Introduction
Elektroretinogram (ERG) is een gevestigde techniek die kan worden gebruikt om de elektrische activiteit van het netvlies veroorzaakt door licht te nemen. De ERG signaal ontstaat vooral bij spanningsveranderingen veroorzaakt door radiale stroming (langs de as van fotoreceptoren en bipolaire cellen) stroomt in de resistieve extracellulaire ruimte van de retina. De eerste ERG signaal werd in 1865 opgenomen door Holmgren van het oppervlak van een fish eye 1. Einthoven Jolly 1908 en 2 verdeelden de ERG reactie op het ontstaan van licht in drie verschillende golven, a- genoemd, b- en c-golven, die nu bekend zijn voornamelijk de activiteit van fotoreceptoren geven, ON bipolaire cellen en pigmentepitheel cellen, respectievelijk 3-8. ERG kunnen worden opgenomen van de ogen van verdoofde dieren of mensen (in vivo), van geïsoleerde oogwater 9, over geïsoleerde intacte retina (ex vivo) 3,10-15 of over specifieke retina lagen met micro-elektroden (plaatselijkeERG) 4,16. Daarvan in vivo ERG is momenteel de meest gebruikte methode om retinale functie bepalen. Het is een niet-invasieve techniek die kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden of voor de progressie van retinale ziekten bij dieren of patiënten te volgen. In vivo ERG opnames produceren complexe signaal met meer overlappende componenten, vaak besmet met oculaire fysiologische ruis (bijvoorbeeld ademhaling en hartactiviteit).
Plaatselijke ERG kan worden gebruikt om het signaal over specifieke lagen van het netvlies te nemen, maar het is het meest ingrijpende en heeft de laagste signaal-ruisverhouding (SNR) in vergelijking met de andere ERG opname configuraties. Lokale ERG is ook technisch veeleisend en vereist dure apparatuur (bijvoorbeeld, microscoop en micromanipulators). Transretinal ERG van de intacte, geïsoleerde netvlies (ex vivo ERG) biedt een compromis tussen in vivo en lokale ERG methodes waardoor stabiele en high SNR opnames uit intacte netvliezen van dieren of mensen 17. Recent is deze werkwijze met succes gebruikt om staafjes en kegeltjes fotoreceptor functie bij zoogdieren, primaten en menselijke retina 18-20 bestuderen. Bovendien door het ontbreken van pigment epitheel bij de ex vivo netvlies, de positieve c-golfcomponent van de ERG signaal is verwijderd en een prominente negatieve langzame PIII component wordt geopenbaard in het ex vivo opnames. De trage PIII component is aangetoond afkomstig uit de activiteiten van Müller glia cellen in de retina 21-23. Aldus kan ex vivo ERG methode ook worden gebruikt om Müller cellen te bestuderen in het intacte retina. Verscheidene studies hebben ook aangetoond dat ex vivo ERG opnames kunnen worden gebruikt om de concentratie van farmacologische middelen meten rond de retina 24 en test de veiligheid en de werkzaamheid van geneesmiddelen 25-27.
Meerdere commerciële in vivo systemen zijn beschikbaar enin vele laboratoria, die niet noodzakelijkerwijs uitgebreide elektrofysiologie achtergrond. Daarentegen zijn ex vivo apparaten beschikbaar tot voor kort 17 en daardoor slechts zeer weinig laboratoria momenteel maken van deze krachtige techniek. Het zou gunstig zijn voor ex vivo ERG opnamen beschikbaar om meer laboratoria maken om onze kennis over het netvlies fysiologie en pathologie te bevorderen, en om nieuwe therapieën te ontwikkelen voor verblindende ziekten. We tonen hier een eenvoudige en betaalbare ex vivo ERG apparaat 17 en hoe het kan worden gebruikt in combinatie met diverse commercieel verkrijgbaar in vivo ERG systemen staaf- en-cone-gemedieerde signalering opnemen (a- en b-golven) en de functie van Müller cellen (langzaam PIII) uit intacte wild-type muis netvliezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen waren in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de institutionele commissie Animal Studies aan de Universiteit van Washington.
