Introduction
Elektroretinogramm (ERG) ist eine gut etablierte Technik, die verwendet werden können, um die elektrische Aktivität der Netzhaut durch Licht ausgelöst aufzuzeichnen. Die ERG-Signal wird hauptsächlich durch Spannungsänderungen durch radiale Ströme verursacht (entlang der Achse der Photorezeptoren und bipolare Zellen) in der Widerstands Extrazellularraum der Retina fließenden Strom erzeugt wird. Das erste Signal ERG wurde 1865 von Holmgren von der Oberfläche eines Fischauge 1 aufgezeichnet. Einthoven und Jolly 1908 2 unterteilt den ERG Reaktion auf das Auftreten von Licht in drei verschiedenen Wellen, a- genannt, B- und C-Wellen, die jetzt bekannt sind, um im Wesentlichen die Aktivität von Photorezeptoren widerspiegeln, ON bipolaren Zellen und Pigmentepithel Zellen, die jeweils 3-8. ERG aus den Augen der narkotisierten Tieren oder Menschen (in vivo) mit Mikroelektroden aufgezeichnet werden, aus isolierten Augen Vorbereitung 9, in isolierten intakten Netzhaut (ex vivo) 3,10-15 oder über bestimmte Netzhautschichten (lokaleERG) 4,16. Von diesen ist die in vivo ERG derzeit die am häufigsten verwendete Methode, um die Funktion der Retina zu bewerten. Es ist eine nicht-invasive Technik, die für diagnostische Zwecke verwendet werden kann oder um das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen bei Tieren oder Patienten zu folgen. , In-vivo-ERG-Aufnahmen erzeugen jedoch eine komplizierte Signal mit mehreren überlappenden Komponenten, die oft von äußeren Augen physiologische Geräusche (zB Atmung und Herztätigkeit) kontaminiert.
Lokale ERG kann verwendet werden, um das Signal über bestimmte Schichten der Netzhaut aufzuzeichnen, aber es ist die invasive und hat die niedrigste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu den anderen ERG Aufzeichnungskonfigurationen. Lokale ERG ist auch technisch anspruchsvoll und erfordert teure Ausrüstung (zB Mikroskop und Mikromanipulatoren). Transretinal ERG von der intakten, isolierten Netzhaut (ex vivo ERG) bietet einen Kompromiss zwischen in vivo und lokale ERG Methoden, die stabil und high SNR Aufnahmen von intakter Netzhaut von Tieren oder Menschen 17. Vor kurzem wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Stäbchen und Zapfen Photorezeptorfunktion in Säugetieren, Primaten und menschliche Netzhaut 18-20 studieren. Darüber hinaus aufgrund der Abwesenheit von Pigment-Epithel in der ex vivo Retina, die positive C-Wellenkomponente des ERG-Signal entfernt wird und ein bekannter negativer langsamen PIII-Komponente ist in den ex vivo-Aufnahmen zeigte. Die langsame Komponente PIII wurde gezeigt, dass aus den von Müller Gliazellen in der Retina 21-23 stammen. Somit könnte ex vivo ERG Verfahren auch verwendet werden, um Müller-Zellen im intakten Netzhaut zu untersuchen. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ex vivo ERG-Aufnahmen verwendet werden könnten, um die Konzentration von pharmakologischen Mitteln auf der Netzhaut 24 zu messen und testen Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln 25-27 werden.
Mehrere Handels in vivo-Systemen zur Verfügung stehen undin vielen Laboratorien, die nicht unbedingt über umfangreiche Elektrophysiologie Hintergrund verwendet. Im Gegensatz dazu wurden ex vivo-Geräte nicht bis vor kurzem 17 und als Folge nur wenige Labors werden derzeit nutzen diese leistungsfähige Technik zur Verfügung. Es wäre von Vorteil, um unser Wissen über Netzhaut Physiologie und Pathologie voranzubringen und neue Therapien für Krankheiten zu entwickeln blend ex vivo ERG-Aufnahmen zur Verfügung, um weitere Labors zu machen. Wir zeigen hier eine einfache und erschwingliche ex vivo ERG Vorrichtung 17 und zeigen, wie sie in Verbindung mit mehreren im Handel erhältlichen in vivo ERG-Systeme verwendet werden, um Stab- und Kegel-vermittelten Signal aufzuzeichnen (a- und b-Wellen) und die Funktion Müller-Zellen (langsam PIII) aus intakten Wildtyp-Maus Netzhaut.
