalini ölçmek için sağlar
Şekil 1:. Ependimal kirpikler görüntüleme protokolü akış şeması Ependimal kirpikler görüntüleme protokolü bir deney, fare brainextraction başlayarak, kesit ve görüntü toplama ve analiz için doku hazırlanması tamamlamak için adımları göstermektedir. Yaklaşık bir saat çizelgesi adım adım prosedürü ile sunulmaktadır.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Şekil 2:. Beyin ventriküllerinde Ependimal kirpikler yerelleştirme Burada gösterilen bir fare beyninin lateral ventrikül ependimal hücrelerdir. (A) bireysel ependimal hücreleri (alt oklar) ve kirpikler (üst oklar) DIC görüntüleri gösterilmektedir. (B), beyin kesitinin bir bindirme görüntüsü siliyer işaretleyiciye karşı antikor ile boyandı, yeşil (üst oklar) 'de gösterilen a-tubulin, asetile ve mavi (alt oklar)' de gösterilen bir çekirdek / DNA markörü, DAPI, ile karşıt . Paneller a ve b farklı beyin bölümleri temsil ettiğini unutmayınız.
Şekil 3:. Alkol ve fare beyin lateral ventrikül ependimal hücre türleri arasında frekansları dayak kirpikler farklılıklar ex vivo beyin kesiti E ((kontrol) ya da kuluçkalanmıştır-metanol) 5 dakika için% 0.25 alkoldür. Yıldızla gösterildiği gibi kontrole göre, alkol tedavisi önemli ölçüde cilia dayak sıklığı azalmıştır. En azından, 5-10, bağımsız preparatlar, her ependim hücre tipi ve tedavi grubu için kullanılmıştır.
Film 1: tip III ependimal hücrelerde ependim kirpikler Kayıt Burada gösterilen beynin üçüncü ventrikül III ependimal hücreleri tip frekans ve benzersiz bir açı yenerek karakterize ependim kirpikler kayıtları vardır.. Bu rakam daha önce 10 rapor edilmiştir ve izni ile yeniden yapıldı.
Film 2: ependimal hücrelerde hücre içi kalsiyum salınımı Burada gösterilen beynin yan ven bir bölümü üzerinden ependimal hücrelerin kalsiyum salınımlarının kayıtları bulunmaktadır.37 ° C'de 30 dakika süre ile, 20 mg / ml kalsiyum indikatörü olan fluo-2 beyin dilim inkübe edildikten sonra tricle. Beyin bölümünün kalsiyum seviyesi çalışıldı ve sözde renkli. renk çubuğu ependimal hücrelerin kalsiyum düzeyini gösterir; nerede siyah-mor ve kırmızı-sarı, sırasıyla düşük ve yüksek kalsiyum seviyelerini temsil etmektedir. Protokol Metinde bahsedilen kontrol ve tedavi grupları arasında ortalama olarak hücre içi kalsiyum ölçümü için, ependimal hücre kalsiyum, birkaç ayrı ependimal hücrelerden hesaplanır. Kalsiyum salınım video sırasıyla 488 nm ve 515 nm uyarma ve emisyon dalga boyları ile saniyede 200 kare hızında kaydedildi. Bu rakam daha önce 10 rapor edilmiştir ve izni ile yeniden yapıldı.
| Ependim hücre tipi | Cilia dayak frekansı | Cilia dayak açısı |
| Tip I | > 60 Hz | <90 ° |
| Tip II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Tip III | <30 Hz | > 135 ° |
Tablo 1:. Ependim kirpikler Türleri tip I içine ependim kirpikler sınıflandırılması, II veya III öncelikle dayak frekansına ve beynin üçüncü ventrikül ayrı bölgeler içinde yer alan ependim kirpikler açısını yenerek dayanıyordu. Bu verilerin parçaları önceden bildirilmiştir ve izni ile burada tekrar edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canlı görüntüleme ve beyin ventriküller içinde ependim kirpikler hızlı ve duyarlı bir yakın gözlem sağlayan floresan mikroskopi hem fare beyin dokusu hazırlanması için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu teknik sadece lateral ventrikül ile sınırlı değildir; diğer beyin ventriküllerde kirpikler gözlemlemek için yararlanılabilir. Bu görüntüleme tekniği bir ex vivo ortamda siliyer dayak ile BOS hareketine benzer bir canlı akışı sağlar. Ayrıca, kirpikler yönlü hareketin analizi sağlar. Bu esas olarak bir yüksek çözünürlüklü DIC ve floresan görüntüleme sistemi kullanılarak kolaylaştırılmıştır. Bu sistemin bir avantajı, bir mikroskop sıcaklık, nem ve CO2 seviyeleri iyi bir düzenleme sağlayan bir çevre odasında, içine olmasıdır. Bu canlı görüntüleme exper yaparken hücre ve dokularda hayatta kalması için dikkate alınması gereken çok kritik parametreleriments. Sistem aynı zamanda kirpikler hareketleri gibi dinamik hücresel davranışları görüntüleme kolaylaştırmak için önemli özelliklerdir hepsi otomatik XY ve Z modüllerin yanı sıra, dijital kamera ve dalgaboyu filtre Switcher ile donatılmıştır. Mikroskop bir bilgisayara bağlandığında ve yüksek kaliteli görüntüler elde etme yazılımı görüntüleme kolaylaştırılmıştır.
