Introduction
Elektroretinogram (ERG) er en veletableret teknik, der kan bruges til at optage den elektriske aktivitet i retina udløst af lys. ERG-signalet er primært genereret af spændingsændringer forårsaget af radiale strømme (langs aksen af fotoreceptorer og bipolære celler) strømmer i den resistive ekstracellulære rum af nethinden. Den første ERG signal blev indspillet i 1865 af Holmgren fra overfladen af en fisk eye 1. Einthoven og Jolly 1908 2 divideret ERG respons til udbrud af lys i tre forskellige bølger, kaldet a-, b- og c-bølger, der vides nu at afspejle hovedsagelig af aktiviteten af fotoreceptorer, ON bipolære celler og pigment epitel celler, henholdsvis 3-8. ERG kan optages fra øjnene af bedøvede dyr eller mennesker (in vivo), fra forberedelse isoleret øje 9, på tværs isoleret intakt nethinden (ex vivo) 3,10-15 eller på tværs specifikke nethinden lag med mikroelektroder (lokalERG) 4,16. Af disse in vivo ERG er i øjeblikket den mest anvendte metode til at vurdere retinal funktion. Det er en ikke-invasiv teknik, der kan anvendes til diagnostiske formål eller til at følge progressionen af retinale sygdomme hos dyr eller patienter. Dog in vivo ERG optagelser producere et kompliceret signal med flere overlappende komponenter, ofte forurenet med ekstraokulær fysiologisk støj (fx vejrtrækning og hjerteaktivitet).
Lokale ERG kan anvendes til at registrere signalet over specifikke lag af nethinden, men det er den mest invasive og har den laveste signal-til-støj-forhold (SNR) i sammenligning med de andre ERG optagelse konfigurationer. Lokale ERG er også teknisk krævende og kræver dyrt udstyr (fx mikroskop og mikromanipulatorer). Transretinal ERG fra intakte, isoleret nethinden (ex vivo ERG) tilbyder et kompromis mellem in vivo og lokale ERG metoder giver stabil og HIGh SNR optagelser fra intakte nethinder af dyr eller mennesker 17. For nylig er denne metode blevet anvendt med succes til at studere stang og kegle fotoreceptor funktion i mammale, primater og humane nethinder 18-20. Derudover, på grund af fravær af pigment epitel i ex vivo retina er den positive c-bølgekomponent af ERG signal fjernet og en fremtrædende negativ langsom PIII komponent er åbenbaret i de ex vivo optagelser. Den langsomme PIII komponent har vist sig at stamme fra aktiviteten af Müller gliaceller i nethinden 21-23. Således kunne ex vivo ERG metoden også anvendes til at studere Müller celler i ubeskadiget nethinden. Adskillige undersøgelser har også vist, at ex vivo ERG optagelser kunne bruges til at måle koncentrationen af farmakologiske midler omkring retina 24 og teste sikkerheden og effektiviteten af lægemidler 25-27.
Multiple kommerciel in vivo systemer er tilgængelige oganvendes i mange laboratorier, der ikke nødvendigvis har omfattende elektrofysiologi baggrund. I modsætning hertil har ex vivo indretninger ikke været tilgængelige indtil for nylig 17 og som et resultat kun meget få laboratorier i øjeblikket tager fordel af denne kraftfulde teknik. Det ville være en fordel at gøre ex vivo ERG optagelser til rådighed for flere laboratorier for at fremme vores viden om retinal fysiologi og patologi, og at udvikle nye behandlingsformer for blændende sygdomme. Vi demonstrerer her en enkel og prisbillig ex vivo ERG-enhed 17 og vise, hvordan den kan anvendes i kombination med flere kommercielt tilgængelige in vivo ERG systemer til registrering stang- og kegle-medieret signalering (A- og B-bølger), og funktionen af Müller celler (langsom PIII) fra intakte vildtype mus nethinder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller var i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af den institutionelle Animal Studies udvalget på Washington University.
1. Opsætning Perfusion og Specimen Holder
- Forbered opløsning nethinden perfusion frisk på dagen for forsøget. Brug destilleret og demineraliseret vand. Brug en af de følgende tre løsninger.
