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Neuroscience

समकालिक Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52855
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

Introduction

Electroretinogram (एर्ग) प्रकाश से चालू होने वाले रेटिना की विद्युतीय गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एर्ग संकेत रेटिना की प्रतिरोधक बाह्य अंतरिक्ष में बह रेडियल धाराओं की वजह से वोल्टेज परिवर्तन (फोटोरिसेप्टर और द्विध्रुवी कोशिकाओं की धुरी के साथ) द्वारा मुख्य रूप से उत्पन्न होता है। पहले एर्ग संकेत एक मछली की आँख 1 की सतह से Holmgren द्वारा 1865 में दर्ज की गई थी। Einthoven और जॉली 1908 2 बी, ए कहा जाता है तीन अलग अलग तरंगों में रोशनी की शुरुआत के लिए एर्ग प्रतिक्रिया, और सी-तरंगों, अब द्विध्रुवी कोशिकाओं, photoreceptors के मुख्य रूप से गतिविधि प्रतिबिंबित करने के लिए जाना जाता है, और वर्णक उपकला विभाजित सेल, क्रमशः 3-8। एर्ग स्थानीय (microelectrodes के साथ (पूर्व vivo) पृथक बरकरार रेटिना के पार, पृथक आंख तैयारी 9 से, anesthetized जानवरों या (vivo में) मनुष्यों की आंखों से 3,10-15 या भर में विशिष्ट रेटिना परतों दर्ज किया जा सकताएर्ग) 4,16। इनमें से इन विवो एर्ग वर्तमान में रेटिना समारोह का आकलन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है। यह नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या जानवर या रोगियों में रेटिना रोगों की प्रगति का पालन करने के लिए है कि एक noninvasive तकनीक है। हालांकि, इन विवो एर्ग रिकॉर्डिंग अक्सर दृष्टितर शारीरिक शोर (जैसे, श्वास और हृदय की गतिविधि) से दूषित, कई अतिव्यापी घटकों के साथ एक जटिल संकेत उत्पादन।

स्थानीय एर्ग रेटिना के विशिष्ट परतों में संकेत रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन यह सबसे आक्रामक है और अन्य एर्ग रिकॉर्डिंग विन्यास की तुलना में सबसे कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) है। स्थानीय एर्ग भी तकनीकी रूप से मांग कर रहा है और महंगे उपकरण (जैसे, माइक्रोस्कोप और micromanipulators) की आवश्यकता है। अक्षत, पृथक रेटिना से Transretinal एर्ग (पूर्व vivo एर्ग) स्थिर और hig की इजाजत देने में विवो और स्थानीय एर्ग तरीकों के बीच एक समझौता प्रदान करता हैजानवरों या इंसानों 17 के बरकरार रेटिना से ज SNR की रिकॉर्डिंग। हाल ही में, इस विधि, स्तनधारी रहनुमा और मानव retinas के 18-20 में रॉड और कोन फोटोरिसेप्टर समारोह का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, के कारण पूर्व vivo रेटिना में वर्णक उपकला के अभाव के एर्ग संकेत के सकारात्मक सी लहर घटक निकाल दिया जाता है और एक प्रमुख नकारात्मक धीमी PIII घटक पूर्व vivo रिकॉर्डिंग में पता चला है। धीमी गति से PIII घटक रेटिना 21-23 में मुलर glia कोशिकाओं की गतिविधि से ही शुरू करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, पूर्व vivo एर्ग विधि भी बरकरार रेटिना में मुलर कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कई अध्ययनों से यह भी कहा कि पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग रेटिना 24 के आसपास औषधीय एजेंटों की एकाग्रता को मापने और दवाओं 25-27 की सुरक्षा और प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पता चला है।

