Abstract
Aktuella undersökningar fag-värd interaktioner är beroende av extrapolera kunskap från (meta) genom. Intressant, 60 - delar 95% av alla fag sekvenser ingen homologi med nuvarande kommenterade proteiner. Som ett resultat, är en stor del av fag gener kommenterad som hypotetisk. Denna verklighet kraftigt påverkar notering av både strukturella och hjälp metabola gener. Här presenterar vi Phenomic metoder för att fånga det fysiologiska svaret (er) av en utvald värd under expression av en av dessa okända fag-gener. Multi-fenotyp analysplattorna (kartor) används för att övervaka mångfalden av värdsubstratet utnyttjande och påföljande bildning av biomassa, medan metabolomik ger biprodukt analys genom att övervaka metaboliten överflöd och mångfald. Båda verktygen används samtidigt för att tillhandahålla en fenotypisk profil som är associerad med expression av en enda förmodad fag öppen läsram (ORF). Representativa resultat för båda metoderna jämförs, highlighting fenotypiska profilskillnader en värd som bär antingen förmodade strukturella eller metaboliska fag-gener. Dessutom är de visualiseringstekniker och hög kapacitet beräkningsenheter som underlättade experimentell analys presenteras.
Introduction
Virus som infekterar bakterier (aka bakteriofager eller fag) beräknas finnas på mer än 10 31 viruslika partiklar (VLP) globalt och fler än alla andra organismer i en miljö 1,2. Den första metagenomic studie som undersökte de virala samhällen som är förknippade med marina miljöer med fokus på att kvantifiera mångfalden ses inom den virala fraktion 3. Dessutom Breitbart och kollegor visar att över 65% av de virala samhället sekvenser delade ingen homologi med några sekvenser som finns i offentliga databaser. Senare metagenomic studier funnit liknande bevis: metagenomes från marina sediment i San Diego, Kalifornien innehåller 75% okända virussekvenser 4; metagenomes från hypersaline sjöar Salton havet innehåller 98% okända virala sekvenser 5; och korall associerade metagenomes innehåller 95-98% okända virala sekvenser 6. Denna ansamling av OKOMMENTERAD information har resulterat ifag genetiskt material är "den mörka materien av den biologiska universum" 7.
Genomisk karakterisering av fag bygger på att identifiera sekvenslikhet genom jämförelse mot befintliga nukleinsyra och proteindatabaser. Eftersom fag-kodad genetisk information är huvudsakligen okänd, homologibaserade metoder är ineffektiva. Inom sitt genom, fager kodar typiskt tre stora gen typer: transkription och replikationsgener, metabola gener och strukturella gener. De transkriptions- och replikationsgenerna (klass I / II-gener 8) innefattar polymeraser, primases, endo / exo-nukleaser och kinaser. Dessa gener är mycket konserverade på grund av deras betydelse i faginfektion, transkribering och replikera fag genetiskt material. Fag-polymeraser är lätt identifieras med hjälp av traditionella sekvenshomologi metoder på grund av deras globala bevarande 9 och har visat sig vara effektiva fylogenetiska markörer 10.Däremot fag metabola och strukturella gener (klass II / III-gener 8) blir allt divergerande och ofta kommenterad som hypotetiska gener.
Fag metabola gener påverkar metabola kapaciteten hos värden och är inte nödvändigtvis krävs för virusreplikation. Dessa gener, ofta kallad hjälp metabola gener 11 (AMGs), tycks modulera värd metabolism och möjliggöra optimal progression av infektion och framgång virion mognad. AMGs har satts i samband med utnyttjande och spridning av begränsande näringsämnen eller energiproduktion vägar. Några exempel Foto gener som finns i arvsmassan hos olika cyanophage 12-16, gener som är anslutna till och regleras av fosfatmetabolismen 17,18, och utnyttjande av pentosfosfatvägen för fag dNTP biosyntesen 18,19. I jämförelse, strukturella generna är bland de mitten till slutet av gener som produceras under infektion och varierar mellan olika fag-host system. Produktionen av strukturproteiner är beroende av tillgången på viral dNTP, och energipooler för deras transkription, translation, och montering 8. De kapsid och svans fiber strukturella proteiner anses som den mest avvikande av alla virala proteinkodande gener och krävs för framgångsrik virion produktion. Deras avvikelse typiskt tillskrivas den aktiva roll de spelar i utformningen av virusvärd samevolution 20. Divergerande proteiner oberoende av genen klass, lätt förbises när användning av traditionella homologi och sekvensinriktningstekniker. Ett försök att korrigera för de begränsningar som ses med strikta sekvensjämförelser har resulterat i bioinformatiska verktyg kan använda sekvens egenskaper för att bestämma förening, såsom artificiella neurala nät 21. Artificiella neurala nät (ANN) gör det möjligt att förutsäga strukturella och metabola gener kräver emellertid nedströms experimentell validering för att direkt karakteriseragenfunktion.
Syftet med detta manuskript är att tillhandahålla Phenomic protokoll med förmåga att övervaka både katabola och anabola metabolism av en värdbakterie under expression av en ny fag-gen, funktionellt förutspått genom ANN. Området Phenomics, biologi i samband med cellulära fenotyper, är väl etablerat i systembiologi för att underlätta utredningen av proteiner med okända eller pleiotrop funktion. Phenomic verktyg används för att länka fenotypisk information till genotypisk information. Vi hypotes för förmodade fag gener som deras funktion (s) kan bestämmas genom att observera värd fysiologiska effekter under fag genuttryck. För att undersöka denna hypotes, var två kvantitativa metoder valt. Multi-fenotyp analysplattorna (kartor) användes för att övervaka värdsubstratet utnyttjande och efterföljande bildning biomassa medan metabolomik uppmätta värd metabolit mångfald och relativ förekomst under tillväxt i specifik miljöpsykiska tillstånd. Förmodade strukturella och metaboliska proteiner överuttryckt i Escherichia coli och representativa resultat från båda experimenten jämförs. Många visuella tekniker och hög kapacitet bearbetning rörledningar presenteras för att underlätta experimentell replikering. Slutligen är reproducerbarhet och noggrannhet av de presenterade metoderna diskuteras i samband med förväntade fysiologiska effekter för en kommenterad kapsidprotein och fag metabola protein, tioredoxin, plus två förmodade AMGs.
Protocol
1. Framställning av Multi-fenotyp analysplattan (MAP) Substrat, Basal Media, Pre-tillväxt Media, och buffert
- Gör 50 ml av 1,0-1,25% substratlager.
- Lös 1,0-1,25% (vikt / volym) av fast substrat i sterilt vatten (värme om nödvändigt). Filter sterilisera lösningar med 0,22 um filterenhet och butikslager vid RT. Exempel på substrat som används i dessa experiment ges i Tabell 2.
- Gör 250 ml 3x basala media för alla substratklasser (kol, kväve, svavel och fosfor). De MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonat) baserade basmedier 22 innehåller följande: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4% glycerol *, 9,5 mM NH4CI *, 0,25 mM naso 4 *, 1,0 mM MgSO 4 *, 1,32 mM K 2 HPO 4 *, 10 mM KCl, 0,5 ^ M CaCl2, 5 mM NaCl, 6 pM FeCl3, och 0,1% (vikt / volym) L-arabinos ** (tabellerna 1 och 2) .
Notera: * Dessa föreningar ingår inte beroende på den basala mediet. Till exempel är 0,4% glycerol som inte används i kol basmedier och svavel basmedier 1,0 mM MgSO 4 skall ersättas med 1,0 mM MgCl2. ** L-arabinos är specifik för induktion av pBAD promotorvektor, pEMB11, som förvandlades till en ara - E. coli K-12 stam (BW 27784) 23.- Lägg varje komponent i den basala media till en steril kolv och föra lösningen till volym. Blanda väl. Med en 0,22 um filterenhet, filter sterilisera varje basmedier i en steril flaska.