1. Opstellen perfusie en Specimen Holder
- Bereid oplossing retina perfusie verse op de dag van het experiment. Gebruik gedestilleerd en gedemineraliseerd water. Gebruik een van de volgende drie oplossingen.
- Bereid bicarbonaat bevattende Ames 'oplossing (1 L): 1 fles van Ames' media en 1,9 g NaHCO3,
- Bereid Locke's oplossing (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCI, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinaat, 0,5 Na-glutamaat, 0,02 EDTA en 10,0 glucose, 0,1% MEM vitamines en amino zuren
- Bereid HEPES-gebufferde Ringer-oplossing (in mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl2, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHbijgesteld tot 7,5 met ~ 5,8 ml van 1 M NaOH, voeg 0,72 g / l cultuurmedium Leibovitz L-15. Gebruik 20-50 uM DL-AP4 en 50-100 uM BaCl2 de fotoreceptor respons met elke perfusie media te isoleren.
- Pesticide voor elektroden 28 (in mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA en pas pH op 7,4-7,5 met NaOH. Elektrode oplossing kan worden bewaard bij kamertemperatuur voor enkele maanden.
- Bereiden en testen van het monster houder.
- Lijm zwart / grijs filter papier op de top van de koepels van het monster houder onderste deel (zie figuur 1A). Spread tweecomponenten 5 minuten epoxylijm voorzichtig rond de randen van de vlakke toppen van de koepels. Indien nodig, doe het onder de dissectie microscoop.
- Wacht tot de lijm bijna droog is (ongeveer 4 min) en druk op de filter papier op de koepels met behulp van een plat voorwerp. Glue filtreerpapier ten minste één dag voor het experiment. Depapieren filter kan meerdere malen worden gebruikt, maar worden vervangen na een maand opnames. Gebruik 70% ethanol aan koepels zorgvuldig reinigen van alle lijmresten voor het installeren van de vervanging van papier.
- Vul de elektrode kanalen met elektrode oplossing proberen om eventuele luchtbellen te vermijden en schroef pellet elektroden omsloten met een schroefdraad adapter in de elektrode kanalen (zie figuren 1A en B). Sluit de bovenste en onderste stukken van de monsterhouder met vier schroeven en vul de perfusielijnen met electrode oplossing.
- Meet de weerstand en de spanning tussen de geleiders van elk paar elektroden met een multimeter (Figuur 1B). Weerstand moet onder 100 Ωk en de spanning onder de 10 mV als de kanalen zijn bubble-vrij en de elektroden in goede omstandigheden.
- Giet 400-700 ml perfusie media in de glazen fles. Onafhankelijk andere 300 ml voor gebruik bij de ontleding van het netvlies en sscheurde het in een koelkast. Stel de perfusie buizen in de warmtewisselaar blok en plaats de voorverwarmde blok op de verwarmingsplaat (zie figuur 1D).
- Sluit de fles met een dop die connecties heeft tot CO 2 / O 2 gas (indien Ames 'of Locke's wordt gebruikt) en perfusie buis (zie figuur 1D). Verwarm de fles met de media tot 37 ° C en het op de verwarmingsplaat of bovenop de lichtstimulatiebron eenheid waterbad op 37-39 ° C 17.
- Prime de perfusie lijnen door ze te vullen met perfusie media om de zwaartekracht gedreven stroom starten.
- In LKC systeem Plaats de fles op de top van de stimulator unit 17 significante zwaartekracht stroming die vervolgens wordt aangepast door flow-rate regelaars zonder te worden beïnvloed door het verlagen niveau van de perfusievloeistof in de fles gedurende het experiment geven.
- In Ocuscience systeem, plaats de perfusion fles binnen de kooi van Faraday om ruis lange perfusie output lijnen van het monster houder te minimaliseren en plaats (zie stap 2.8) ver onder het niveau van het monster houder (en perfusie fles) om zwaartekracht aandrijving van de oplossing te verhogen. Shield deze output lijnen en sluit de afscherming aan de grond van de versterker om de koppeling van de elektromagnetische ruis naar de ERG signaal te voorkomen.