विवो सिस्टम में कई वाणिज्यिक उपलब्ध हैं औरजरूरी व्यापक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पृष्ठभूमि नहीं है कि कई प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है। इसके विपरीत, पूर्व vivo उपकरणों हाल ही में 17 तक और केवल बहुत कुछ प्रयोगशालाओं वर्तमान में इस शक्तिशाली तकनीक का लाभ उठा रहे हैं एक परिणाम के रूप में उपलब्ध नहीं है। यह रेटिना शरीर विज्ञान और विकृति के बारे में हमारे ज्ञान अग्रिम, और रोगों चकाचौंध के लिए नए उपचारों के विकास के लिए और अधिक प्रयोगशालाओं के लिए पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग उपलब्ध बनाने के लिए लाभकारी होगा। हम यहाँ एक सरल और सस्ती पूर्व vivo एर्ग डिवाइस 17 प्रदर्शित करता है और यह rod- और शंकु की मध्यस्थता संकेतन रिकॉर्ड करने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इन विवो एर्ग सिस्टम के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे शो (ए और बी-तरंगों) और समारोह के बरकरार जंगली प्रकार माउस रेटिना से मुलर कोशिकाओं (PIII धीमा)।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार में थे और वाशिंगटन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. छिड़काव और नमूना धारक की स्थापना