- Gör 500 ml MOPS före tillväxtmedier. MOPS baserade pre-tillväxtmedier 22 innehåller följande: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM tricin), 0,4% glycerol, 9,5 mM NH4CI, 0,25 mM naso 4, 1,0 mM MgSO 4, 1,32 mM K 2 HPO 4, 10 mM KCl, 0,5 ^ M CaCl2, 5 mM NaCl och 6 ^ M FeCl3.
- Lägg till varjekomponent av pre-tillväxtmedia till en steril kolv och föra till volym. Filtersterilisera med en 0,22 fim filterenhet, tillsätt sedan ampicillin vid en slutlig koncentration av 100 | ig / ml. Butiks lösning vid 4 ° C.
- Gör 500 ml 0,5x Luria-Bertani (LB) agarplattor. Till en steril kolv, till LB komponenter för att göra en 0,5x koncentration (1,25 g jästextrakt, 2,5 g NaCl, 2,5 g trypton, 7,5 g agar). Blanda väl och autoklav för att sterilisera.
- Kall-agar, tillsätt sedan 100 | j, g / ml av antibiotikumet ampicillin under blandning. Häll ~ 25 ml agar i petriskålar, låt in och förvara vid 4 ° C tills det behövs.
- Gör 250 ml av 10 mM Tris (pH 7,4) plus 10 mM MgSO 4 buffertlösning. Filter sterilisera med en 0,22 fim filterenhet, och förvara lösningen vid RT.
2. Framställning av bakteriecellsuspension
- Förbered färska kolonier. Från 12,5% glycerol fryst lager, tallrik färsk E. coli Clones på 0,5x LB-agar innehållande 100 ug / ml ampicillin. Inkubera vid 37 ° C under 24 h.
- Förbered flytande kulturer:
- Pipettera 3 ml av pre-tillväxtmedia innehållande 100 ^ g / ml ampicillin i odlingsrör. För varje klon, använder biologiska tre exemplar.
- Inokulera oberoende kolonier från avsnitt 2.1 i förberedda odlingsrör. Inkubera vid 37 ° C med skakning under 22 h.
- Pellets och tvätta bakterieceller:
- Transfer O / N kulturer i 1,7 ml mikrofugrör. Pelletera celler genom centrifugering vid maximal hastighet (16.900 x g) under 2 min i en mikrocentrifug. Dekantera supernatanten och tvätta cellerna genom återsuspendering i 500 | il av 10 mM Tris / 10 mM MgSO 4 buffert. Upprepa.
- Återpellets celler, dekantera supernatanten och återsuspendera celler i 1 ml 10 mM Tris / 10 mM MgSO 4 buffert.
- Mät celltäthet och koncentrera celler (vid behov):
- Späd celler från avsnitt 2.3.3 10-faldigt i10 mM Tris / 10 mM MgSO 4 buffert och överföra denna utspädning i en kyvett. Mät den optiska densiteten (OD 600 nm) Denna utspädning och spela.
- Koncentrera celler för att uppnå slutlig koncentration av 0,07 (OD 600 nm) i kartorna (cellerna kommer att spädas 15 gånger när de tillsätts till kartorna, därför celler måste vara vid en initial koncentration av OD 600 nm = 1,05). Överför koncentrerad cellsuspension i en behållare och spara (vid RT) tills steg 3,5 kartor beredning.
3. Framställning av Fler fenotyp analysplattorna (MAP)
- Märk kartor. Märknings sterila 96-brunnars mikro-titerplattor med en E. coli klon identifikationsnummer och KARTA schematisk typ.
- Alikvot sterilt vatten i MAP. Överför aseptiskt sterilt vatten till en vätskereservoar. Pipett 60 ul i varje brunn på mikro-titer plattan med en flerkanals pipett.
- Alikvot basala media into Maps. Aseptiskt överföring 3x basmedier i en vätskebehållare. Pipett 50 ul i varje brunn på mikro-titer plattan med en flerkanals pipett. Upprepa steg 3,2 och 3,3 för varje basala media som används i MAP schematiska.
- Alikvotera substrat till kartor. Överför 30 ul av varje substrat i rätt väl av MAP.
- Lägg bakteriesuspensionen till kartorna. Överför 10 ìl av bakterieceller från avsnitt 2.4.2 till varje brunn i kartan med en flerkanals pipett. Ändra tips innan återinföra pipett tillbaka i odlings lager.
- Täck kartor med självhäftande film. Täck varje platta med en enda självhäftande plattans film. Tryck fast filmen ovanpå brunnarna i plattan och längs kanterna för att skapa en jämn och tät förslutning. Ta bort överflödig film från kanterna på mikro titer platta med en steril rakblad.
- Mät den optiska tätheten av MAP:
- Placera förberedda kartor i "Input" hylsa av en flerskivig spectrofotometer plattläsare. Öppna plattläsare programvara och skapa ett protokoll som mäter absorbansen (OD 600 nm) var 30 minuter, för totalt 32 timmar, med 60 sekunder av skakning mellan läsningar.
- Inställd temperatur i anordningen till 37 ° C. Börja protokoll när MAP har jämvikt vid inställd temperatur.
- Efter 32 timmar, ta bort kartor från "Output" hylsa av plattläsaren. Märk varje data textfil att inkludera: E. coli klon identifieringsnummer, datum MAP sprang och MAP schematiska typen.
4. Multi-fenotyp analysplattorna (kartor) Bearbetning och Parametrering
- Bedöm tillväxtkurvor med användning av en automatiserad QA process, t.ex. PMAnalyzer 24.
- Kontrollera att tillväxtkurvorna har OD 600 nm <0,20 i första 2 h. Använd inte absorbans vid den initiala tidpunkten (t 0) i filtret på grund av artefakter av kondens, som vanligtvis lösa påt 1 (30 min).
- Ta tillväxtkurvor som bryter mot QA filter. Spara kurva information (provnamn, väl nummer, och OD 600 nm-värden) i en separat utdatafil för framtida referens. Fortsätt med analys om tillväxtkurva passerar QA filter.
- Beräkna mediantillväxtkurvor. Använda replikera data, per brunn, beräkna medianen tillväxtkurvan genom att ta medianen optiska densiteten (OD 600 nm) värde vid varje tidpunkt. Spela resultemediantillväxtkurvor i en separat utdatafil för framtida bruk.
- Beräkna den bäst anpassade logistiska modellen för varje tillväxtkurva med användning av en anpassning av den ekvation som föreslagits av Zwietering 25. Den logistiska ekvationen innehåller tre parametrar som beskriver bakterietillväxt: fördröjningstiden, λ (h), den högsta tillväxttakten, μ max (OD 600 nm 100 -1), och det slutliga utbytet av biomassa, α (OD 600 nm). Använd data vid tiden = 30 min (y 1) som initialt värde på grund av artefakter av kondens.
[1] - Beräkna den maximala tillväxthastigheten med hjälp av en direkt sökning. Registrera den största hastigheten av förändring under en 90 minuters intervall inom data.
[2] - Uppskatta det slutliga utbytet av biomassa genom att söka efter den övre asymptotiska värdet av de största glidande medelvärde under en 90 min fönster. Specifikt definierar som asymptoten av tillväxtkurvan.
[3] - Använda μ max och A-värden från 4.3.1 och 4.3.2, hitta λ värdet genom att försöka alla värden λ:
[4] - Använd varje λ värde för att beräkna en summa av kvadratfelet (SSE). Använd lägsta SSE är SSE (λS):
/files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]
- Använd varje λ värde för att beräkna en summa av kvadratfelet (SSE). Använd lägsta SSE är SSE (λS):
- Beräkna den maximala tillväxthastigheten med hjälp av en direkt sökning. Registrera den största hastigheten av förändring under en 90 minuters intervall inom data.
[1] 
[2] 
[3] 
[4] 5. Fenotyp Analys av MAP
- Beräkna tillväxtnivån (GL) för varje tillväxtkurva för att bedöma den totala tillväxten per klon per substrat. Definiera GL som det harmoniska medelvärdet av de skiftade logistikmonterade värden:
[6] - Tilldela en fenotyp till varje tillväxtkurva baserad på GL-värden. Här är de fyra fenotyper som används är: förväntad tillväxt, ingen tillväxt, vinst på funktion och funktionsförlust.