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Protocol
Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Studies Committee an der Washington Universität zugelassen.
1. Einrichten der Perfusion und Probenständer
- Bereiten Lösung für Netzhautblutung frisch am Tag des Experiments. Verwenden Sie destilliertes und deionisiertes Wasser. Verwenden Sie eine der folgenden drei Lösungen.
- Bereiten bicarbonathaltige Ames-Lösung (1 l): 1 Flasche Ames 'Medien und 1,9 g NaHCO 3,
- Vorbereitung Locke-Lösung (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na-Succinat, 0,5 Na Glutamat, 0,02 EDTA und 10,0 Glucose, 0,1% MEM-Vitamine und Aminosäuren Säuren
- Vorbereitung HEPES-gepufferter Ringer-Lösung (in mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl 2, 1,0 CaCl 2, 10,0 Glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHeingestellt auf 7,5 ~ 5,8 ml 1 M NaOH, fügen 0,72 g / L Kulturmedium Leibovitz L-15. Verwenden Sie 20 bis 50 & mgr; M DL-AP4 und 50 bis 100 & mgr; M BaCl 2, um den Photorezeptor Antwort mit jeder Perfusion Medien zu isolieren.
- Vorbereitung Lösung für Elektroden 28 (in mM): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA und pH-Wert auf 7,4 bis 7,5 mit NaOH. Elektrodenlösung kann bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert werden.
- Bereiten Sie und testen Sie den Probenhalter.
- Kleben Sie schwarz / grau Filterpapier auf der Oberseite der Kuppeln der untere Teil des Probenhalters (siehe Abbildung 1A). Verteilt zweikomponentigen 5 min Epoxidkleber vorsichtig um die Kanten der flachen Oberseiten der Dome. Wenn nötig, machen Sie es unter Dissektionsmikroskop.
- Warten Sie, bis der Leim ist fast trocken (ca. 4 min) und drücken Sie die Filterpapier auf den Kuppeln unter Verwendung einer Flachs Artikel. Kleber Filterpapier mindestens einen Tag vor dem Experiment. DieFilterpapier kann mehrfach verwendet werden, sollten aber nach einem Monat der Aufnahmen ersetzt. Verwenden Sie 70% Ethanol zum Kuppeln sorgfältig von jedem Kleberrückstand reinigen vor der Installation der Ersatzpapier.
- Füllen Sie die Elektrode Kanäle mit Elektrodenlösung versucht, alle Luftblasen zu vermeiden, und schrauben Pelletelektroden mit einem Gewindeadapter in die Elektrodenkanäle eingeschlossen (siehe 1A und B). Verbinden Sie die oberen und unteren Teile des Probenhalters mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusion Linien mit Elektrodenlösung.
- Den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen jedes Elektrodenpaar mit einem Multimeter (1B). Widerstand sollte unter 100 & omega; k und die Spannung unter 10 mV, wenn die Kanäle sind blasenfrei und die Elektroden in einem guten Zustand sind sein.
- Gießen Sie 400-700 ml Perfusion Medien in der Glasflasche. Getrennte und weitere 300 ml in der Präparation der Netzhaut und s verwendet werdenriss es in einem Kühlschrank. Stellen Sie den Infusionsschlauch in den Wärmetauscher-Block und setzen Sie den vorgeheizten Block auf der Heizplatte (siehe Abbildung 1D).
- Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe, die hat Verbindungen zu 2 / O 2 Gas Co (wenn Ames 'oder Lockes verwendet wird) und für Infusionsschlauch (siehe Abbildung 1D). Heizen Sie die Flasche mit den Medien, um 37 o C und auf der Heizplatte oder auf der Oberseite des Lichtstimulationseinheit in einem Wasserbad auf 37 festgelegt - 39 o C 17.