  1. प्रयोग के दिन पर ताजा रेटिना छिड़काव के लिए समाधान तैयार है। आसुत और विआयनीकृत पानी का प्रयोग करें। निम्नलिखित तीन समाधानों में से एक का उपयोग करें।
    1. , मीडिया और 3 NaHCO के 1.9 छ: 'एम्स की 1 बोतल (1 एल) समाधान' एम्स बिकारबोनिट युक्त तैयार करें
    2. (मिमी में) लोके समाधान तैयार: 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 2 MgCl, 1.2 2 CaCl, 10.0 HEPES, 20.0 3 NaHCO, 3.0 ना succinate, 0.5 ना ग्लूटामेट, 0.02 EDTA है, और 10.0 ग्लूकोज, 0.1% सदस्य विटामिन और अमीनो एसिड
    3. (मिमी में) तैयार HEPES के बफर घंटी समाधान: 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 2 MgCl, 1.0 2 CaCl, 10.0 ग्लूकोज, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, पीएच1 एम NaOH के 5.8 मिलीलीटर ~ साथ 7.5 करने के लिए समायोजित, 0.72 ग्राम / एल लेबोविट्ज़ संस्कृति के माध्यम से एल -15 जोड़ें। किसी भी छिड़काव मीडिया के साथ फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया अलग करने के लिए 100 माइक्रोन BaCl 2 - 50 माइक्रोन डीएल-AP4 और 50 - 20 का प्रयोग करें।
  2. (मिमी में) इलेक्ट्रोड 28 के लिए समाधान तैयार: 140.0 NaCl, 3.6 KCl, 2 CaCl, 3 HEPES, 0.01 EDTA के 2.4 2 MgCl, 1.2 और 7.4 पीएच को समायोजित - NaOH के साथ 7.5। इलेक्ट्रोड समाधान कई महीनों के लिए आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. तैयार है और नमूना धारक का परीक्षण करें।
    1. नमूना धारक के नीचे हिस्से के गुंबदों के शीर्ष पर काले / ग्रे फिल्टर पेपर गोंद (चित्रा 1 ए देखें)। गुंबदों के फ्लैट में सबसे ऊपर के किनारों के आसपास सावधानी से दो घटक 5 मिनट epoxy गोंद बिखरा हुआ है। यदि आवश्यक हो, विच्छेदन खुर्दबीन के तहत इसे करते हैं।
    2. गोंद लगभग सूखी (लगभग 4 मिनट) है जब तक प्रतीक्षा करें और एक फ्लैट मद का उपयोग करके गुंबदों पर फिल्टर पेपर दबाएँ। गोंद फिल्टर पेपर प्रयोग से पहले कम से कम एक दिन।फिल्टर पेपर को कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन रिकॉर्डिंग के एक महीने के बाद प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। प्रतिस्थापन कागज स्थापित करने से पहले किसी भी गोंद अवशेषों से ध्यान से गुंबदों साफ करने के लिए 70% इथेनॉल का प्रयोग करें।
    3. इलेक्ट्रोड समाधान किसी भी हवाई बुलबुले से बचने और इलेक्ट्रोड चैनलों में एक पिरोया एडाप्टर के साथ संलग्न गोली इलेक्ट्रोड (आंकड़े 1 ए और बी देखें) पेंच की कोशिश के साथ इलेक्ट्रोड चैनलों भरें। चार शिकंजा के साथ नमूना धारक के ऊपर और नीचे के टुकड़े कनेक्ट और इलेक्ट्रोड समाधान के साथ छिड़काव लाइनों भरें।
    4. एक मल्टीमीटर (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर प्रत्येक इलेक्ट्रोड जोड़ी का सुराग बीच विरोध और वोल्टेज उपाय। प्रतिरोध 100 Ωk और 10 एम वी नीचे वोल्टेज चैनलों बुलबुला मुक्त हैं और इलेक्ट्रोड अच्छी स्थिति में हैं तो नीचे होना चाहिए।
  4. कांच की बोतल में छिड़काव मीडिया के 700 मिलीलीटर - 400 डालो। एक और 300 मिलीलीटर रेटिना और एस के विच्छेदन में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अलगएक फ्रिज में इसे फाड़ दिया। हीट एक्सचेंजर ब्लॉक में छिड़काव ट्यूबिंग सेट और हीटिंग थाली पर preheated के ब्लॉक जगह (चित्रा -1 देखें)।
  5. (चित्रा -1 देखें) (एम्स 'या लोके प्रयोग किया जाता है) कनेक्शन 2 / ओ 2 गैस सीओ है कि एक टोपी के साथ बोतल और छिड़काव ट्यूबिंग के लिए संलग्न करें। 37 ओ सी के लिए मीडिया के साथ बोतल पहले से गरम और हीटिंग प्लेट पर या 37 के लिए सेट नहाने के पानी में प्रकाश उत्तेजना यूनिट के शीर्ष पर जगह - 39 ओ सी 17।
    1. प्रधानमंत्री गुरुत्वाकर्षण संचालित प्रवाह आरंभ करने के लिए छिड़काव मीडिया के साथ उन्हें भरने के द्वारा छिड़काव लाइनों।
      1. LKC प्रणाली में, तो प्रयोग के दौरान बोतल में छिड़काव समाधान के कम स्तर से प्रभावित हुए बिना प्रवाह दर नियामकों द्वारा निकाला जाता है कि एक महत्वपूर्ण गुरुत्वाकर्षण प्रवाह प्रदान करने के लिए उत्तेजक इकाई 17 के शीर्ष पर बोतल जगह है।
      2. Ocuscience प्रणाली में, पी जगहनमूना धारक से लंबे समय से छिड़काव उत्पादन लाइनों के शोर को कम करने और जगह के क्रम में फैराडे पिंजरे के अंदर erfusion बोतल समाधान के गुरुत्वाकर्षण ड्राइव बढ़ाने के लिए अच्छी तरह से नमूना धारक (और छिड़काव बोतल) के स्तर से नीचे (2.8 कदम देखें)। इन उत्पादन लाइनों ढाल और एर्ग संकेत करने के लिए विद्युत चुम्बकीय शोर के युग्मन को रोकने के लिए है एम्पलीफायर जमीन को ढाल कनेक्ट।
  6. प्रवाह दर नियामकों का उपयोग करके / मिनट 5 मिलीलीटर - 3 के लिए छिड़काव समायोजित करें। उचित नियामक के साथ एक सिलेंडर से 5% सीओ 2/95% 2 हे गैस कनेक्ट और एक हवाई पत्थर के माध्यम से बोतल में मीडिया के स्थिर बुदबुदाती सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह दर को समायोजित।