- Bestäm fenotyper genom att jämföra tillväxten i alla kloner på ett specifikt substrat i form av standardavvikelser bort från medelvärdet. Använd denna statistik och en minsta tillväxt tröskel för att utse fenotypen presenteras av tillväxtkurvan (Figur 1A, B). Figur 1C ger exempel på fenotyp uppdrag.
- Definiera tillväxt GL ≥ 0,4 (Figure 1A, B). Definiera Gain funktion (Figur 1C, grön) som har en GL> två standardavvikelser över medelvärdet och en genomsnittlig> tröskel tillväxt. Funktionsförlust (Figur 1C, röd) definieras som att ha en GL <två standardavvikelser under medelvärdet och ett medelvärde> tröskel tillväxt.
- Skapa visuella representationer av datamängden på grundval av fenotyper och tillväxtkurvor.
- Visa tillväxtdynamiken porträtterar OD 600 nm värden färg för att snabbt jämföra tillväxtkurvor mellan flera kloner (Figur 2).
- Visa fenotypiska distributioner bland alla kloner baserade på tillväxtbetingelser (Figur 3).
[6] 6. Bygga kontinuerlig odling Apparatus
- Reaktorhamnanläggningar (Figur 4A, B). Borra tre 1/4. Hål, fördelade 3/4. Isär, i hatten för den kontinuerliga kulturen reaktorn.
- For hamn α: skruva en kvinnlig luer tråd stil panelmontering till 1/16 i hulling från botten av locket med hull pekar uppåt, ut ur den gemensamma jordbrukspolitiken.. Säker hulling med en 1/4. Panelmontage låsmutter.
- För hamn β: skruva en kvinnlig luer tråd stil panelmontering till 1/16 i hulling med hull pekar uppåt, ut ur locket.. Säker hulling med en 1/4. Panelmontage låsmutter.
- För hamn γ: skruva en kvinnlig luer tråd stil panelmontering till 1/16 i hulling från botten av locket så hull pekar uppåt, ut ur locket.. Säker hulling med 1/4 i. Panelmontage låsmutter. Skruva en hanluer med integrerad låsringen till 1/8 i. Bred borrning slang till hull montering på insidan av locket.
- För utflödet port: borra ett 5/16 i hål på 75 ml märke kontinuerlig odling reaktorn.. Skär 3/4. Utanför muttern slutet av 1/4 i. Hullingförsedda skottgenomföringen. Skruva i 1/4 i. Hullingförsedda skottgenomföringen (packningen på utsidan av flaskan och muttern är på insidan, Figure 4B).
- Utfodring flaska hamnanläggningar (Figur 4C). Borra två 1/4. Hål fördelade 1 i. Förutom i hatten för nappflaskan.
- För hamn δ: skruva en kvinnlig luer tråd stil panelmontering till 1/8 i hulling med hull pekar uppåt, ut ur locket.. Säker hulling med en 1/4. Panelmontage låsmutter.
- För hamn ε: skruva en kvinnlig luer tråd stil panelmontering till 1/16 i hulling med hull pekar uppåt, ut ur locket.. Säker hulling med en 1/4. Panelmontage låsmutter.
- Skruva en hanluer med integrerad låsringen till 1/8 i. Bred borrning slang till hull montering, på insidan av locket.
- Utfodring rör och rör tillägg:
- Klipp två 1 i. Bitar av slang (1/8. Ytterdiameter (OD) x 1/16 i. Innerdiameter (ID)). Montera bitar på hamnarna α och γ av kontinuerlig odling reaktor i avsnitt 5.2.
- Skär en 1 i. Bit tubing (1/4 i. ytterdiameter x 1/8 i. ID). Fit bit på hamn Β av kontinuerlig odling reaktorn.
- Skär en enda 3.5 i. Slang (1/8. OD x 1/16 i. ID). Montera denna pjäs på insidan av γ hamn på hanluer med integrerad låsringen till 1/8 i. Bred cylinderslang. Port γ är provtagningsporten av kontinuerlig odling reaktorn.
- Skär en 1 i. Slang (1/4. OD x 1/8 i. ID). Montera denna pjäs på δ hamnen i nappflaskan.
- Skär en enda 11. Slang (1/16 i. OD x 1/8 i. ID). Montera denna pjäs på insidan av porten ε av nappflaskan på hanluer med integrerad låsringen till 1/8 i. Bred cylinderslang.
- Skär två 18. Bitar av slang (1/8. OD x 1/16 i. ID). Montera en bit åt babord ε av nappflaskan. Spara den andra delen för avsnitt 7.
7. Running Kontinuerliga kulturer för Metabolomics
- Sterilisera material:
- Autoclave de torra materialen i 30 min. Se till att linda locket på nappflaskan som gjorts i avsnitt 5 i aluminiumfolie. Håll fäst slang rakt.
- Linda locket på kontinuerlig odling reaktorn görs i avsnitt 5, i aluminiumfolie. Håll fäst slang rakt. Linda 18. Slang skuren i avsnitt 6.3.5 och minsta slangpumpar adapter i aluminiumfolie. Håll slangen rakt. Autoklav under 30 minuter.
- Gör 2 liter 0,5x LB-buljong. I nappflaskan, göra 0,5x LB-buljong. Täck nappflaska med folie. Autoklav under 1 timme.
- Gör 70 ml 0,5x LB buljong. Häll buljongen i kontinuerlig odling reaktorn. Placera en omrörare i kontinuerlig odling reaktorn. Täck reaktor med folie och autoklav i 30 minuter.
- Autoclave de torra materialen i 30 min. Se till att linda locket på nappflaskan som gjorts i avsnitt 5 i aluminiumfolie. Håll fäst slang rakt.
- Kontinuerlig kultur set-up:
- Bakteriell cell-suspension.
- Från 12,5% glycerol fryst lager, tallrik färsk E. coli-kloner på 0,5x LB-agar innehållande 100 ug / ml ampicillin. Inkuberavid 37 ° C under 24 h.
- Inokulera en enda koloni i 3 ml 0,5x LB-buljong innehållande 100 ng / ml ampicillin. För varje klon använda biologiska tre exemplar. Inkubera vid 37 ° C med skakning under 22 h.
- Anslut delarna.
- Placera alla autoklaverade material till en biologisk säkerhet skåp och slå ultraviolett ljus på medan media svalnar. När medier har svalnat, tillsätt 0,1% L-arabinos och 100 ng / ml ampicillin till alla 0,5x LB-buljong.
- Packa kontinuerlig odling reaktorlocket och skruva fast reaktorn. Undvik att röra vid provtagningsröret. Packa utfodring kapsylen och skruva på nappflaskan. Undvik att röra vid provtagningsröret.
- Håll 18. Slang kopplad till port ε steril. Un-linda 18. Slangar och slangpumpar adapter.
- Montera en fri ände av 18 i. Slang på en ände av den peristaltiska pumpen röranslutningen. Montera den andra änden av den peristaltiska pumpen röranslutningen till18 i. slang kopplad till port ε av matnings kapsylen.
- Skruva 0,22 um filterenheterna på hamnarna β och δ av kontinuerlig odling reaktorn. Skruva en 0,22 um filterenhet på adaptern av hamn α. Till 0,22 fim filterenhet, passar den fria änden av den 18 i. Slangen.
- Starta kontinuerlig odling.
- I biosäkerhet huva, ympa kontinuerlig odling reaktorn med 100 pl O / N-kulturen som gjorts i avsnitt 7.2.1.1.
- Stäng systemet innan du flyttar kontinuerlig odling i en 37 ° C inkubator. I inkubatorn har en magnetisk omrörarplatta och mini peristaltiska pumpen inrättas.
- Montera den peristaltiska pumpslangen adaptern i den peristaltiska pumpen. Slangar från nappflaskan börjar vid "I" sida och slang som leder till reaktorn startar vid "Out" sida.