- Prime de perfusie lijnen door ze te vullen met perfusie media om de zwaartekracht gedreven stroom starten.
- Stel de perfusie tot 3-5 ml / min met behulp van debiet toezichthouders. Sluit 5% CO 2/95% O 2 gas uit een cilinder met de juiste regulator en stel het debiet gestage borrelen van de media in de fles te verzekeren door middel van een lucht steen.
2. Monstervoorbereiding
- Monteer schoon en scherpe dissectie instrumenten, waaronder rechte bladen microscissors, één of twee 45 o pincet, scheermesje en een rechthoekig stuk filterpapier.
- Giet ongeveer 200 ml koud Japanse productesie oplossing in een grote petrischaal zodat het gehele onderste gedeelte van de monsterhouder (inclusief domes) worden ondergedompeld in de oplossing. Deze stap wordt belangrijk bij de montage van de netvliezen van de koepels (zie stap 2.6). Hoewel sommige oplossingen zijn ontworpen met carbogeen (5% CO2 / 95% O2) verzadigd, is dit niet essentieel voor de dissectie doeleinden en is niet uitgevoerd in de hier beschreven experimenten.
- Voor een typisch experiment, houden van dieren in 12/12 uur donker / licht en donker-cyclus aanpassen hen voor 6-12 uur voor de opnames. Euthanaseren van de dieren door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie onder gedimd rood licht en alles doen wat de volgende procedures onder gedimd rood of IR-licht (gebruik bijvoorbeeld, rood filter in de voorkant van de microscoop lichtbron).
- Trek de ogen uit met behulp van een pincet en leg ze in de media. Plaats één oog in een tijd op een klein stukje papier (bijvoorbeeld sommige reguliere filter papier) en zolit benadering om het niveau van ora serrata terwijl het oog met een pincet (dit is buiten de oplossing klaar here).
- Snijd langs de ora serrata (of dichter bij de evenaar van het oog) met microscissors en verwijder het hoornvlies en de lens. Plaats het oog beker in de koude media in de grote petrischaal en herhaal dezelfde procedure met het andere oog.
- Snijd een kleine incisie van de bovenkant van de oogschelp naar de oogzenuw door hem de schaar tussen de retina en sclera om de retina zo intact mogelijk. Pak de sclera aan beide zijden van de incisie door twee pincet en trek de pincet uit elkaar aan het netvlies los.
- Snijd de oogzenuw en probeer de retina te isoleren met een minimum hoeveelheid fysiek contact met het distale oppervlak. RPE wordt meestal automatisch los van het netvlies tijdens de dissectie proces. Het is belangrijker om mechanische verstoringen van de retina dan het voeren voorkomenontleding snel, meestal netvliezen worden ten minste 30 min in de oplossing geïncubeerd zonder aanzienlijk responseigenschappen.
- Monteer de netvliezen van de koepels van het monster houder (figuur 1C). Dompel het onderste gedeelte van de monsterhouder in de petrischaal met ontleed netvliezen. Schuif het netvlies, fotoreceptor kant (het convexe oppervlak van de geïsoleerde retina) omhoog, boven de koepel en til het monster houder, zodat het netvlies hecht op het filter papier. Herhaal de procedure voor de andere netvlies.
- Droog de houder plaat zorgvuldig om elektrische overspraak tussen de netvliezen evenals ruis en signaal rangeren voorkomen. Specimen houder O-ringen rond het bodemdeel koepels aan oplossing lekkage tussen de onderste en bovenste delen van de houder te voorkomen, alsmede de elektrische isolatie van de fotoreceptor en ganglioncellen zijden van de afzonderlijke netvliezen helpen. Bevestig het bovenste deel van de houder met de vier schroeven (zie Figuur 1B) en vul de perfusie kanalen met perfusievloeistof via een spuit en een naald.