2. नमूना तैयार

  1. सीधे-पंखों microscissors के एक या दो 45 ओ चिमटी, धार और फिल्टर पेपर के एक आयताकार टुकड़ा सहित स्वच्छ और तेज विच्छेदन के साधन इकट्ठे।
  2. ठंड से perfu के बारे में 200 मिलीलीटर डालोएक बड़े पेट्री डिश में सायन समाधान (गुंबदों सहित) नमूना धारक के पूरे नीचे हिस्से समाधान में डूब जा सकता है। गुंबदों पर retinas के बढ़ते जब यह कदम महत्वपूर्ण हो जाता है (कदम 2.6 देखें)। कुछ समाधान carbogen (5% सीओ 2/95% 2 हे) के साथ संतृप्त करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, इस विच्छेदन प्रयोजनों के लिए आवश्यक नहीं है और यहाँ वर्णित प्रयोगों में नहीं किया गया था।
  3. रिकॉर्डिंग से पहले 12 बजे - एक ठेठ प्रयोग के लिए, अंधेरे / प्रकाश चक्र और 6 के लिए उन्हें डार्क अनुकूल 12/12 बजे में पशुओं को रखने के लिए। (माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत के सामने जैसे, लाल फिल्टर का उपयोग करें) मंद लाल बत्ती के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 साँस लेना द्वारा पशु euthanize और मंद लाल या IR प्रकाश के तहत सभी निम्न कार्यविधियों करते हैं।
    1. चिमटी का उपयोग करके आँखें बाहर खींचो और मीडिया में डाल दिया। कागज (उदाहरण के लिए, कुछ नियमित रूप से फिल्टर पेपर) के एक छोटे से टुकड़े पर एक बार में एक ही आंख प्लेस और बनाने के रूप मेंचिमटी के साथ आंख (यह यहाँ के समाधान के बाहर किया जाता है), जबकि पकड़े ora serrata के स्तर पर लगभग जलाया।
  4. Ora serrata के साथ कट (या करीब नज़र की भूमध्य रेखा के लिए) microscissors के साथ और कॉर्निया और लेंस को हटा दें। बड़े पेट्री डिश में ठंड मीडिया में आँख कप प्लेस और दूसरी आँख के साथ एक ही प्रक्रिया को दोहराने।
  5. संभव के रूप में बरकरार रूप में रेटिना रखने के क्रम में रेटिना और श्वेतपटल के बीच कैंची रखने के द्वारा ऑप्टिक तंत्रिका की ओर आँख कप के ऊपर से एक छोटा सा चीरा काट दिया। पकड़ दो चिमटी का उपयोग कर और रेटिना अलग करने के लिए एक दूसरे से दूर चिमटी खींचने से चीरा के दोनों ओर से श्वेतपटल।
    1. ऑप्टिक तंत्रिका कट और बाहर की सतह के लिए शारीरिक संपर्क की एक न्यूनतम राशि के साथ रेटिना अलग करने के लिए प्रयास करें। RPE के ज्यादातर विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान रेटिना से स्वचालित रूप से अलग होगा। यह प्रदर्शन करने के लिए की तुलना में रेटिना के यांत्रिक गड़बड़ी से बचने के लिए अधिक महत्वपूर्ण हैविच्छेदन जल्दी से, आम तौर पर रेटिना प्रतिक्रिया गुण पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना समाधान में कम से कम 30 मिनट incubated किया जा सकता है।
  6. नमूना धारक (चित्रा 1C) के गुंबदों पर retinas के माउंट। विच्छेदित retinas के साथ पेट्री डिश में नमूना धारक के नीचे हिस्से को विसर्जित कर दिया। गुंबद के ऊपर रेटिना, ऊपर की तरफ फोटोरिसेप्टर पक्ष (पृथक रेटिना के उत्तल सतह), स्लाइड और रेटिना फिल्टर पेपर पर देता है तो यह है कि नमूना धारक उठा। अन्य रेटिना के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
  7. बिजली retinas के बीच crosstalk के साथ ही शोर और संकेत shunting को रोकने के लिए ध्यान से धारक थाली सूखी। नमूना धारक धारक के नीचे और ऊपर भागों के बीच समाधान फैल रोकने के लिए और साथ ही व्यक्तिगत रेटिना के फोटोरिसेप्टर और नाड़ीग्रन्थि सेल पक्षों के बिजली के अलगाव मदद करने के लिए नीचे हिस्से गुंबदों के आसपास हे बजता है। (चार शिकंजा के साथ धारक के शीर्ष भाग संलग्न करेंचित्रा 1 बी देखें) और एक सिरिंज और एक सुई का उपयोग करके छिड़काव समाधान के साथ छिड़काव चैनलों भरें।
  8. हीट एक्सचेंजर ब्लॉक करने के लिए अगले नमूना धारक स्थानांतरण और नमूना धारक (चित्रा -1) के लिए इनपुट और आउटपुट छिड़काव लाइनों कनेक्ट। (शीर्ष इलेक्ट्रोड एम्पलीफायर में जमीन / ऋण पिन से कनेक्ट) एर्ग एम्पलीफायर को इलेक्ट्रोड कनेक्ट और एक अनुकूलक का उपयोग करके नमूना धारक पर उत्तेजक / नियंत्रण इकाई देते हैं या आधार उत्तेजक इकाई में हीटिंग पैड स्लाइड vivo में है जिस पर एर्ग प्रणाली का इस्तेमाल किया जाता है।