- Prime die Perfusion Linien durch Perfusion mit Medium füllen sie das schwerkraftgetriebenen Strömung zu initiieren.
- Im LKC-System, stellen Sie die Flasche auf der Oberseite des Stimulators Einheit 17, um eine signifikante Gravitationsfluss, wird dann durch Durchflussregler, ohne durch die Senkung Ebene der Perfusionslösung in der Flasche während des Experiments beeinflusst angepasst werden.
- In Ocuscience System, legen Sie die perfusion Flasche innerhalb des Faradayschen Käfigs, um das Rauschen zu minimieren und legen lange Perfusion Ausgangsleitungen von dem Probenhalter (siehe Schritt 2.8) und unterhalb des Niveaus des Probenhalters (und die Perfusion Flasche) zur Schwer Antrieb der Lösung zu erhöhen. Schirmen diese Ausgangsleitungen und die Abschirmung auf Masse des Verstärkers, um die Kopplung des elektromagnetischen Störungen auf das ERG-Signal zu vermeiden.
- Prime die Perfusion Linien durch Perfusion mit Medium füllen sie das schwerkraftgetriebenen Strömung zu initiieren.
- Stellen Sie die Durchblutung und zum 3 - 5 ml / min unter Verwendung von Durchflussreglern. Schließen Sie 5% CO 2/95% O 2 Gas aus einem Zylinder mit der richtigen Regler und stellen Sie die Durchflussrate zu stabilen Blasenbildung der Medien in der Flasche durch einen Luftstein zu gewährleisten.
2. Probenvorbereitung
- Montieren Sie sauber und scharf Dissektionsinstrumente einschließlich gerader Blattmikroschere, eine oder zwei 45 o Pinzette, Rasierklinge und ein rechteckiges Stück Filterpapier.
- Pour etwa 200 ml kaltem Perfusion Lösung in eine große Petrischale, so dass der gesamte untere Teil des Probenhalters (einschließlich der Hauben) können in die Lösung eingetaucht werden. Dieser Schritt wird wichtig, wenn die Montage der Netzhaut auf den Kuppeln (siehe Schritt 2.6). Obwohl einige Lösungen wurden entwickelt, um mit Carbogen (5% CO 2/95% O 2) gesättigt werden, ist dies nicht wesentlich für die Zwecke Dissektion und war nicht in der hier beschriebenen Experimente durchgeführt.
- Für ein typisches Experiment, halten Tiere in 12/12 Stunden hell / dunkel-Zyklus und dunkel passen sie für 6-12 Stunden vor den Aufnahmen. Euthanize das Tier durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte unter dim rotes Licht und alles tun, die folgenden Verfahren, in dim rot oder IR-Licht (Verwendung zB Rotfilter vor dem Mikroskoplichtquelle).
- Ziehen Sie die Augen, die von mit einer Pinzette und setzen Sie sie in den Medien. Platzieren Sie ein Auge in einer Zeit auf einem kleinen Stück Papier (zB einige regelmäßige Filterpapier) und machen soleuchtet etwa auf dem Niveau der Ora serrata, während das Auge mit einer Pinzette (dies ist außerhalb der Lösung hier getan) hält.
- Schneiden Sie entlang der Ora serrata (oder näher am Äquator des Auges) mit Mikroschere und entfernen Sie die Hornhaut und die Linse. Setzen Sie die Augenmuschel in der kalten Medien im großen Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Auge.
- Schneiden Sie einen kleinen Schnitt von der Spitze der Augenmuschel zum Sehnerv hin, indem sie die Schere zwischen der Netzhaut und Lederhaut, um die Netzhaut so intakt wie möglich zu halten. Fassen Sie die Lederhaut von beiden Seiten des Einschnitts durch Verwendung von zwei Pinzetten und die Pinzette ziehen voneinander entfernt, um die Netzhaut zu lösen.