- Ställ den peristaltiska pumpen till: "FAST". Starta den peristaltiska pumpen genom att byta till R20; FRAMÅT ". Kontrollera att mediet börjar strömma genom slangen.
- Placera reaktorn på magnetisk omrörarplatta och börja blanda. Kontinuerlig kultur reaktor måste jämvikt under 24 timmar före provtagning.
- Provtagning av den kontinuerliga kulturen. Skruva en 5 ml luer lok sprutan γ hamn och dra upp 4,5 ml av kulturen.
- Använd 500 | il av kulturen för att mäta densiteten (OD 600 nm). Späd celler för att göra 4 x 1 ml kulturer vid OD 600 nm = 0,35.
- Alikvot utspädda kulturer i 1,7 ml mikrofugrör. Upprepa provtagning var 12 timmar i 4 dagar.
- Förbered prover för GC-TOFMS:
- Pellets celler via centrifugering vid max hastighet (16.900 xg) under 2 min. Dekantera supernatanten. Tvätta cellerna med 500 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa det här steget.
- Dekantera supernatant en sista gång, och sedan dränka mikrofugrör med pelleterade celler i flytande kväve tills bubblande stannar. Store prover i -80 ° C frys.
- Bakteriell cell-suspension.
8. Köra seriepassage Batch kulturer för Metabolomics
- Framställning bakteriecellsuspension. Från 12,5% glycerol fryst lager, tallrik färsk E. coli-kloner på 0,5x LB-agar innehållande 100 pg / ml ampicillin. Inkubera vid 37 ° C under 24 h.
- Inokulera individuella kolonier till 3 ml 0,5 x LB-buljong innehållande 100 pg / ml ampicillin. Använd biologiska tre exemplar för varje klon.
- Seriell passage satskulturer.
- Subkultur O / N från 8.1.1 via en 500-faldig spädning i 3 ml LB-buljong innehållande 50 | j, g / ml ampicillin och 0,1% L-arabinos. Subkultur bör ha en OD 600 nm <0,005. Inkubera vid 37 ° C med skakning.
- Kontrollera optiska densiteten (OD 600 nm) vid 2 och 2,5 timmar. Odla celler för att uppnå OD 600 nm = 0,35.
- Subkultur via en 500-faldig dilution i 3 ml LB-buljong innehållande 50 | j, g / ml ampicillin och 0,1% L-arabinos. Subkultur bör ha en OD 600 nm <0,005.
- Kontrollera optiska densiteten (OD 600 nm) vid 2 och 2,5 timmar. Odla celler för att uppnå OD 600 nm = 0,35.
- Provtagning seriepassage satskulturer.
- Med hjälp av steril pincett, placera en 0,22 um membranfilter på toppen av en filterröret. Alikvotera vända 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på filterpapper och sedan på vakuumpump.
- Upprepa tillsats av 1 ml PBS. Överför 1 ml av subkultur från avsnitt 8.2.3 på filterpapper. Härifrån agera snabbt för att få prover till flytande kväve omedelbart. Fylls i 1 min.
- Alikvotera 1 ml PBS på filterpapper för att tvätta provet. Spola snabbt utan att spilla provet över sidorna av filterpapper. Upprepa.
- Använda steril tång plats filter till en 1,7 ml mikrofugrör genom att försiktigt vika filter. Sänk mikrofugrör i flytande kväve tills bubblande stannar. Butiks prov i -80 ° C frys.
9. metabolitanalys & Processing
- Ship 3 prover per klon på torris till en metabolomik core facility för provbearbetning, analys och normalisering av GC-TOFMS.
- För varje prov bestämma medelvärde, median, standardavvikelse och variationskoefficient över metaboliter, med hjälp av replikera data.
- För statistisk analys, koda en QA pipeline manuellt med villkorssatser och repetitiva avrättningar 26 för att avlägsna metaboliter som inte följer angivna villkor.
- För skick 1, ta bort metaboliter där mer än 2 prover har noll överflöd. Ta interna standarder från metabolomic profiler.
- För villkor 2, ta bort de metaboliter som inte finns i cellerna av intresse. Här, ta bort följande metaboliter indol 3-acetat, dihydroabiet ic-syra, nonadekansyra, salicylsyra, salicylaldehyd, kolesterol, fenol, 1-monostearin, oktadekanol, 1-monopalmitin, dodekan, dodekanol, 1-hexadekanol, 5-metoxitryptamin, bensoesyra, pentadekansyra, fosforsyra, pelargonsyra, palmitinsyra syra, kaprinsyra, hydroxylamin, stearinsyra, myristinsyra, maleimid, levoglukosan, och 4-hydroxismörsyra.
- För skick 3, ta bort dessa metaboliter vars variationskoefficient är större än 1.
- Fånga globala metabolomik effekter genom att titta på metabolit relativa förekomsten.
- Skapa en visuell representation av median metaboliten överflöd per klon för varje metabolit (Figur 6).
- Identifiera avvikande värden genom att observera klon-metabolit par frekvenser.
- Beräkna Z poäng för varje medianvärdet för varje metabolit i en klon. Beräkna z poäng med hjälp av följande ekvation:
/52854/52854eq7.jpg "/> [7]
Obs: Term X MC representerar överflöd nivån för en specifik metabolit för en specifik klon. Term μ C representerar medelvärdet av alla kloner för en specifik metabolit. Term σ C är tillhörande standardavvikelse. - Skapa en visuell representation av data i vilka extremvärden är markerade (data ej).
- Beräkna Z poäng för varje medianvärdet för varje metabolit i en klon. Beräkna z poäng med hjälp av följande ekvation:
Representative Results
Alla prover som användes för att fastställa de öppna läsramar (ORF) som valts ut i denna studie samlades in från Starbuck Island, Site 7 (STAR7) och Caroline Atoll, Site 9 (CAR9) i södra Line Islands. Uppskattningsvis 100 liter havsvatten från dessa platser samlades under korallgränsskikt med hjälp av länspumpar, som beskrivits tidigare 5. Innehållet i pumparna var föremål för fraktion genom stora porer filter för att avlägsna små eukaryoter och därefter koncentrerades med användning 100 kDa tangentiellt flödesfilter vilket innebär att endast mikrober och virus lika partiklar (VLP). För att separera VLP var återstående havsvattnet passera genom 0,45 um filter resulterar i virome. Kloroform infördes till denna virala fraktion att stoppa tillväxt av eventuella kvarvarande celler och lagrades vid 4 ° C.
VLP renades med användning av cesiumkloridmetoden, där densitetsgradienter separat genom centrifugering och möjliggör återvinning av virjoner vid ~ 1,35 g / ml till 1,5 g / ml 3. Viral DNA extraherades med användning av en CTAB / fenol: kloroform-protokollet och förstärks via flera förskjutningsförstärkning med hjälp av phi29 reagens. Sekvensering av virome åstadkoms med kommersiellt tillgängliga teknologin Pyrosequencing.
Bioinformatik används i behandling och val av virala ORF för denna studie är följande. Tre före processteg användes på CAR9 och STAR7 virus metagenomes. Först offentliga programvara som används för att ta bort taggsekvenser som resulterade från förstärkning av den virala DNA före sekvensering 27. För det andra, var vanliga sekvense artefakter såsom sekvens dubbletter och lågt kopietal filtreras bort av datamängden via en ytterligare bioinformatik program 28. Slutligen har avlägsnande av främmande sekvensen förorening 29 utförs för de sekvenser som hade ≥ 90% täckning och ≥ 94% identitet med sekvenser i följande databaser: RefSeq virus genomer; Människa - Referens GRCh37; Människa - Celera Genomics; Människa - Craig Venter (HuRef); Människa - Seong-Jin Kim (Korean); Människa - kromosom 7 version 2 (TCAG); och Human - James Watson, Yanhuang (YH, asiatiska), yoruba (NA18507, svenska) referenssekvenserna 21. Efter dessa processer, sekvenser från CAR9 proverna uppgick 591.600 och STAR7 sekvenser uppgick 939.311. Dessa sekvenser laddades upp på MGRAST och monteras via assembler programvaran med standardinställningarna. Contigs översattes till 6 läsramar och förmodade öppna läsramar (pORFs) identifierades med hjälp av skript, som tidigare beskrivits 21.