3. रिकॉर्डिंग

  1. इन विवो सिस्टम के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एम्पलीफायर और प्रोत्साहन सेटिंग कॉन्फ़िगर करें। 300 हर्ट्ज के लिए छानने के 1 और 10 kHz और कम-पास के बीच एक मूल्य के लिए अधिग्रहण की आवृत्ति सेट करें। उच्च पास छानने का प्रयोग न करें। 60 हर्ट्ज (या यूरोप में 50 हर्ट्ज) यदि आवश्यक हो तो फिल्टर पायदान का प्रयोग करें।
  2. प्रकाश उत्तेजना और बुद्धि के बिना रिकॉर्ड आधारभूतएच मंद उत्तेजना (उदा।, -35 DB या 0.3 एमसीडी एस एम -2 की हरी प्रकाश) इलेक्ट्रोड और रेटिना नमूना के बीच अच्छा विद्युत कनेक्शन के लिए परीक्षण करने के लिए। रेटिना तापमान और समारोह में एक स्थिर स्थिति तक पहुँचने इतना है कि डेटा संग्रह शुरू करने से पहले 20 मिनट - 10 रुको।
    1. किसी भी विशिष्ट प्रयोग के अनुसार प्रोत्साहन मापदंडों का चयन और डेटा संग्रह शुरू करते हैं। उदाहरण के लिए, 0 DB अप करने के लिए या 0.1 1000 तक एमसीडी एस.एम. से -40 से हरी बत्ती का उपयोग -2 एक scotopic प्रतिक्रिया परिवार के लिए। छड़ पृष्ठभूमि प्रकाश द्वारा दबा दिया जाना है, जहां photopic रिकॉर्डिंग में लगभग 2 उज्जवल लॉग-इकाइयों से 3 चमक का इस्तेमाल (3-30 सीडीएम -2) या एक जांच फ्लैश (-2 = 1 DB के बारे में 1.3 सीडी एसएम, चित्रा 3 देखें)।
    2. हालांकि, सटीक प्रकाश तीव्रता मूल्यों आपके सिस्टम अंशांकन और प्रयोगात्मक शर्तों पर कुछ हद तक निर्भर हो सकता है कि याद है। अंगूठे का एक नियम के रूप में, नीचे 5 द्वारा पैमाने तीव्रता - 10 गुना में विवो की तुलना में 17 का उपयोग करते समय। (वाणिज्यिक एडाप्टर प्रणाली में शामिल है) रेटिना के ऊपर छिद्र के साथ एक काले कवर नमूना धारक में प्रकाश बिखरने को कम करने और प्रणालियों विवो में वाणिज्यिक की Ganzfeld क्षेत्र द्वारा दोनों रेटिना के समरूप और बराबर उत्तेजना को सुविधाजनक बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: काले अनुकूलित रेटिना से रिकॉर्डिंग के लिए, एक ठेठ प्रयोग ब्लीच वर्णक का केवल एक नगण्य अंश में इस्तेमाल किया परीक्षण चमक की तीव्रता इतनी है कि RPE संचालित उत्थान की कमी कोई मुद्दा नहीं है। इसके अलावा, यह पहले से कोन वर्णक उत्थान अभी भी मुलर सेल दृश्य चक्र 20 के माध्यम से अलग रेटिना में जगह नहीं ले सकता है कि दिखाया गया है।
  3. प्रयोगों में कई घंटे 30 मिनट ऊपर से आम तौर पर अंतिम के रूप में इन में परिवर्तन तकनीकी समस्याओं का संकेत हो सकता है, के रूप में प्रयोग के दौरान आधारभूत बहाव, शोर के स्तर पर और प्रतिक्रिया स्थिरता की निगरानी।
    नोट: बढ़ता शोर या कमीडी प्रतिक्रिया आयाम हवा छिड़काव या इलेक्ट्रोड चैनलों में बुलबुले, बहुत कम है या उच्च तापमान, समाधान रिसाव / फैल या रेटिना के विस्थापन का संकेत हो सकता।