- Schneiden Sie den Sehnerv und versuchen, die Netzhaut mit einem Minimum an physischen Kontakt mit dem distalen Oberfläche zu isolieren. RPE wird meist automatisch lösen sich von der Netzhaut während der Präparation Prozess. Es ist wichtiger, um mechanische Störungen der Netzhaut, als die Vorform zu vermeidendissection schnell, in der Regel die Netzhaut kann mindestens 30 min in der Lösung inkubiert werden, ohne signifikante Auswirkungen auf die Antworteigenschaften.
- Montieren Sie die Netzhaut auf die Kuppeln des Probenhalters (Abbildung 1c). Tauchen Sie den unteren Teil des Probenhalters in der Petrischale mit den Netzhäute präpariert. Gleiten die Retina, Photorezeptorseite (die konvexe Oberfläche des isolierten Netzhaut) nach oben, oberhalb der Kuppel und heben Sie den Probenhalter, so dass der Netzhaut legt auf dem Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Netzhaut.
- Trocknen Sie die Halteplatte vorsichtig, um elektrische Übersprechen zwischen der Netzhaut sowie Rausch- und Signal Rangieren zu verhindern. Probenhalter ist mit O-Ringen um den unteren Teil Kuppeln verschüttet wird zwischen der unteren und oberen Teile des Halters zu verhindern als auch die elektrische Isolierung der Photorezeptor und die Ganglienzellseiten der einzelnen Netzhaut zu helfen. Befestigen Sie den oberen Teil der Halterung mit den vier Schrauben (siehe Abbildung 1B) und füllen Sie die Perfusion Kanäle mit Perfusionslösung unter Verwendung einer Spritze und eine Nadel.
- Übertragen der Probenhalter neben dem Wärmetauscherblock und Verbinden der Eingangs- und Ausgangs Perfusionsleitungen zur Probenhalterung (Figur 1D). Die Elektroden an der ERG-Verstärker (oberen Elektroden zu verbinden, um den Boden / Minus-Pin in den Verstärker) und befestigen Sie den Stimulator / Steuereinheit auf dem Probenhalter, indem Sie einen Adapter oder schieben Sie das Heizkissen in den Stimulatoreinheit je nachdem, welche in vivo ERG System verwendet wird.
3. Recordings
- Konfigurieren Sie die Verstärker und Reiz von Einstellungen mithilfe von Software der in vivo-System. Stellen Sie den Akquisitionsfrequenz auf einen Wert zwischen 1 und 10 kHz und eine Tiefpaßfilterung bis 300 Hz. Verwenden Sie keine Hochpassfilterung. Verwenden Sie 60 Hz (oder 50 Hz in Europa) Notch-Filter, falls erforderlich.
- Nehmen Sie Grundlinie ohne Lichtstimulation und Witzh dim Stimulation (z. B. grünes Licht von -35 dB oder 0,3 mCd sm -2), die für eine gute elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Netzhaut Probe zu testen. Warten Sie 10 bis 20 Minuten vor dem Beginn der Datenerfassung, so dass Netzhauttemperatur und Funktion zu erreichen einen stabilen Zustand.
- Wählen Reizparameter nach einem bestimmten Experiment und starten Sie die Datenerfassung. ZB verwenden grünes Licht von -40 bis 0 dB oder 0,1 bis zu 1.000 mCd sm -2 für eine scotopic Reaktion Familie. Verwenden Sie etwa 2 bis 3 log-Einheiten heller Blitze in photopischen Aufzeichnungen, wo Stangen müssen von Hintergrundlicht unterdrückt werden (3-30 Cdm -2) oder eine Sonde Flash (etwa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, siehe Abbildung 3).
- Beachten Sie jedoch, dass die exakte Lichtintensitätswerte könnten etwas abhängig von Ihrem System-Kalibrierung und experimentellen Bedingungen sein. Als Faustregel gilt, Stufenstärken aufgeschlüsselt nach 5-10-fache im Vergleich zu in vivo 17. Eine schwarze Abdeckung mit Öffnungen oberhalb der Netzhaut (im Gewerbeadaptersystem im Lieferumfang enthalten) kann verwendet werden, um die Lichtstreuung in den Probenhalter zu reduzieren und eine homogene und gleich Stimulation beider Netzhäute von der Ganzfeld Sphäre der kommerziellen in vivo Systeme werden.