För att identifiera okända ORF ett antal likhet baserade sökningar utfördes för att avlägsna ORF med känd funktion. I korthet användes följande sökningar utförs med sina motsvarande sökkriterier 21:
- Betydande likheten mellan ≥ 95% identitet över ≥40 baspar (bp) av MGRAST BLAT i M5NR databas.
- Betydande likhet (e-värde ≤ 0,001) av TBLASTN mot alla offentliga metagenomes in Mitt Metagenome Database Resurs.
- Betydande likhet (e-värde ≤ 0,001) av BLASTP och TBLASTN mot NR databas.
- Betydande likhet (e-värde ≤ 0,001) av RPS-BLAST mot konserverade Domain Database.
- Protein översättningar från en utvald del av varje dataset jämfört mot lösta proteinstrukturer i Protein Data Bank.
- Beräkning av dinukleotid frekvenser med användning Dinukleotid signaturer paketet.
De erhållna pORFs utformades för uttryck i E. coli med hjälp av allmänt tillgänglig gen design mjukvara. Back-translation av de amino-syrasekvenser som användes ett universellt kodonanvändning Tabell utformad för att rymma uttryck i E. coli med en minsta användning tröskel på 2%. Restriktionsenzym-igenkänningssekvenss för BamHI och Hindlll uteslöts från sekvenserna för att underlätta kloning. Ett utomstående företag syntetiserade den konstruerade gensekvenser 30 och sedan ORF klonades in i en medel kopietal pBAD promotorvektor, pEMB11 via standardrestriktionsenzym kloning. Alla kloner transformerades in i E. coli K-12 stam BW 27784 23.
Multi-fenotyp analysplattorna (MAP)
En hög genomströmning och robust programvara pipeline var belånade för analys av kartor, PMAnalyzer 24. Rörledningen har utvecklats i en Linux-server miljö och utför olika åtgärder inklusive: tolkning av optiska densitets filer, formatera data i läsbara textfiler, förbehandling av tillväxtkurvor för kvalitetssäkring (QA), och utför matematiska modelleringsmetoder för att analysera tillväxtkurvor . De primära modellerings skript utvecklades i Python version 2.7.5 för att göra användningen av PyLab modulen.
(Figur 2A). Råa tillväxtkurvor jämfördes med logistiska tillväxtkurvor för att bestämma om programmet PMAnalyzer noggrant parametriserade och modellerade klonen tillväxt under experiment (data ej visade). För ytterligare information om noggrannheten och giltigheten av kartorna och PMAnalyzer se Cuevas et al. 24
Efter validering av metoden, var MAP data analyseras med hjälp av flera parametrar, såsom maximal tillväxthastighet (μ max) och tillväxtnivån (GL), som tillhandahålls av rörledningen bearbetning. Jämförande visualisering av tillväxtkurvor används ofta för tillväxt tolkning av data; emellertid, det antal kurvor som kan visualiseras i en tid för jämförelse har begränsningar. För att analysera ett stort antal tillväxtkurvor samtidigt har värme Map härledde tomter bönföll att jämföra tiotals kloner odlas på en enda substrate mot att villkoren genomsnittliga svar (Figur 2B). Inflytandet lämnade av överuttryck av en ny fagprotein observeras genom förändringar i kurvan parametrar, särskilt: lagfas, exponentiell fas och maximal avkastning biomassa (asymptote). Som ett exempel, är den branta stigningen från fördröjningsfas i exponentiella fasen modelleras i tillväxtkurvan för kapsidproteinet (Figur 2A) återges av en snabb förändring i färgintensitet från svart till vitt för samma klon i den dynamiska plotdiagrammet i figur 2B .
För att få en övergripande bild av klon fördelning över substrat, var fenotypiska klassificeringar härrör från GL används (Figur 3). Här är de fyra fenotyperna är separata i fyra diagram där höjden på varje stapel representerar antalet kloner som visar att fenotypen för ett specifikt substrat. Avvikelser i uppgifterna redovisas som kloner som faller in i "vinst på funktion "eller" förlust av funktionskategori ". Extremvärden kan sedan sökas individuellt och undersökte närmare experimentellt. Dessutom erkänner global analys substrat fördomar i analysen. Substrat såsom fenylalanin, äppelsyra, och glycin ledde till en "ingen tillväxt" klassificering. Underlag som konsekvent faller in i någon tillväxt klassificering, över alla kloner, inte tungt viktade i nedströms funktionell karakterisering.
Metabolomik
De kataboliska produkter från kloner som uttrycker okända fag-gener identifierades med hjälp av metabolomik. I korthet, kloner odlas under antingen en kontinuerlig odling eller seriepassage i satsodlingsmiljö innan de skickas ut för GC-TOFMS analys vid en metabolomik core facility. För mer information om provbearbetning, analys, och normalisering för GC-TOFMS som genomförs av den valda kärnanläggningen se Fiehn et al. 31 Briefly, 1 ml kall extraktionslösningsmedlet tillsätts till varje prov, varefter proverna virvlades och ultraljudbehandlades i ett kallt bad under 5 minuter. Prover slutligen centrifugeras och hälften av provet dekanteras och torkas ned för analys. Extrakt renas och spetsade med interna återhållningsindexmarkörer innan det lastas ombord gaskromatografen och därefter överförs till masspektrometer. Data från varje prov analyseras, så att signalnivåerna för alla detekterade signaler i kromatogrammet redovisas. För normalisering, är det överflöd av toppar för varje prov summeras och den totala topp abundances medelvärdes mellan alla prover i uppsättningen. Metabolit bestånd per prov divideras med provets topp överflöd och sedan multipliceras med den genomsnittliga topp överflöd av provuppsättning. Den resulterande data används för analys av metabolomik i forskningen diskuteras.
Validering av metabolomik reproducerbarhet var skyldig attbestämma lämplig provstorleken för varje odling metod. För att detektera precision ses inom prover och variationen ses över prov storlekar standardfelet av medelvärdet (S M) för både n = 3 och n = 6 dataset granskades (Figur 5B). Oberoende av kontinuerlig odling (CC) provstorleken, hade mindre än 1% av uppgifterna en S M ≤ 1,5. Median S M s var 221 och 300, och värdena varierade från 0 till 7,55 x 10 5 och 3,74 x 10 5, för n = 3 och n = 6 respektive. S M s beräknades också för varje uppsättning prov replikerar i den seriella kultur (SC) -metoden. Återigen hade mindre än 1% av uppgifterna en S M ≤ 1,5, en median S M 137, och en rad 0-3,51 x 10 5. För att jämföra S M distributioner mellan varje provuppsättning (CC n = 3 vs . CC n = 6, CC n = 3 vs. SC n = 3, och CCS n = 6 vs. SC n = 3) en permutationstest utfördes. Den distribmepannor av antingen kontinuerlig odling S M värden dataset var inte signifikant skiljer sig från fördelningen av de serie kultur S M värden (p-värde = 0,0). Men fördelningen av S M värden för kontinuerlig odling n = 3 uppgifter var signifikant skiljer sig från S M värdena för kontinuerlig odling n = 6 data (p-värde = 1,908804 x 10 -49). Slutligen, var variationskoefficienten per metabolit jämfört före och efter genomförandet av en steg för kvalitetssäkring (QA) (Figur 5C). Totalt har 210 metaboliter avlägsnas efter genomförandet av kvalitetssäkrings rörledningen (40% av uppgifterna). Mindre än 1% av de borttagna uppgifterna hade en metabolit överflöd av noll, ~ 2% var interna standarddata, ~ 5% var uppgifterna från metaboliter aldrig tidigare observerats i E. coli, och de återstående metaboliter (> 30%) hade en variationskoefficient som är större än ett.