- Transfer het monster houder naast de warmtewisselaar blok en sluit de input en output perfusie lijnen naar het monster houder (figuur 1D). Sluit de elektroden aan de ERG versterker (bovenste elektroden aan te sluiten op de grond / minus pin in de versterker) en bevestig de stimulator / control unit op het monster houder met behulp van een adapter of schuif de verwarming pad in de stimulator unit afhankelijk van welke in vivo ERG kan worden gebruikt.
3. Opnamen
- De versterker en de stimulus-instellingen te configureren met behulp van de software van de in vivo systeem. Stel de verwerving frequentie op een waarde tussen 1 en 10 kHz en laagdoorlaatfilter met 300 Hz. Heeft high-pass filter niet gebruiken. Gebruik 60 Hz (of 50 Hz in Europa) notch filter indien nodig.
- Record basislijn zonder licht stimulatie en with dim stimulatie (bijv., groen licht van -35 dB of 0,3 mCd sm -2) om te testen op een goede elektrische verbinding tussen de elektroden en retina monster. Wacht 10-20 minuten voor het verzamelen van gegevens te beginnen, zodat het netvlies temperatuur en functie te bereiken van een stabiele toestand.
- Kies Stimulusparameters volgens een specifieke experiment en beginnen met het verzamelen van gegevens. Bijvoorbeeld, gebruiken groene licht van -40 tot 0 dB of van 0,1 tot 1.000 mCd sm -2 voor een scotopische reactie familie. Gebruik ongeveer 2 tot 3 log-eenheden helderder knippert in fotopische opnames waar de staven moeten worden onderdrukt door achtergrondlicht (3-30 Cdm -2) of een sonde flitser (ongeveer 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, zie figuur 3).
- Vergeet echter niet dat de exacte lichtintensiteit waarden enigszins afhankelijk van uw systeem kalibratie en experimentele omstandigheden zou kunnen zijn. Als vuistregel schaal intensiteiten door 5-10-voudig in vergelijking met in vivo 17. Een zwarte deksel met openingen boven de retina (in het commerciële adapter) zijn gebruikt om lichtverstrooiing te verminderen in de monsterhouder en homogeen en gelijke stimulatie van beide netvliezen vergemakkelijken door de Ganzfeld gebied van de commerciële in vivo systemen.
OPMERKING: Bij opnames van donker aangepaste netvlies, de intensiteiten van de test flitsen in een typisch experiment bleek slechts een verwaarloosbaar deel van het pigment, zodat het ontbreken van RPE aangedreven regeneratie niet een probleem. Bovendien, het is eerder aangetoond dat kegel pigment regeneratie nog steeds kan plaatsvinden in de geïsoleerde netvlies via de Müller cel visuele cyclus 20.
- Zoals proeven duren typisch 30 minuten tot enkele uren, bewaken basislijnafwijking, geluidsniveau en stabiliteit reactie tijdens het experiment veranderingen in deze technische problemen kunnen wijzen.
OPMERKING: Verhoogde ruis of afnamed respons amplitudes kunnen luchtbellen in de perfusie of elektrode kanalen, te lage of hoge temperaturen, oplossing lekken / morsen of verplaatsing van het netvlies vermelden.
4. Reiniging
- Maak het monster houder van de perfusie lijnen, open het en spoel de netvliezen van de filter papier. Verwijder de elektroden en spoel ze met gedistilleerd water (niet gebruiken ethanol). Reinig het monster houder (met inbegrip van de perfusie kanalen) met ethanol en / of gedestilleerd water. Flush perfusieslang zorgvuldig met> 70% ethanol.