- Forbered bicarbonatholdig Ames 'opløsning (1 I): 1 flaske Ames medier og 1,9 g NaHCO3,
- Forbered Lockes opløsning (i mM): 112,5 NaCI, 3,6 KCI, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO3, 3,0 Na-succinat, 0,5 Na glutamat, 0,02 EDTA og 10,0 glucose, 0,1% MEM vitaminer og amino syrer
- Forbered HEPES-pufret Ringer-opløsning (i mM): 133,3 NaCI, 3,3 KCI, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl2, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHjusteret til 7,5 med ~ 5,8 ml 1 M NaOH, tilsættes 0,72 g / l dyrkningsmedium Leibovitz L-15. Bruge 20-50 uM DL-AP4 og 50-100 pM BaCI2 at isolere fotoreceptor respons med enhver perfusion medier.
- Forbered løsning til elektroder 28 (i mm): 140,0 NaCI, 3,6 KCI, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 3 HEPES, 0,01 EDTA og justering af pH til 7,4-7,5 med NaOH. Elektrode opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i adskillige måneder.
- Forberede og afprøve modellen holder.
- Lim sort / grå filter papir på toppen af kupler af prøven indehaverens den nederste del (se figur 1A). Spred tokomponent 5 min epoxy lim omhyggeligt omkring kanterne på de flade toppe af kupler. Hvis det er nødvendigt, så gør det under dissektion mikroskop.
- Vent, indtil limen er næsten tørt (ca. 4 min) og tryk på filtrerpapir på kuplerne ved hjælp af en flad element. Lim filtrerpapir mindst én dag før forsøget. Denfilterpapir kan bruges flere gange, men skal udskiftes efter en måneds optagelser. Brug 70% ethanol til at rense kupler omhyggeligt fra enhver limrester, før du installerer udskiftning papir.
- Fyld elektrode kanaler med elektrode løsning forsøger at undgå eventuelle luftbobler og skrue pellet elektroder vedlagt en gevind adapter i elektroden kanaler (se figur 1A og B). Forbind de øverste og nederste dele af prøven holder med fire skruer og fylde perfusion linjer med elektrode løsning.
- Måle modstanden og spændingen mellem lederne i hvert elektrodepar hjælp af et multimeter (figur 1B). Resistens bør være under 100 Ωk og spændingen under 10 mV, hvis kanalerne er boble-fri og elektroderne er i god stand.
- Hæld 400-700 ml perfusion af medie i glasflaske. Adskille anden 300 ml, der skal anvendes ved dissektion af nethinder og srev den i et køleskab. Indstil perfusionsslange i varmeveksleren blok og placerer det forvarmede blok på varmepladen (se figur 1D).
- Vedlæg flasken med en hætte, der har forbindelser til CO 2 / O 2 gas (hvis Ames 'eller Lockes anvendes), og for perfusion rør (se figur 1D). Forvarm flasken med medierne til 37 ° C og læg den på varmepladen eller på toppen af lys stimulation enhed i vandbad indstillet til 37-39 ° C 17.
- Prime perfusionen linjer ved at fylde dem med perfusion medier at indlede tyngdekraften drevne flow.
- I LKC system placere flasken på toppen af stimulatoren enheden 17 for at tilvejebringe en betydelig tyngdekraftstrømning der indstilles derefter ved flow-rate regulatorer uden at blive påvirket ved at nedsætte niveauet af perfusionsopløsningen i flasken under eksperimentet.
- I Ocuscience system placere perfusion flaske inde i Faradays bur for at minimere støj og placere lang perfusion output linjer fra præparatholderen (se trin 2.8) et godt stykke under niveauet for præparatholderen (og perfusion flaske) for at øge gravitationel drev af løsningen. Shield disse output linjer og tilslut skjold til forstærkerens jorden for at forhindre kobling af den elektromagnetiske støj til ERG-signalet.
- Prime perfusionen linjer ved at fylde dem med perfusion medier at indlede tyngdekraften drevne flow.
- Juster perfusion til 3-5 ml / min ved hjælp af flow-rate regulatorer. Forbind 5% CO2 / 95% O 2 gas fra en cylinder med ordentlig regulator og justere flowhastigheden for at sikre en stabil boblende af medierne i flasken gennem en luft sten.
2. Prøvefremstilling
- Saml rene og skarpe dissektion instrumenter, herunder straight-bladet microscissors, en eller to 45 o pincet, barberblad og et rektangulært stykke filtrerpapir.
- Hæld ca. 200 ml kold perfusionen opløsning i en stor petriskål, således at hele bunden af prøveholderen (herunder kuplerne) kan nedsænkes i opløsningen. Dette trin bliver vigtigt, når montering af nethinder på kuplerne (se trin 2.6). Selv om nogle løsninger er designet til at være mættet med carbogen (5% CO2 / 95% O 2), er dette ikke væsentligt for dissektion formål og blev ikke gjort i eksperimenterne beskrevet her.