Som med kartorna analys, global observations upprättades en första uppfattning om djupet av informations metabolomik erbjudanden. För att få en helhetsbild, kloner hierarkiskt grupperade baserat på deras relativa metabolit abundances med information om klon-metabolit profiler, potentiella kloner med tillhörande funktioner och klon metabolit extremvärden (Figur 6). För att belysa protein funktioner, metaboliter separeras och grupperas baserat på gemensamma metaboliska vägar. Med användning av denna analys med preliminära resultat, var det uppenbart att metabolomik kan separera gener från olika klasser (Figur 6, markerade kloner). Dessutom var outlier identifikation med data metabolomik bestämmas genom beräkning av standard poäng (z scores) för varje klon-metabolit par. För att säkerställa statistisk signifikans var extremvärden definieras som en klon-metabolit par med ett Z poäng värde av 2, som står för endast 5 procent av data (data ej visade).
ether.within-page = "always"> 
Figur 1. Definitioner av fenotyp klassificeringar. (A) Förhållandet mellan tillväxtnivån (GL) och maximal tillväxttakt. Datapunkter inringade i rött representerar tillväxtkurvor visar liten eller ingen substratutnyttjandet. (B) Boxplot representation definierar tröskel tillväxt baserad på fördelningen av tillväxtkurvor med en minimal tillväxt (<0,15 OD / h). (C) Variansen och standardavvikelse för GL beräknas för substrat D-galaktos. Korta streckade linjerna representerar två standardavvikelser från medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
highres.jpg "/>
Figur 2. MAP validering via precision och differentiering. (A) Tillväxtkurvor för kommenterad strukturella (kapsid) och metaboliska klonerna (tioredoxin), två nya metaboliska kloner (EDT2440, EDT2441), och den genomsnittliga svars av kloner odlas på sackaros, D- galaktos och D-mannos i kartorna. Blå linjer visar standardfelet sett mellan replikera data (n = 3). (B) Tillväxtkurvor för 47 olika kloner representeras som värmekartor för sackaros, D-galaktos och D-mannos. Den kommenterad strukturella (grön cirkel) och metabola kloner (orange cirkel), två nya metabola kloner (mörka och ljusa blå cirklar), och den genomsnittliga svar (röd cirkel) är markerade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
pload / 52.854 / 52854fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 3. Klon fördelning för varje fenotyp över flera substrat. Fenotypen-klon räknas 47 kloner över 72 kol-specifika tillväxtbetingelser. Tabell ger direkta räknas för varje fenotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Diagram detailing konstruktionen av den kontinuerliga odlingsapparaten. (A) steg som används för att bygga hamnar α-γ av den kontinuerliga odlingsreaktorn, (B) steg används för att bygga ut flödesport av den kontinuerliga odlingsreaktorn, och (C ) stegen för att bygga hamnar δ och ε av kontinuerlig odling nappflaska. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Jämförelse av Phenomic metoder som presenteras. (A) arbetsflöde för framställning av Multi-fenotyp analysplattorna (kartor), kontinuerliga kulturer och serie kulturer. (B) Andelen Medelfel av medelvärdet (S M) räknas både n = 3 och n = 6 urvalsstorlekar för kontinuerlig odling (CC) och seriekultur (SC) framställningsmetoder för metabolomik. Y-axeln är på en log-skala. (C) Fördelningen av variationskoefficienter (CV) per metabolit, före och efter genomförandet av kvalitetssäkrings pipeline för metoden (CC) kontinuerlig odling.g5highres.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. metabolomic profiler av kloner odlas i kontinuerlig odling. Median metaboliten förekomster för en uppsättning av metaboliter ritas upp för 84 kloner odlas i kontinuerliga kulturer. Metabolit profiler för kommenterade strukturella (Capsid) och metabola kloner (thioredoxin), två nya metabola kloner (EDT2440, EDT2441), och den genomsnittliga metabola svar är markerade i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förening | Kol | Kväve | Svavel | Fosfor |
| Glycerol | - | 0,40% | 0,40% | 0,40% |
| Ammoniumklorid | 9,5 mM | - | 9,5 mM | 9,5 mM |
| Natriumsulfat | 0,250 mM | 0,250 mM | - | 0,250 mM |
| Magnesiumsulfat | 1,0 mm | 1,0 mm | - | 1,0 mm |
| Kaliumfosfat | 1,32 mM | 1,32 mM | 1,32 mM | - |
| Magnesiumklorid | - | - | * | - |
| Kaliumklorid | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
| Kalciumklorid | 0,5 | iM | 0,5 | iM | 0,5 | iM | |
| Natriumklorid | 5 mM | 5 mM | 5 mM | 5 mM |
| Järnklorid | 6 ^ M | 6 ^ M | 6 ^ M | 6 ^ M |
| L- arabinos | 0,10% | 0,10% | 0,10% | 0,10% |
| MOPS pH 7,4 | 1x | 1x | 1x | 1x |
Tabell 1. Föreningarna och koncentrationerna av de olika basala media som används i kartorna. * 1,0 mM magnesiumklorid är substituerad. 1x MOPS = 40 mM MOPS, 4 mM Tricine.
| Kolsubstrat | Kväve substrat | Svavel substrat | Phosphorus substrat | ||
| 2 deoxi-D-ribos | 2-deoxi-D-ribos | 1-butan-sulfonsyra | adenosin-5-monophoshate | ||
| 4 hydroxi-fenylättiksyra | acetamid | acetylcystein | beta-glycerofosfat | ||
| ättiksyra | adenin | D-cystein | creatinephosphate | ||
| adenosin-5-monofosfat | adenosin | D-metionin | D-glukos-6-fosfat | ||
| adonitol | allantoin | dietyl-ditiofosfat | dietyl-ditiofosfat | ||
| alfa-D-glukos | beta-fenyletylamin | DL-etionin | DL-alfa-glycerofosfat | ||
| alfa-D-laktos | biuret | glutation | kaliumfosfat | ||
| alfa-D-melebiose | cytidin | isetionsyra | natriumpyrofosfat | ||
| citronsyra | cytosin | L-cysteinsyra | natrium tiofosfat | ||
| D-alanin | D-alanin | L-cystein | |||
| D-arabinos | D-asparagin | L-djenkolic syra | |||
| D-arabitol | D-aspartat | L-metionin | |||
| D-asparagin | D-cystein | magnesiumsulfat | |||
| D-aspartat | D-glukosamin | metansulfonsyra | |||
| D-cellubiose | D-glutaminsyra | N-acetyl-DL-metionin | |||
| D-cystein | DL-alfa-amino-N-smörsyra | N-acetyl-L-cystein | |||
| D-fruktos | D-metionin | kalium-tetra-thionate | D-galaktos | D-serin | natriumtiosulfat |
| D-glukosamin | D-valin | sulfanic syra | |||
| D-glukos | gamma-amino-N-smörsyra | taurin | |||
| D-glukos-6-fosfat | glycin | taurocholsyra | |||
| D-glutamat | guanidin | tiourea | |||
| D-mannos | histamin | ||||
| D-raffinos | inosin | ||||
| D-ribos | L-alanin | ||||
| D-salicin | L-arginin | ||||
| D-serin | L-asparagin | ||||
| D-trehalos | L-citrullin | ||||
| D-xylos | L-cystein | ||||
| dulcitol | L-glutaminsyra | ||||
| glycerol | L-glutamin | ||||
| glycin | L-glutation | ||||
| i-erytritol | L-histidin | ||||
| inosin | L-isoleucin | ||||
| L-alanin | L-leucin | ||||
| L-arabinos | L-lysin | ||||
| L-arabitol | L-metionin | ||||
| L-asparagin | L-ornitin | ||||
| L-aspartat | L-fenyl-alanin | ||||
| L-cysteinsyra | L-prolin | ||||
| L-cystein | L-pyro-glutaminsyra | ||||
| L-fukos | L-serin; L-treonin | ||||
| L-glutaminsyra | L-tryptofan | ||||
| L-glutamin | L-valin | ||||
| L-isoleucin | N-acetyl-D-glukosamin | ||||
| L-leucin | putrescin | tiourea | |||
| L-metionin | tymidin | ||||
| L-fenylalanin | tymin | ||||
| L-pyro-glutaminsyra | tyramin | ||||
| L-ramnos | tyrosin | ||||
| L-serin | uridin | ||||
| L-sorbos | |||||
| L-treonin | |||||
| L-tryptofan | |||||
| L-valin | |||||
| L-xylos | |||||
| laktat | |||||
| laktulos | |||||
| malat | |||||
| myo-inositol | |||||
| oxalsyra | |||||
| kaliumsorbat | |||||
| propionsyra | |||||
| putrescin | |||||
| kininsyra | |||||
| natriumpyruvat | |||||
| natriumsuccinat | |||||
| sackaros | |||||
| tymidin | |||||
| xylitol |
Tabell 2. Förteckning över substrat som används i MAP experiment.