- Spoel de perfusie fles met gedistilleerd water (geen schoonmaakmiddelen gebruiken). Ethanol kan ook worden gebruikt om de fles te reinigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We namen flash antwoorden van donker aangepaste wild-type (WT) C57BL / 6 muis netvliezen door de testprotocollen hierboven beschreven en in figuur 1 met verschillende standaard perfusie-oplossingen (figuur 2). De respons curven en kinetiek betreffende de gevoeligheid van staaf fotoreceptoren, vergelijkbaar in Ames en Locke's media (figuur 2A en B). Anderzijds, onder HEPES-gebufferde Ringer-oplossing (zonder bicarbonaat of 5% CO2 / 95% O2) de reactie amplitudes significant kleiner. We vonden ook dat in deze omstandigheden b-golf stabiliteit in gevaar was. Het toevoegen van 40 uM APB (DL-AP4) verwijderd positieve b-golf efficiënt in alle drie de media (figuren 2D-F). Verwijdering van de b-wave toonde een grote trage negatieve golf (figuur 2D) die is toegewezen aan Müller celactiviteit 21. Toevoegen van 100 &# 956; M van barium afgeschaft dit onderdeel, het openbaren van de fotoreceptor reactie van de ex vivo ERG signaal (figuren 2D-F). We kunnen opnemen tot 1 mV verzadigd fotoreceptor reacties in Ames en Locke terwijl maximale reacties waren meestal rond de 200 mV onder Ringer perfusie.
Kegel fotoreceptor reacties zijn eerder geïsoleerd door zogenaamde dubbele flash techniek waarbij een heldere sonde flash verzadigen van de staven wordt gevolgd door een test flits op een moment dat kegels hun donker aangepaste state hebben hersteld, maar staven blijven verzadigd 19,29. Hier die we cone-gemedieerde responsen ERG (die zowel a- en b-wave) in media Ames gesupplementeerd met 100 uM barium maar DL-AP4 met dubbele flitstechniek (figuur 3). Barium werd gebruikt om de langzame gliale component die bleek de late deel van de responsen variabeler maken vooral tijdens herhaald gebruik van brigh verwijderent knippert. We gebruikten een constante probe flitser staven en test knippert variabele verzadigen 300 msec nadat de sonde flitser kegel reacties uitlokken. Een familie cone respons verkregen door probe flash antwoord van de "probe + proefflits 'respons wordt getoond in figuur 3B.
Figuur 1. Gebruik van ex vivo ERG preparaathouder. (A) Het vullen van de elektrode kanalen en monteren van de elektroden. (B) Het testen van de geassembleerde monsterhouder vóór versnijding door de weerstand en de spanning tussen de elektrodeparen. (C) Installatie van het netvlies op het filter papier in de preparaathouder. (D) Het monster houder aangesloten op de perfusie lijnen en ERG versterker in de commerciële ERG systeel. De perfusie stroomweg wordt aangegeven met blauwe pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Flash reactie families opgenomen van donker aangepaste WT muis netvliezen geperfuseerd met Locke's (A), Ames (B) en HEPES-gebufferde Ringer (C) medium. Het knippert geleverd 3, 40, 130, 390 en 1.400 fotonen micrometer -2 (van -36 naar -9 dB of -3,6 naar -0,9 log (Cd sm -2) groen licht (530 nm)). Zwarte sporen in (DF) Toon reacties opgenomen van netvliezen in (AC) na toevoeging van 40 uM APB en 100 uM barium. Rode sporen in (D) tonen de reacties opgenomen van het netvlies in (A) geperfuseerd met Locke's gesupplementeerd met 40 pM APB maar niet barium. De inzet toont de antwoorden op de drie zwakste knippert op Locke's media met APB en barium. De flitsen varieerde van 7 tot 14.000 fotonen urn -2 (van -32 dB tot 1 groen licht) in (D) van 3 tot 1400 fotonen urn -2 (van -36 tot -9 dB groen licht) bij (E), en van 7 tot 1400 fotonen urn -2 (van -32 tot -9 dB groen licht) bij (F). Zie Vinberg et al. 2014 17 en Lyubarsky et al. 1999 30 en 2004 31 voor meer informatie over het omzetten van fotopische lichtenergie in Cd sm -2 tot fotonen micrometer -2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
load / 52.855 / 52855fig3.jpg "/>