- For en typisk eksperiment, holde dyr i 12/12 timer mørk / lys-cyklus og mørke-tilpasse dem til 6-12 timer før optagelserne. Aflive dyret ved CO2-inhalation efterfulgt af cervikal dislokation under svagt rødt lys og gøre alle de følgende procedurer under dim rødt eller IR-lys (brug fx rødt filter foran mikroskopet lyskilde).
- Træk øjnene ud ved hjælp af en pincet og sætte dem i medierne. Placere det ene øje ad gangen på et lille stykke papir (f.eks nogle regelmæssige filterpapir) og foretager sålit omtrent på niveauet af ora serrata, mens du holder øje med en pincet (dette gøres uden for løsning her).
- Skær langs ora serrata (eller tættere på ækvator i øjet) med microscissors og fjern hornhinden og linsen. Placer øjenkoppen i den kolde medier i store petriskål og gentage den samme procedure med det andet øje.
- Skær et lille snit fra toppen af øjenkoppen mod synsnerven ved at holde saksen mellem nethinden og senehinden for at holde nethinden så intakt som muligt. Grip sclera fra begge sider af snittet ved hjælp af to pincet og træk pincetten væk fra hinanden for at frigøre nethinden.
- Skær synsnerven og forsøge at isolere nethinden med et minimum af fysisk kontakt til den distale overflade. RPE vil oftest løsnes automatisk fra nethinden under dissektion processen. Det er mere vigtigt at undgå mekanisk forstyrrelse af nethinden end at udføre dendissektion hurtigt, generelt nethinder kan inkuberes mindst 30 minutter i opløsningen uden væsentlige virkninger på respons egenskaber.
- Monter nethinder på kupler af præparatholderen (figur 1C). Fordyb den nederste del af prøven indehaveren i petriskålen med dissekerede nethinder. Skub nethinden, fotoreceptorer side (den konvekse overflade af det isolerede nethinden) opad, over kuplen og løft prøveholder, så nethinden lægger på filtrerpapiret. Gentag proceduren for den anden nethinden.
- Tør holderen pladen forsigtigt for at undgå elektrisk krydstale mellem nethinder samt støj og signal rangering. Prøveholder har O-ringe omkring bunddelen kupler til at forhindre opløsning spill mellem bunden og overdelen af holderen samt at hjælpe elektrisk isolation af fotoreceptorer og ganglion cellesider af de enkelte nethinder. Fastgør den øverste del af holderen med de fire skruer (se figur 1B) og fyld perfusionen kanaler med perfusion opløsning ved anvendelse af en sprøjte og en nål.
- Overfør prøven indehaveren ved siden af varmeveksleren blokken og forbinde input og output perfusion linjer til præparatholderen (figur 1D). Forbind elektroderne til ERG forstærker (top elektroder forbindelse til jorden / minus ben i forstærkeren), og fastgør stimulator / styreenhed på præparatholderen ved at bruge en adapter eller skub varmepuden ind stimulatoren enhed afhængigt af hvilken in vivo ERG systemet anvendes.
3. Optagelser
- Konfigurer forstærker og stimulus indstillinger ved hjælp af in vivo-systemets software. Indstil frekvens købet til en værdi mellem 1 og 10 kHz og lavpasfiltrering til 300 Hz. Brug ikke high-pass filtrering. Brug 60 Hz (eller 50 Hz i Europa) notch filter, hvis det er nødvendigt.
- Optag baseline uden lys stimulation og humorh dim stimulering (f.eks., grønt lys -35 dB eller 0,3 mCd sm -2) for at teste for god elektrisk forbindelse mellem elektroderne og nethinden prøve. Vent 10 - 20 minutter, før du starter dataindsamlingen så retinal temperatur og funktion nå en stabil tilstand.
- Vælg stimulusparametre ifølge konkret eksperiment og begynde dataindsamlingen. Eg, bruge grønt lys fra -40 op til 0 dB eller fra 0,1 op til 1.000 mCd sm -2 for en scotopic svar familie. Bruge omkring 2 til 3 log-enheder lysere blinker fotopiske optagelser hvor stængerne skal undertrykkes ved baggrundslys (3-30 Cdm -2) eller en probe flash (ca. 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, se figur 3).