HINWEIS: Bei sich von dunkeladaptierten Retina, die Intensitäten der Testwallungen bei einem typischen Experiment Bleich nur ein vernachlässigbarer Anteil des Pigments verwendet wird, so dass das Fehlen von RPE getriebenen Regeneration kein Thema ist. Darüber hinaus hat es sich bereits gezeigt, dass Konus Pigment Regeneration noch Platz in der isolierten Netzhaut über den Müller Zelle visuellen Zyklus 20 zu nehmen.
- Wie Versuche dauern typischerweise 30 min bis zu mehreren Stunden, überwacht die Basisliniendrift, Geräuschpegel und Reaktionsstabilität während des Versuchs als Änderungen könnten diese technischen Probleme anzugeben.
HINWEIS: Erhöhter Schall oder Abnahmed Antwortamplituden kann darauf hindeuten, Luftblasen in den Perfusion oder Elektrodenkanäle, zu niedrige oder hohe Temperatur, Lösung Leck / Spill oder Verschiebung der Netzhaut.
4. Reinigung
- Nehmen Sie den Probenhalter aus den Perfusion Linien, öffnen Sie sie und spülen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier. Entfernen Sie die Elektroden und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser (nicht mit Ethanol). Reinigen Sie den Probenhalter (einschließlich der Perfusions-Kanäle) mit Ethanol und / oder destilliertes Wasser. Flush Infusionsschlauch vorsichtig mit> 70% Ethanol.
- Spülen Sie die Durchblutung Flasche mit destilliertem Wasser (keine Reinigungsmittel). Ethanol kann auch verwendet werden, um die Flasche zu reinigen.
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Representative Results
Wir nahmen Flash Antworten von dunkeladaptierten Wildtyp (WT) C57BL / 6-Maus Netzhaut, indem Sie die oben beschriebenen und durch die Verwendung verschiedener Standard Perfusionslösungen (Abbildung 2) in Abbildung 1 veranschaulicht experimentelle Protokolle. Die Antwortwellenformen und Kinetik sowie Empfindlichkeit der Stäbchen-Photorezeptoren erschien ähnlich in Ames 'und Lockes Medien (2A und B). Auf der anderen Seite, unter HEPES gepufferte Ringer-Lösung (kein Bicarbonat oder 5% CO 2/95% O 2) die Antwortamplituden deutlich geringer. Wir haben auch festgestellt, dass in diesen Bedingungen b-Welle Stabilität gefährdet wurde. Zugabe von 40 & mgr; M APB (DL-AP4) entfernt positive b-Welle effizient in allen drei Medien (den 2D-F). Die Entfernung der b-Welle ergab eine große langsame negative Welle (2D), die Müller-Zell-Aktivität 21 zugewiesen wurde. Zugabe von 100 &# 956; M Barium abgeschafft diese Komponente und enthüllt die Photorezeptorantwort des ex vivo ERG Signal (den 2D-F). Wir konnten bis zu 1 mV gesättigten Photorezeptorantworten in Ames 'und Lockes aufzeichnen wohin maximale Reaktionen waren in der Regel etwa 200 & mgr; V unter Ringer Perfusion.