Discussion
Här presenterar vi Phenomic metoder för funktionell karakterisering av förmodade fag-gener. Tekniker inkluderar en utvecklad analys i stånd att övervaka värd anabola metabolism, Multi-fenotyp analysplattorna (kartor), utöver den etablerade metoden för metabolomik, kan mäta effekter på katabola metabolism. Vi gav ytterligare verktyg för att hantera stora datamängder till följd av denna teknik, vilket möjliggör hög genomströmning bearbetning och analys 24. Slutligen, genom att jämföra en kommenterad fagkapsiden protein, fag thioredoxin, två förmodade metabola fag-gener, och den genomsnittliga experimentella respons vi föreslår olika strategier för att tolka både dataset och genprodukter klasser, med betoning på identifiering av fenotypiska trender och identifiering av extremvärden.
Som nämnts, bägge metoderna mäter kvantitativt bara hälften av värdmetabolism. Att tolka den relativa funktionen hos någon av denya proteiner under utredning, data från båda metoderna som krävs för att styrka funktion. Även om detta inte är ett fokus för vårt nuvarande manuskript, är datautgångarna från varje Phenomic metod genomgår kombinations analyser som fokuserar på klustring tekniker såsom slumpmässig skog och huvudkomponentanalys. Dessutom måste hypoteser som härrör från den kombinerade analysen därefter validerats av traditionella genetiska metoder.
Slutligen, de metoder som presenteras är starkt påverkad av bakteriell fysiologi och därför följa samma normer. När företaget antingen metod, överväganden måste göras för att garantera oberoende, klon grupper experimenterat med; förorening förhindras; en enda variabel testas; och lämpliga kontroller genom sprang samtidigt. Underlåtenhet att ta hänsyn till dessa punkter kommer att leda till oklara resultat, liknande de fysiologiska analys.
Fler fenotyp analysplattor(MAP)
Utvecklingen av MAP ger en hög genomströmning och anpassningsbar analys jämfört med dagens teknik (Figur 5A och tabeller 1,2). Analysen använder förnödenheter, utrustning och grundläggande tekniker som är tillgängliga i alla mikrobiologi laboratorier. Införlivandet av en beräknings rörledning, PMAnalyzer 24, för efterföljande bearbetning och analys av data ger snabb tolkning av data. Dessutom kan både experimentella och analytiska aspekter av tillvägagångssättet lätt justeras eller anpassat för kundanpassade ändamål. Till exempel, om en stor del av uppgifterna inte klarar filtrering som beskrivs i avsnitt 4, kan man manuellt gå igenom tillväxtkurvorna för att identifiera problem. Om problemet uppstår på grund av stränga filterparametrar, kan justeringar av skriptet göras. Alternativt, om problem i samband med den experimentella processen (dvs långvarig kondens, felaktig överföring av bakteriell cells, etc.) sedan ytterligare replikat kan lätt upprepas.
Som beskrivits i al. Cuevas et 24, är PMAnalyzer en enda bash program skrivet som en wrapper skript som exekverar pars och analys skript som en sammanhållen, automatiserad pipeline. Alla skript är fritt tillgängliga från en Git-arkiv vid 25 genom att ta medianvärdet för varje tidpunkt över tre exemplar uppgifter, och därefter parameterizes logistikkurvan för att erhålla fördröjningstiden, högsta tillväxttakten, asymptote, och en ny term, Tillväxt nivå. Medianvärdet valdes över medelvärdet i vår studie för att minska effekten av stora extremvärden, emellertid skriptet kan lätt anpassas för att beräkna medelvärdet av likadana uppgifter. På grund av minskad variation (SE) sett över replikera data (Figur 2A) vi upprätthålls användningen av medianen i PMAnalyzer för montering en logistisk kurva. Dessutom avskurna för tillväxt i denna studie (GL ≥ 0,4) var DETErmined genom att jämföra hur data separerade över tillväxtnivå och maximal tillväxthastighet (Figur 1A, B). Beroende på instrument och modellsystem som används denna term kan variera, kräver omdefiniering av detta avbröt värde.
En stor fördel med vår analys är förmågan att jämföra fenotyper med en enda parameter som kännetecknar övergripande mikrobiell tillväxt, som vi definierar som tillväxtnivån (GL). GL är en harmoniska medelvärdet, och därför lindrar effekterna av stora avvikelser i uppgifterna. Användningen av ett harmoniskt medelvärde med förskjutna logistik utrustat värden för att ge en översikt över tillväxten kommit fram till genom trial and error. Andra metoder försökt att skilja tillväxten ingår: tid det tog att nå specifika kurvparametrar (halv μ max, μ max, och bärförmåga), determinationskoefficienten (R 2), och kombinationer av R 2 multiplicerat med särskilda kurvan parametrar. Med hjälp av ett harmoniskt medelvärde med skiftatlogistic-fit värden för GL under förutsättning att största utbudet att utvärdera tillväxt, så det blev metod. Ett övervägande att notera är att dynamiska tillväxtkurva mönster har potential att försvinna vid användning av en enda parameter eller en monterad modell. Till exempel, de individuella kurvan parametrar hos logiska kurvan och GL är oförmögna att representera bifasisk tillväxt. I en enkel kol miljö, denna effekt på tillväxt innebär förmedling av det virala proteinet på endera omvandlingen av substratet eller förskjutning i substratanvändning. Ytterligare effekter potentiellt förlorade när de inte överväger flera tillväxtparametrar inkluderar: långvarig fördröjning, föreslår en ökad belastning av viral maskiner eller produkter; snabbt accelererande exponentiell fas, vilket tyder på virala proteiner kopplade till värd energiproduktion vägar; eller högre nivåer av bildandet av biomassa, vilket innebär viral stöd i värdnäringsupptag och anabolism (data visas ej). Således, rita begynnande tillväxtkurvor ( När man överväger de olika svaren bidragit med strukturella och metabola gener i kartorna är det konstateras att de olika substratklasser i fråga ger störst bevis för proteinfunktion. Till exempel är metaboliska proteiner ofta förknippade med förvärv av begränsande näringsämnen, som är ospecifik för att vara värd centrala metabolismen 16,32. Preliminära MAP experiment avslöjar att kloner som härbärgerar förmodade metaboliska fag gener har en ökad fördröjningsfas när den odlas på centrala metabolismen kolkällor (Figur 2A). Omvänt, kloner som bär förmodade strukturella gener, som kräver stora delar av värd energi- och dNTP pooler, resultera i ett falskt positivt svar på tillväxt för procentRAL och aminosyrametabolismen kolsubstrat. Detta beror sannolikt på grund av ansamling av olösliga proteiner resulterar i värd filamentation och / eller inklusionskroppar, som observerats via mikroskopi (Figur 2A och data visas ej). Medan ytterligare analys krävs för att bekräfta dessa preliminära resultat, kartorna kan hämta fenotypiska svar som korrelerar till en hypotes funktioner specifika fag gen klasser. Förutom att klarlägga okända virusproteiner, kartorna en ny resurs för att undersöka den funktionella och metabolisk mångfald av en enskild bakterie eller en gemenskap av bakterier. MAP komponenter är konstruerade för enkel förändring för att stödja framväxten av en rad bakterier; inklusive marin, auxotrofa och anaeroba mikrober. För att underlätta dessa ansträngningar definierade basala och pre-tillväxtmedia kräver ytterligare eller justerade kemiska ämnen vid en annan bakterieart kan stödjas i kartorna.En anmärkning i denna användning av kartorna är att upprätthålla definierade medier, som förbjuder användningen av ingredienser såsom trypton, jästextrakt och pepton. Metabolomik Området för metabolomik är beroende metabolit databaser, som omfattar isolerade metaboliter identifieras genom masspektrometri. Kärnan anläggning som valts här har en av de största metabolomik databaser. Intressant, mer än hälften av de metaboliter som härrör från våra experiment var oidentifierbara (~ 65%), medan andra hade aldrig tidigare spelats in i vår värd, Escherichia coli (exempel: Indol 3 ättiksyra 33, salicylsyra 34, och dihydroabietinsyra 35). Detta faktum kan tillskrivas antingen en stark slagsida av databasen mot växtmetaboliter, eller specifika proteiner under utredning. Oavsett, är resultatet ett begränsat antal kända metaboliter som datarepresentation och analys. I fuTure, flera metabolomik metoder som använder olika databaser skulle möjliggöra större metabolit täckning. För närvarande både kända och okända metaboliter används när man jämför och kontrastera våra nya virusproteiner. Med hjälp av denna metod, vi hypotesen att kloner som