- Men husk, at de nøjagtige lys intensitetsværdier kan være noget afhængig af dit system kalibrering og eksperimentelle betingelser. Som en tommelfingerregel, skala intensiteter ned 5 - 10 gange i forhold til in vivo 17. Et sort cover med åbninger over de nethinder (inkluderet i den kommercielle adapter) kan anvendes til at reducere lysspredning i prøven holderen og lette homogen og lige stimulering af begge nethinder ved Ganzfeld sfære af den kommercielle in vivo-systemer.
BEMÆRK: optagelser fra mørke-tilpasset nethinden, intensiteterne af test- blinker anvendes i et typisk forsøg blegemiddel kun en ubetydelig brøkdel af pigmentet, således at manglen på RPE-driven regenerering er ikke et problem. Endvidere har det tidligere vist, at kegle pigment regenerering stadig kan finde sted i den isolerede nethinde via Müller celle visuelle cyklus 20.
- Som eksperimenter vare typisk fra 30 min op til flere timer, overvåge baseline afdrift, støjniveau og stabilitet respons under eksperimentet som ændringer i disse kan indikere tekniske problemer.
BEMÆRK: Øget støj eller faldd respons amplituder kan indikere luftbobler i perfusionen eller elektrodematerialer kanaler, for lav eller høj temperatur, opløsning lækage / spild eller forskydning af nethinden.
4. Rengøring
- Tag præparatholderen fra perfusionen linjer, åbne den og skylle nethinder fra filtrerpapir. Fjern elektroderne og skyl dem med destilleret vand (brug ikke ethanol). Rengør præparatholderen (herunder perfusion kanaler) med ethanol og / eller destilleret vand. Flush perfusionsslange forsigtigt med> 70% ethanol.
- Skyl perfusion flaske med destilleret vand (brug ikke rengøringsmidler). Ethanol kan også anvendes til at rense flasken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi indspillede flash svar fra dark-tilpasset vildtype (WT) C57BL / 6 mus nethinder ved at følge de eksperimentelle protokoller beskrevet ovenfor og illustreret i figur 1 ved hjælp af forskellige standard perfusionsopløsninger (figur 2). De respons kurver og kinetik samt følsomhed stang fotoreceptorer dukkede ens i Ames 'og Lockes medier (figur 2A og B). På den anden side, under HEPES-pufret Ringer-opløsning (ingen bicarbonat eller 5% CO2 / 95% O 2) svaret amplituder var betydeligt mindre. Vi fandt også, at i disse betingelser b-bølge stabilitet blev kompromitteret. Tilsætte 40 uM APB (DL-AP4) fjernede positiv b-bølge effektivt i alle tre medier (figurerne 2D-F). Fjernelse af b-bølge afslørede en stor langsom negativ bølge (figur 2D), der er blevet tilskrevet Müller celleaktivitet 21. Tilsætning af 100 &# 956; M af barium afskaffet denne komponent, afslører fotoreceptor respons ex vivo ERG signal (figur 2D-F). Vi kunne optage op til 1 mV mættede fotoreceptor reaktioner i Ames 'og Lockes mens maksimale svar var typisk omkring 200 μV under Ringer perfusion.
Cone fotoreceptor reaktioner er tidligere blevet isoleret af såkaldt dobbelt flash teknik, hvor en lys sonde flash mætte stængerne er efterfulgt af en test flash på et tidspunkt, hvor kegler har restaureret deres mørke-tilpassede stat, men stænger forbliver mættet 19,29. Her isoleret vi kegle-medieret ERG responser (indeholdende både a- og b-bølge) i Ames 'medium suppleret med 100 uM af barium, men ikke DL-AP4 ved at dobbelt flash-teknik (figur 3). Barium blev anvendt til at fjerne den langsomme glial komponent, der syntes at gøre den sene del af svarene mere variable især under gentagen brug af bright blinker. Vi brugte en konstant sonde flash til at mætte stænger og test blinker variabel 300 ms efter sonden flash at fremkalde kegle svar. En kegle respons familie opnået ved at trække sonden flash respons fra 'probe + test flash svar er vist i figur 3B.