Cone Fotorezeptorantworten, zuvor durch sogenannte Doppelblitztechnik, bei der ein heller Blitz Sonde Sättigung der Stäbe wird durch einen Testblitz zu einem Zeitpunkt, wenn gefolgt Kegel haben ihre dunkeladaptierten Zustand wiederhergestellt, aber Stangen bleiben gesättigten 19,29 isoliert. Hier haben wir getrennt Kegel-vermittelte ERG-Antworten (die sowohl a- und b-Welle) in Ames 'Medien mit 100 & mgr; M von Barium, aber nicht DL-AP4 ergänzt durch doppelte Flash-Technik (Abbildung 3). Barium wurde verwendet, um die langsame Glia-Komponente, die vor allem während der wiederholten Verwendung von brigh um den späten Teil der Antworten variabler machen schien entfernent blinkt. Wir haben eine konstante Sonden Flash, um Stäbchen und variable Test blinkt 300 ms nach dem Flash-Sonde zu sättigen, um Kegel Antworten hervorzurufen. Ein Kegel Antwort Familien durch Subtraktion Sonde Flash-Antwort von den 'Testsonde + flash' Reaktionen erhalten wird, in 3B gezeigt.
Abbildung 1. Verwendung von ex vivo ERG Probenhalter. (A) Befüllung der Elektrodenkanäle und Montage der Elektroden. (B) Prüfung des montierten Probenhalter vor ihrer Zerlegung durch Messen des Widerstands und der Spannung zwischen den Elektrodenpaaren. (C) Montage der Netzhaut auf dem Filterpapier in den Probenhalter. (D) der Probenhalter zu den Perfusionsleitungen und ERG Verstärker im kommerziellen ERG sy verbundenStiel. Die Perfusion Strömungsweg durch blaue Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Flash-Antwort Familien aus dunkeladaptierten WT Maus Netzhaut mit Lockes (A) durchströmt, Ames '(B) und HEPES-gepufferten Ringer (C) Medium aufgezeichnet. Die Blitze abgegeben 3, 40, 130, 390 und 1.400 Photonen um -2 (von -36 bis -9 dB bzw. -3,6 auf -0,9 log (Cd sm -2) grünes Licht (530 nm)). Schwarze Spuren in (DF) zeigen Antworten von Netzhaut in (AC) aufgezeichnet nach Zugabe von 40 & mgr; M und 100 & mgr; M APB Barium. Red Spuren in (D) zeigen Antworten von der Netzhaut in aufgezeichnet (A) mit durchbluteten Lockes mit 40 & mgr; M APB aber nicht Barium ergänzt. Der Einschub zeigt die Antworten auf die drei dunkelsten blinkt in Lockes Medien, die APB und Barium. Die Blitze reichten von 7 bis 14.000 Photonen um -2 (von -32 bis 1 dB grünes Licht) in (D), von 3 bis 1.400 Photonen um -2 (von -36 bis -9 dB grünes Licht) in (E), und 7 bis 1.400 Photonen um -2 (von -32 bis -9 dB grünes Licht) in (F). Siehe Vinberg et al. 2014 17 und Lyubarsky et al., 1999 30 und 2004 31 für weitere Einzelheiten der Umwandlung von Lichtenergie in photopischen Cd sm gegeben -2 bis Photonen um -2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Isolierung von Zäpfchenreaktionen mit Doppelblitzverfahren in WT-Maus. (A) Eine Antwort auf Flash (14.000 Photonen um -2 oder 1 dB grünes Licht, schwarz) und eine Antwort auf Flash, gefolgt von einem Test Flash-Sonde Sonde (81.000 Photonen um -2 oder 9 dB grünes Licht, rot). (B) Blitzreaktionen Cone blinkt reicht von 360 bis 81.000 Photonen um -2 (-14 bis 10 dB grünes Licht) durch Subtraktion der Sonde Flash-Antwort von dem getrennt zu testen " Sonde + Test flash "Antwort. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir zeigen hier die entscheidenden Schritte zur gleichzeitigen Gewinnung hochwertiger ex vivo ERG Aufnahmen aus zwei isolierten Maus Netzhaut durch die Verwendung in vivo ERG Systemkomponenten zusammen mit einem Ex-vivo-ERG-Adapter. In dieser Studie haben wir die beiden perfundiert Retinae von dem Tier mit der gleichen Lösung (entweder Ames, Locke oder Ringer), aber es ist auch möglich, jeden Netzhaut mit einer anderen Lösung, zB perfundieren, Drogentestzwecke. Die wichtigsten Schritte für den Erhalt von qualitativ hochwertigen Daten Abschirmung von elektromagnetischen Störungen, die sorgfältige Präparation der Netzhaut, stabile und relativ schnelle Strömung Perfusion mit einer fortgeschrittenen maßgeschneiderte Probenhalter und die Durchführung aller Probenvorbereitungsverfahren unter dim rot (oder IR) Licht. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die sofortige Nutzung der beiden Netzhäute und Dual Verwendung eines in vivo ERG-Setup, in vivo und ex vivo ERG Aufnahmen durchzuführen.