Farklı tipe ependimal hücreleri sınıflandırmak için, bu teknik kullanılarak ependim kirpikler incelemek için kullanılan mevcut / önceki yöntemlere göre önemli bir ilerleme sunmaktadır. Örneğin, alkol gibi, belirli bir farmakolojik ya da toksik maddelerin etkisi, aksi en aza indirilir veya ependimal hücreleri bir nüfus 17 olarak kabul ise etkisiz olabilir. Bu frekansları ve açıları yenerek silya özellikleri ependim kirpikler bu üç tip arasında çok farklı olmasına rağmen, biz sadece bu hücrelerin fizyolojisini anlamak için başladı, akılda tutmak önemlidir. Bundan dolayıBu protokol anlatılan prosedür düzgün taşınır ise, daha önceki çalışmalarına göre, bizim sınıflandırma yeterince sağlamdır.
Farklı ependim kirpikler belirlenmesi ependim fizyolojisi temel bir anlayış kazanmak için temelde önemli. Bu yöntem, üç farklı (Tablo 1) sınıflandırmasına yol benzersiz ve özellikle de çarpan frekans ve açı ile ilgili üçüncü ventrikül içine yerleştirilmiş ependim hücrelerinin üç farklı türleri arasında ayrım yapmayı mümkün kılar. Frekansları dayak kirpikler farklılıklar ependim hücre ya da hayvan yaşı farklılıklara canlılığı farklılıklara bağlı olmadığını teyit etmek üzere, bu önerilir nöronal dokusu ve ekli sadece sağlam ve farkedilmemiş ependimal şeritler veya dilimleri Kalın az 100 mm kullanılır. Ayrıca, siliyer dayak sıklığı her ependim bölümü boyunca farklı yerlerde ölçülmelidir. Biz daha önce bu tekniği kullanarak oluşturulan siliyer vuru frekansı verileri 87 deneysel gözlemlere 10 arasında sürekli tekrarlanabilir olmuştur göstermiştir. Dolayısıyla, ependimal hücreler doğru kendi siliyer dayak bağlı sınıflandırılır. Siliyer dayak sıklığını azalttığı bilinen farmakolojik maddeler kullanılarak Dahası, silya dayak frekansı teorik o farmakolojik ajanların çıkarılmasını takiben, normal dayak frekansına dönmelidir.
Bu protokol kritik bir adım beyin dokusu ve deney tamamlamak için gereken süreyi ele esas ilgilidir. Bu ependim kirpikler yapısını ve fonksiyonunu korumak için yanı sıra kırılgan doku travmasını azaltmak için hafifçe beyin dokusu ele zorunludur. Daha da önemlisi, bu tekniğin başarısı için sınırlayıcı bir faktör olabilir, beyin dokusunun bozulmasını ve ölümleri önlemek için, son derece recommende olduğunuBu teknikle ilgili adımlar mümkün olduğunca bir saat kadar yakın yapılmaktadır d. Ancak, bu sınırlama in vitro veya alternatif besleyici medya kullanımı ile hareketli kirpikler ile kültür ve büyüyen ependimal veya benzer hücre tiplerinde gelişmeler ile geleceğe aşılabileceğine. örneğin CSF ve beyin dilimleri inkübasyon için Earle tuzları gibi alternatif besleyici ortamın kullanımı literatürde 5 ile ortaya konmuştur. Bununla birlikte, elimizdeki, DMEM / Yüksek Glikoz kullanılması nedeniyle potansiyel enerji kaynağı olarak ortam içinde glükoz yüksek miktarda (4.500 mg / ml) mevcudiyetinde muhtemelen aCSF daha faydalı oldu. Bu canlı hücrelerin temsili bir işaretidir Böylece, ana kriter, doku ve dolayısıyla yaklaşımın geçerliliği değerlendirmektedir kirpikler dayak canlılığını değerlendirmek için kullanılan.
Ependim kirpikler Canlı görüntüleme kirpikler aktivasyon aşağı sinyal yolları analiz etmek için güçlü bir araç sunuyorkalsiyum sinyalizasyon ve salınımlar olarak. Örneğin, canlı bir flüoresan görüntüleme kullanılarak, bu bağımsız olarak ependim hücresi / kirpikler Çeşidi gösterilmiştir, ependimal hücreler özgü kalsiyum salınım özellikleri 10 ile karakterize edilir. Sonuçta, bu protokol, temel bilimsel bilgi ve klinik uygulamada hem alakalı. Temel bilimler açısından bakıldığında, bu teknik ependim kirpikler yapı, fonksiyon ve alt mekanik sinyal yollarının fonksiyonel ve fizyolojik rolleri bir değerlendirmesini sunmaktadır. Klinik uygulama açısından bakıldığında, bu yöntem, hidrosefali ve alkol kullanımı gibi nörolojik bozukluklar için yeni bir tedavi hedefi olarak ependimal kirpikler hedefleyen ilaçlar için arama son derece alakalı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