Figur 1. Anvendelse af ex vivo ERG præparatholderen. (A) Fyldning af elektrode-kanaler og montering af elektroderne. (B) Afprøvning af den samlede præparatholderen før dissektion ved at måle modstanden og spændingen mellem elektrode par. (C) Montering af nethinden på filtrerpapiret i prøven holder. (D) Den prøveholder tilsluttet perfusionen linjer og ERG forstærker i den kommercielle ERG systilk. Perfusionen strømningsbane er angivet med blå pile. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Flash respons familier optaget fra mørke tilpasset WT mus nethinder perfunderet med Lockes (A), Ames '(B), og HEPES-bufferet Ringer (C) medium. De blinker leveret 3, 40, 130, 390 og 1.400 fotoner um -2 (fra -36 til -9 dB eller -3,6 til -0,9 log (Cd sm -2) grønt lys (530 nm)). Sorte spor i (DF) viser reaktioner optaget fra nethinder i (AC) efter tilsætning af 40 uM APB og 100 uM barium. Røde spor i (D) viser reaktioner optaget fra nethinden i (A) perfunderet med Lockes suppleret med 40 pM APB men ikke barium. Det indsatte viser svarene på de tre meget svagt blinker i Lockes medier indeholdende APB og barium. De blinker varierede fra 7 til 14.000 fotoner um -2 (fra -32 til 1 dB grønt lys) i (D), fra 3 til 1.400 fotoner um -2 (fra -36 til -9 dB grønt lys) i (E), og fra 7 til 1.400 fotoner um -2 (fra -32 til -9 dB grønt lys) i (F). Se Vinberg et al. 2014 17 og Lyubarsky et al. 1999 30 og 2004 31 for nærmere oplysninger om konvertering af fotopisk lysende energi givet i Cd sm -2 til fotoner um -2. Klik her for at se en større version af dette tal.
belastning / 52855 / 52855fig3.jpg "/>
Figur 3. Isolering af kegle reaktioner med dobbelt flash metode i WT mus. (A) En reaktion på sonde flash (14.000 fotoner um -2 eller 1 dB grønt lys, sort) og en reaktion på sonde flash efterfulgt af en test flash (81.000 fotoner um -2 eller 9 dB grønt lys, rød). (B) Cone flash reaktioner til at teste blinker i området fra 360 til 81.000 fotoner um -2 (-14 til 10 dB grønt lys) isoleret ved at trække sonden flash svar fra " sonde + test flash "svar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer her de kritiske trin til opnåelse af høj kvalitet ex vivo ERG optagelser samtidig fra to isolerede mus nethinder ved at bruge in vivo ERG systemkomponenter sammen med en ex vivo ERG adapter. I denne undersøgelse perfunderet vi begge nethinder fra dyret med den samme opløsning (enten Ames, Lockes eller Ringer), men det er også muligt at perfundere hver nethinden med en anden løsning fx til lægemiddel testformål. De vigtigste skridt til at opnå data af høj kvalitet er afskærmning mod elektromagnetisk støj, omhyggelig dissektion af nethinden, stabil og relativt hurtige perfusion flow ved hjælp af en avanceret specialbyggede prøveholder, og udføre alle procedurer for prøveforberedelse under dim rød (eller IR) lys. Den her beskrevne fremgangsmåde muliggør øjeblikkelig anvendelse af både nethinder og dobbelt anvendelse af en in vivo ERG setup til at udføre in vivo og ex vivo ERG optagelser.
_content "> specialbygget ex vivo ERG Prøveholderen nyligt designet af os 17, og nu kommercielt tilgængelige, forbedrer SNR ved effektiv elektrisk isolation af den proximale og distale dele af nethinden og optimerer perfusion flow over nethinden (høj opløsning vekselkurs .) Fravær af de langsomme frekvens støj komponenter i ex vivo ERG signal tillader kvantitativ analyse selv fra meget små reaktioner Men vi fandt, at ex vivo optagelsen er mere tilbøjelige til indblanding af AC-power line støj (60 Hz i USA;. 50 hz i Europa) end in vivo forsøg. Denne støj er koblet til det signal, hovedsagelig gennem perfusionsledning, og det kunne det meste fjernes ved afskærmning (og jordforbindelse) alle perfusion komponenter (flaske, slanger) bor uden for Faraday-bur eller Ganzfeld sfære . Desuden undertiden 60 Hz støj koblet til ex vivo ERG signal gennem varmeveksleren og denne støj kan også fjernes ved grundstødning. </ P>Vi viser, hvordan man fjerne bestemte ERG signalkomponenter ved at tilføje farmakologiske blokkere i perfusionen under eksperimentet tillader dissektion af funktionen af forskellige celletyper i samme retina / eksperimentere med tre forskellige fysiologiske perfusion medier (figur 2). En nylig undersøgelse viste, at valget af perfusion medier påvirker fotoreceptor fysiologi i enkeltcelle-optagelser 32. Her brugte vi Ames ', Lockes og "HEPES-Ringer' medier til at optage mørke-tilpassede flash reaktioner i fravær og tilstedeværelse af farmakologiske reagenser beregnet til at isolere fotoreceptorer komponent af ERG signal (figur 2). Bicarbonatpufrede opløsninger gav større a- og b-bølge amplituder, op til 1 mV. Fotoreceptor dim flash reaktioner under Lockes medium med blokkere indeholdt kompliceret opsving bølgeform (se indsatte i figur 2D), som ikke var set med AmesR17; eller Ringer perfusion. Når brugen af ex vivo ERG bliver tilpasset af flere laboratorier, det ville være nyttigt at bruge de samme perfusion medier og standardmetoder til at isolere forskellige signalkomponenter. På dette tidspunkt ser det ud til at den mest alsidige løsning er Ames 'medium, fordi det giver stabile og store a- og b-bølge amplituder. Desuden fotoreceptor respons, isoleret farmakologisk i denne opløsning, synes at have en simpel bølgeform, der minder om optaget fra enkelte fotoreceptorer (Figur 2E). Alligevel forbliver nogle åbne spørgsmål om eksistensen af andre ERG signalkomponenter observeret under in vivo betingelser. For eksempel i vores ex vivo optageforhold vi ikke se prominente oscillerende potentialer, 100-150 Hz oscillerende bølger, der typisk observeret i stigende fase af b-bølge af et in vivo ERG respons. Det er således muligt, at den indre nethinde funktion i vores ex vivo ex vivo b-bølger impliceret levedygtig PÅ bipolar celle funktion. Fremtidige undersøgelser bør løse, om ændringer i forsøgsprotokoller vist her (dissektion, perfusion etc.) ville give os mulighed for at optage oscillerende potentialer under ex vivo betingelser.
Cone-funktion er afgørende for vores vision. Imidlertid er undersøgelse af kegler hæmmet af deres lille størrelse og knaphed især i mus nethinden 33. Isolering af kegle-funktionen er yderligere kompliceret i muse ERG optagelser, fordi deres M-kegler og stænger har næsten identiske spektrale følsomheder 30. Standardprotokoller drage fordel af flere log-enhed forskel mellem stang og kegle følsomheder ved hjælp stang-undertrykke baggrundslys. Imidlertid er konstant baggrundslys kendt for at desensitize stænger 34,35 og påvirke kegle funktion eventuelt gennem modulation af kløften forbindelsesepitop kobling mellem stave og tappe <sup> 36,37. Således er det svært at finde en baggrund lysintensitet, der er lys nok til at holde stænger mættet uden at påvirke kegler. Her demonstrerer vi en alternativ dobbelt blink metode, der drager fordel af både det lavere følsomhed og hurtigere helbredelse kinetik kegler 19,29,30. På denne måde er det lettere at isolere virkelig mørke-tilpassede kegle-medierede responser. Vi har bemærket, at i Ames 'eller Locke løsninger uden nogen blokkere, blev detaljerne i opsving bølgeform noget påvirket i løbet af eksperimentet ved brug af lyse sonde og test blinker. Dette komplicerede subtraktion analyse til at isolere kegle responser. Imidlertid fjerner glial komponent ved barium bidrog til at stabilisere halen af svarene indikerer, at variabiliteten skyldtes Müller celle komponent. På denne måde var det muligt at opnå mørke-tilpassede kegle-drevne reaktioner i WT-mus (figur 3). Cone svar isoleret ved dobbelt flashteknik fra WT mus optrådte mindre sammenlignet med dem optaget fra WT mus ved hjælp af baggrundslys til at undertrykke stang aktivitet 17,37. Denne forskel kan forklares ved en velkarakteriseret effekt af baggrundslys, der langsomt (inden 10 minutter) forøger kegle respons amplituder sandsynligvis på grund af fjernelse af stangen-medieret suppression af kegle responser 37-39.
Sammenfattende fremgangsmåden demonstreret her muliggør ex vivo elektrofysiologiske optagelser til at studere funktionen af nethinden. I fremtiden håber vi, at mange flere laboratorier vil tilpasse denne kraftfulde metode til at studere fysiologi og patologi af menneskers og dyrs retina og at fremme vores forståelse af retinal funktion og udvikle bedre behandlinger for blændende sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Washington University i St. Louis har en licensaftale med Xenotec, Inc. og kan modtage en royalty fra salget af ex vivo adapter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud EY019312 og EY021126 (VJK), EY002687 til Department of Ophthalmology og Visual Fakultet ved Washington University og ved forskning for at forebygge blindhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