_content "> Die angefertigten ex vivo ERG Probenhalter vor kurzem von uns 17 ausgebildet, und jetzt im Handel erhältlich, verbessert SNR durch effiziente elektrische Trennung der proximalen und distalen Teile der Netzhaut und optimiert die Durchblutung Strom über der Netzhaut (hohe Lösungswechselkurs .) Fehlen der langsamen Frequenzrauschkomponenten in ex vivo ERG Signal ermöglicht quantitative Analyse auch von sehr kleinen Reaktionen wurde jedoch gefunden, dass Ex-vivo-Aufnahme ist anfälliger für Störungen des AC-Netzleitungsrauschen (60 Hz in den USA,. 50 Hz in Europa) als in vivo-Experimenten. Dieses Rauschen zu dem Signal hauptsächlich durch die Perfusion Leitung gekoppelt ist, und es kann vor allem durch Abschirmung (und Erdung) aller Perfusion Komponenten (Flasche, Schläuche), die sich außerhalb des Faradayschen Käfigs oder Ganzfeld-Bereich entfernt werden, . Darüber hinaus manchmal 60 Hz Rauschen zu dem ex vivo ERG-Signal durch den Wärmetauscher gekoppelt ist, und dieses Rauschen kann auch durch Erdung entfernt werden. </ P>Wir zeigen, wie bestimmte ERG Signalkomponenten durch Zugabe von pharmakologisch Blocker in das Perfusionssystem während des Versuchs erlaubt Dissektion der Funktion verschiedener Zelltypen in der gleichen Netzhaut / Experiment mit drei unterschiedlichen physiologischen Perfusionsmedium (Abbildung 2) zu entfernen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass die Wahl des Photorezeptors beeinflußt Perfusionsmedien Physiologie in Einzelzellaufzeichnungen 32. Hier Ames, Locke und "HEPES-Ringer Medien verwendet wir dunkeladaptierten Flash-Antworten in Abwesenheit und Gegenwart von pharmakologischen Reagenzien bestimmt, den Photorezeptor-Komponente des ERG-Signal (Figur 2) zu isolieren, zu erfassen. Bicarbonat-gepufferten Lösungen gab größere a- und b-Wellenamplituden bis zu 1 mV. Photorezeptor dim Blitzreaktionen unter Lockes Medium mit Blocker enthalten komplizierte Wiedergewinnungswellenform (siehe Einschub in Abbildung 2D), die nicht mit AmesR gesehen wurde17; oder Ringer-Perfusion. Wenn die Verwendung von ex vivo ERG wird um mehr Labors angepasst wäre es hilfreich, die gleichen Perfusion Medien und Standardverfahren verwenden, um verschiedene Signalkomponenten zu isolieren. An dieser Stelle scheint es, dass die vielseitigste Option ist der Ames 'Medium, weil es stabil ist und große a- und b-Wellenamplituden. Darüber hinaus ist die Photorezeptorantwort, isoliert pharmakologisch in dieser Lösung scheint eine einfache Wellenform erinnert an die von einzelnen Photorezeptoren (2E) festgehalten wird. Dennoch bleiben einige offene Fragen über die Existenz von anderen unter in vivo Bedingungen beobachtet ERG Signalkomponenten. Zum Beispiel in unserer ex vivo Aufnahmebedingungen haben wir nicht gesehen prominente oszillierenden Potentiale 100-150 Hz schwingenden Wellen, die in der Regel in der steigenden Phase der b-Welle eines in vivo ERG Reaktion beobachtet. Es ist somit möglich, dass der innere Retinafunktion in unserem ex vivo Ex-vivo-b-Wellen lebensfähig bipolaren Zellfunktion in Verbindung gebracht. Künftige Studien sollten zu beheben, ob Änderungen in der hier gezeigten Versuchsprotokolle (Dissektion, Perfusion etc.) würde uns erlauben, oszillierenden Potentiale unter ex vivo Bedingungen aufzunehmen.