härbärgerar funktionellt liknande proteiner kommer att dela en ökad likhet i deras fullständiga metabolomic profil. Preliminär metabolomik analys visade att medan strukturella och metabola gener inte tydligt åtskilda från varandra, de gener som uppvisar liknande effekter på värden när uttryckt korrelerar (Figur 6). Till exempel, de kommenterade kapsidgenen kluster tätt med de förmodade metabola gener lyfts fram i denna studie, EDT2440 och EDT2441. Undersökningar som använder en allmänt tillgänglig trans topologi och signalpeptid prediktor programmet visade tecken att båda förmodade metabola gener hyser en enda transmembrandomän. Intressant 5 av the 9 kloner i det första klustret gruppen (mest vänstra delen av dendrogram) har förutspått transmembrandomäner med samma topologi programmet. Ytterligare undersökningar behövs, är det emellertid troligt att metaboliterna närvarande vid överuttryck av dessa kloner är förknippade med cellulär stressrespons till följd av membran eller strukturella bördor. Detta bevis stöder att medan uppgifter metabolomik besitter en ökad mängd av buller, är metoden kan lyfta fram signaler som skiljer allmänna effekter av gener, både inom och mellan en gen klass. För att avgöra om metoden är kapabel att extrahera ut specifik information av geners funktion, var metaboliter grupperade i specifika metaboliska vägar. Hypotesen är, om en klon påverkar metaboliter som är specifika för en enda väg, då överuttryckta genen är aktiv i den vägen. Före etableringen av vår pipeline metabolomik kvalitetssäkring, visade preliminära data som över end underrepresenterade metaboliter var typiskt "okända", som ger lite information om de vägar som de är associerade med (data visas ej). Förbehandlade metabolomik uppgifter avslöjar emellertid att majoriteten av metaboliten profiler är likartade och endast ett begränsat antal okända och kända metabolit abundances varierar mellan kloner, exempelvis putrescin och uracil (Figur 6). För att ge större upplösning av proteinfunktion ansträngningar görs för att experimentellt jämföra de nya fag gener mot kända fag-gener, som kan användas för att fylla i "hål" i metabolit baserade funktionell karakterisering. Med hjälp av denna teknik ger den tilldelade funktionen kända virusgener en referens för funktionen av de okända gener. Icke desto mindre är den begränsande faktorn för metabolomic analys storleken och relevansen av databasen. För att korrigera för dessa begränsningar, metabolomic databaser relatable till denna forskning behöver utvecklas; sådansom en databas av metaboliter och deras abundances specifika för ASKA samlingen av E. coli-kloner i vilka en enda ORF är överuttryckt 36. Bevis för behovet av sådana databaser lämnades under 2013 när forskare vid Lawerence Berkeley National Laboratory samman den första heltäckande databas av metaboliter som är specifika för hela muterade bibliotek av modell bakterier 37. Denna forskning tillgänglig ny inblick i gener som krävs för användning av särskilda metaboliter, avslöjar tydligt samband mellan fenotyp och genotyp. När man överväger metabolomik som ett verktyg, är det viktigt att definiera regimen behandling följde på kärnanläggningen. En artefakt av de flesta experimentella procedurer är dagen till dag variansen i samband med instrumenten för användning. Till dags dato alla GC-MS-analys genomför användningen av interna normer som ingår i varje analysomgång; dock tillsättning av projektspecifika interna prover </ Em> sprang varje dag av experimenterande bort ytterligare varians. Dessa överväganden måste åtgärdas tidigt för att undvika normaliseringsproblem och fördomar. En annan lösning är att behandla alla prover vid en kärnanläggningen på samma dator och som ett enda parti, ett alternativ tillgängliga vid varje kärnanläggningen. De olika verktyg både infördes och åter utforskas i detta manuskript tillhandahålla nya medel för att screena och karakterisera funktionellt okända fag-gener. Enkelheten och anpassningsförmågan hos de experimentella tekniker med effektivisera användningen av beräkningsenheter säkerställer dessa metoder kan tillämpas på ett brett spektrum av forsknings strävanden och fält. Vårt mål är att Phenomic metoder som presenteras här kommer att hjälpa ytterligare undersökningar av nya fagproteiner förutom system som är lika funktionellt odefinierad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Sterivex Filter | Fisher Scientific | SVGP01050 | Millipore |
| 0.22 µm Millex Filters | Fisher Scientific | SLGV033RS | Millipore |
| 0.22 µm SteriCap Filter | Fisher Scientific | SCGPS02RE | Millipore |
| 0.22 µm Omnipore membrane filters | Millipore | JHWP02500 | Millipore |
| 96-well micro-titer plates | VWR | 82050-764 | Standard F-Bottom 96 well Microplates |
| 2 ml 96-well plate | Fisher Scientific | ||
| Adhesive seal plate film | Sigma-Aldrich | Z369667 | |
| 2 L Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-70 | |
| 125 ml Nalgene square bottles | Cole Parmer | T-06040-50 | |
| 1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon | Cole Parmer | EW-45509-04 | |
| Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. | Cole Parmer | EW-45500-30 | |
| Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. | Cole Parmer | EW-45500-34 | |
| Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing | Cole Parmer | EW-45505-31 | |
| Male Luer with lock ring x female Luer coupler | Cole Parmer | T-45508-80 | |
| Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD | Fisher Scientific | 6149-0002 | |
| Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD | SaniPure | AR400002 | |
| Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID | SaniPure | AR400007 | |
| Variable flow mini pump (peristaltic pump) | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Magnetic stirrer | Velp Scientifica | F203A0160 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 14-512-141 | Millipore* Filter Forceps |
| Multi-plate spectrophotometer plate reader | Molecular Devices Analyst GT | ||
| Filter manifold | Fisher Scientific | XX10 025 02 | |
| Software: | |||
| Python version 2.7.5 | http://www.python.org/ | ||
| PyLab module | http://wiki.scipy.org/PyLab | ||
| R version 3.0.1 | http://www.r-project.org/ | ||
| reshape2 library | http://had.co.nz/reshape | ||
| ggplot2 library | http://ggplot2.org/ | ||
| Gene Composer | PSI Tech Portal | http://www.genecomposer.net | |
| Services: | |||
| West Coast Metabolomics Center | UC Davis | http://metabolomics.ucdavis.edu | |
| DNA 2.0 | https://www.dna20.com | ||
References
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).
- Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).
- Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).
- Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113 (2), 171-182 (2003).
- Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. , Oxford Univeresity Press. (2006).
- Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).
- Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).
- Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).
- Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424 (6950), 741 (2003).
- Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).
- Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).
- Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).
- Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).
- Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).
- Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).
- Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).
- Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).
- Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).
- Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. , (2014).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
- Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
- Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).
- Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6 (3), e17288 (2011).
- Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4 (9), e7002 (2009).
- Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).
- Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).
- Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).
- Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).
- Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).
- Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).
- Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).