Figuur 3. Isolatie van cone reacties met dubbele flitser methode WT muis. (A) Een reactie op flash (14.000 fotonen micrometer -2 of 1 dB groen licht, zwart) en een reactie op flash, gevolgd door een test flash sonde sonde (81.000 fotonen micrometer -2 of 9 dB groen licht, rood). (B) Cone flash reacties op flitsen, variërend van 360 tot 81.000 fotonen micrometer -2 (-14 tot 10 dB groen licht) geïsoleerd door het aftrekken van de sonde flash reactie van de testen " sonde + testen flash "reactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We tonen hier de kritische stappen voor het verkrijgen van hoge kwaliteit ex vivo ERG opnames tegelijkertijd van twee geïsoleerde muis netvliezen met behulp van in vivo ERG systeemcomponenten samen met een ex vivo ERG adapter. In deze studie perfusie we zowel netvliezen van het dier met dezelfde oplossing (ofwel Ames, Locke's of Ringer), maar het is ook mogelijk om elke retina perfuseren met een andere oplossing bijvoorbeeld voor dopingcontroledoeleinden. De belangrijkste stappen voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit zijn afscherming van elektromagnetische ruis, een zorgvuldige dissectie van het netvlies, stabiele en relatief snelle perfusie stroom met behulp van een geavanceerde custom-built exemplaar houder en het uitvoeren van alle monstervoorbereidingsprocedures onder dim rood (of IR) licht. De hier beschreven methode maakt direct gebruik van zowel netvliezen en dubbel gebruik van een in vivo ERG opstart presteren in vivo en ex vivo ERG opnames.
_content "> De op maat gebouwde ex vivo ERG monsterhouder recentelijk ontworpen door ons 17 en nu in de handel verkrijgbaar, verbetert SNR door efficiënte elektrische isolatie van de proximale en distale delen van de retina en optimaliseert perfusie stroom boven de retina (high oplossing koers .) Afwezigheid van de langzame frequentie ruis componenten in ex vivo ERG signaal maakt kwantitatieve analyse, zelfs van zeer kleine reacties echter, vonden we dat ex vivo opname is meer kans op interferentie van AC-power line ruis (60 Hz in de VS;. 50 Hz in Europa) dan in vivo-experimenten. Dit geluid gekoppeld aan het signaal vooral door de perfusie lijn, en het kan meestal worden verwijderd door afscherming (en aarding) alle perfusie componenten (fles, slangen) die buiten de kooi van Faraday of Ganzfeld bol . Bovendien soms 60 Hz ruis gekoppeld met de ex vivo ERG signaal via de warmtewisselaar en deze ruis kan worden verwijderd door te aarden. </ P>We demonstreren hoe specifieke ERG signaalcomponenten door toevoeging farmacologische blokkers in de perfusie gedurende het experiment waarbij dissectie van de functie van verschillende celtypes in dezelfde retina / experiment met drie verschillende fysiologische perfusie media (figuur 2) te verwijderen. Een recente studie toonde aan dat de keuze van de perfusie media beïnvloedt fotoreceptor fysiologie in één cel opnames 32. Hier gebruikten we Ames, Locke en 'HEPES-Ringer media te donker aangepaste flash responsen in de afwezigheid en aanwezigheid van farmacologische reagens bedoeld om de fotoreceptor component van de ERG signaal (figuur 2) te isoleren opnemen. -Bicarbonaat gebufferde oplossingen gaf grotere a- en b-golf amplitudes, tot 1 mV. Fotoreceptor dim flash reacties onder Locke's medium met blockers bevatte gecompliceerde recovery golfvorm (zie inzet van figuur 2D) die niet werd gezien met AmesR17; of Ringer perfusie. Wanneer het gebruik van ex vivo ERG wordt aangepast meer laboratoria zou nuttig zijn om dezelfde perfusie media en standaardmethoden gebruiken om verschillende signaalcomponenten isoleren. Op dit moment lijkt de meest veelzijdige optie is de Ames medium omdat het stabiel en grote a- en b-wave amplitudes. Bovendien, de fotoreceptor reactie, geïsoleerde farmacologisch in deze oplossing blijkt een eenvoudige golfvorm die doet denken aan die welke over uit één fotoreceptoren (figuur 2E) hebben. Maar een aantal open vragen blijven over het bestaan van andere ERG signaalcomponenten waargenomen onder in vivo omstandigheden. Bijvoorbeeld, in onze ex vivo opname-omstandigheden hebben we niet zien prominent oscillerende potentials, 100-150 Hz oscillerende golven die doorgaans worden waargenomen in de stijgende fase van de b-golf van een in vivo ERG reactie. Het is dus mogelijk dat de binnenste retina functie in ex vivo ex vivo b-golven betrokken levensvatbare ON bipolaire celfunctie. Toekomstige studies moeten oplossen of wijzigingen in de experimentele protocollen hier getoonde (dissectie, perfusie etc.) zou ons toelaten om oscillerende potentials onder ex vivo omstandigheden opnemen.