Cone-Funktion ist entscheidend für unsere Vision. Allerdings ist Untersuchung von Kegeln durch ihre geringe Größe und der Knappheit vor allem in der Netzhaut der Maus 33 behindert. Isolierung von Kegel-Funktion ist in der Maus ERG Aufnahmen noch komplizierter, weil ihre M-Zapfen und Stäbchen haben fast identische spektralen Empfindlichkeiten 30. Standardprotokolle nutzen die mehrere log-Einheit Unterschied zwischen Stäbchen und Zapfen Empfindlichkeiten unter Verwendung stabunterdrückt Hintergrundlicht. Jedoch wird stetig Hintergrundlicht bekannt, Stangen 34,35 desensibilisieren und beeinflussen Kegel-Funktion möglicherweise durch Modulation der Gap Junction Kopplung zwischen Stäbchen und Zapfen <sup> 36,37. Somit ist es schwierig, eine Hintergrundlichtintensität, die hell genug, um Stangen gesättigt, ohne die Zapfen zu halten, ist zu finden. Hier zeigen wir eine alternative Doppelblitz-Methode, die die Vorteile von sowohl der niedrigeren Empfindlichkeit und schnellere Wiederherstellung Kinetik der Zapfen 19,29,30 erfolgt. Auf diese Weise ist es leichter, wirklich dunkeladaptierten kegel vermittelte Reaktionen zu isolieren. Uns ist aufgefallen, dass in Ames 'oder Lösungen Lockes ohne Blocker, die Details der Rückgewinnungswellenform wurden etwas im Laufe des Experiments durch die Verwendung von hellen Sonde und Testblitze betroffen. Dies erschwert die Subtraktion Analyse, um die Kegel Antworten zu isolieren. Jedoch Entfernen der glial-Komponente durch Barium geholfen, um den Schwanz der Antworten anzeigt, dass die Variabilität aufgrund der Müller Zellkomponente war stabilisieren. Auf diese Weise war es möglich, dunkeladaptierten kegel angetriebenen Reaktionen in WT-Mäusen (Figur 3) zu erhalten. Cone Antworten durch Doppelblitz isoliertVerfahren von WT-Mäusen schien kleiner im Vergleich zu denjenigen von WT-Mäusen unter Verwendung von Hintergrundlicht, um die Stange Aktivität 17,37 drücken aufgezeichnet. Dieser Unterschied kann durch einen gut charakterisierten Wirkung von Hintergrundlicht, das sich langsam (innerhalb von 10 min) erhöht Konus Reaktionsamplituden wahrscheinlich aufgrund der Entfernung des stab vermittelte Suppression der Zäpfchenreaktionen 37-39 erläutert.
Zusammenfassend ist das Verfahren hier gezeigt ermöglicht ex vivo elektrophysiologischen Ableitungen der Funktion der Netzhaut zu untersuchen. In Zukunft hoffen wir, dass viele weitere Labore wird dieses leistungsfähige Methode, um die Physiologie und Pathologie des tierischen und menschlichen Netzhaut untersuchen anzupassen und zu unserem Verständnis der Netzhautfunktion voranzutreiben und zu entwickeln, bessere Therapien für Erblindung.
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Disclosures
Washington University in St. Louis hat einen Lizenzvertrag mit Xenotec, Inc. und können eine Lizenzgebühren aus dem Verkauf der ex vivo-Adapter zu erhalten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse EY019312 und EY021126 (VJK), EY002687 an die Augenklinik und Visual Sciences an der Washington University unterstützt und von der Forschung zur Verhütung Blindheit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
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- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
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- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
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