Cone functie is van vitaal belang voor onze visie. Echter, het onderzoek van de kegels wordt gehinderd door hun geringe omvang en schaarste vooral in de muis netvlies 33. Isolatie van kegel functie is verder gecompliceerd in de muis ERG opnames omdat hun M-kegeltjes en staafjes hebben vrijwel identieke spectrale gevoeligheden 30. Standaardprotocollen profiteren van de verschillende log-eenheid verschil tussen de staafjes en kegeltjes gevoeligheden met behulp-rod onderdrukken achtergrond licht. Echter, is gestage achtergrondlicht bekend staven 34,35 ongevoelig en invloed kegel functie eventueel via modulatie van spleetovergangen koppeling tussen de staafjes en kegeltjes <sup> 36,37. Het is dus moeilijk om een achtergrond lichtintensiteit die helder genoeg om rods verzadigde onverminderd kegels blijven vinden. Hier laten we zien een alternatieve dubbele flash methode die gebruik maakt van zowel de lagere gevoeligheid en sneller herstel kinetiek van kegels 19,29,30. Hierdoor is het gemakkelijker om echt donker aangepaste conus-gemedieerde responsen te isoleren. We hebben gemerkt dat Ames of oplossingen Locke's zonder blockers, de details van de terugwinning golfvorm waren enigszins aangetast tijdens het verloop van het experiment door het gebruik van heldere probe en test knippert. Dit bemoeilijkt de aftrekking analyse om de conus reacties isoleren. Het verwijderen van de gliale component met barium bijgedragen tot de staart van de reacties aangeeft dat de variatie veroorzaakt door de Müller celcomponent stabiliseren. Zo kon men donker aangepaste-cone aangedreven responsen in WT-muizen (figuur 3) te verkrijgen. Cone reacties geïsoleerd door dubbele flashtechniek van WT-muizen bleek kleiner in vergelijking met die opgenomen met WT-muizen door achtergrondlicht te rod 17,37 activiteit onderdrukken. Dit verschil wordt verklaard door een goed gekarakteriseerde effect van achtergrondlicht dat langzaam (binnen 10 minuten) verbetert cone reactie amplitudes waarschijnlijk door verwijdering van de staaf geïnduceerde inhibitie conus reacties 37-39.
Samengevat, de werkwijze hier gedemonstreerd maakt mogelijk ex vivo elektrofysiologische opnames om de functie van de retina te bestuderen. In de toekomst hopen we dat veel meer laboratoria deze krachtige methode om de fysiologie en pathologie van dierlijke en menselijke netvlies te bestuderen zal aanpassen en aan ons begrip van het netvlies functie te bevorderen en ontwikkelen van betere therapieën voor verblindende ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Washington University in St. Louis heeft een licentieovereenkomst met Xenotec, Inc. en kan een royalty van de verkoop van de ex vivo adapter ontvangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies EY019312 en EY021126 (VJK), EY002687 aan de afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences aan de Universiteit van Washington, en door onderzoek ter voorkoming van Blindheid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