4. सफाई

  1. , छिड़काव लाइनों से नमूना धारक को अलग करें इसे खोलने और फिल्टर पेपर से रेटिना फ्लश। इलेक्ट्रोड निकालें और आसुत जल (इथेनॉल का उपयोग नहीं करते हैं) के साथ उन्हें कुल्ला। इथेनॉल और / या आसुत जल के साथ (छिड़काव चैनलों सहित) नमूना धारक को साफ करें। ध्यान से फ्लश छिड़काव ट्यूबिंग 70> के साथ% इथेनॉल।
  2. आसुत जल (डिटर्जेंट का उपयोग नहीं करते हैं) के साथ छिड़काव बोतल कुल्ला। इथेनॉल भी बोतल को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

हम काले अनुकूलित जंगली प्रकार से फ्लैश प्रतिक्रियाएं दर्ज की प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल अलग मानक छिड़काव समाधान (चित्रा 2) का उपयोग कर ऊपर वर्णित है और चित्रा 1 में सचित्र का पालन करके (डब्ल्यूटी) C57BL 6 / माउस रेटिना। प्रतिक्रिया waveforms और कैनेटीक्स के साथ-साथ रॉड फोटोरिसेप्टर की संवेदनशीलता को एम्स 'और लोके मीडिया (2A चित्रा और बी) में इसी तरह दिखाई दिया। दूसरी ओर, HEPES के बफर घंटी समाधान (कोई बाइकार्बोनेट या 5% सीओ 2/95% ओ 2) के तहत प्रतिक्रिया आयाम काफी छोटे थे। हम भी इन परिस्थितियों में बी-लहर स्थिरता समझौता किया था कि पाया। 40 माइक्रोन एपीबी जोड़ना (डीएल-AP4) सभी तीन मीडिया (आंकड़े 2 डी-एफ) में कुशलता से सकारात्मक बी-लहर हटा दिया। बी-लहर का हटाया मुलर सेल गतिविधि 21 के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है कि एक बड़ी धीमी गति से नकारात्मक लहर (चित्रा 2 डी) का पता चला। जोड़ना 100 &# 956; बेरियम के एम पूर्व vivo एर्ग संकेत (आंकड़े 2 डी-एफ) के फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया खुलासा, इस घटक को समाप्त कर दिया। अधिकतम प्रतिक्रियाएं घंटी छिड़काव के तहत लगभग 200 μV आम तौर पर थे, जबकि हम एम्स 'और लोके में 1 एम वी संतृप्त फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड कर सकता है।

कोन फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं शंकु उनके काले अनुकूलित राज्य बहाल कर दिया है लेकिन छड़ 19,29 संतृप्त रहेगा जब छड़ saturating एक उज्ज्वल जांच फ़्लैश एक समय में एक परीक्षण के फ्लैश द्वारा पीछा किया जाता है, जहां तथाकथित डबल फ्लैश तकनीक द्वारा पहले से पृथक कर दिया गया है। यहाँ हम डबल फ्लैश तकनीक (चित्रा 3) का उपयोग करके 100 बेरियम की माइक्रोन लेकिन नहीं डीएल-AP4 के साथ पूरक एम्स 'मीडिया में (ए और बी-लहर दोनों युक्त) शंकु की मध्यस्थता एर्ग प्रतिक्रियाओं को अलग किया। बेरियम विशेष रूप से brigh के दोहराव उपयोग के दौरान प्रतिक्रियाओं अधिक चर की देर हिस्सा बनाने के लिए दिखाई दिया कि धीमी गति से glial घटक को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाटी चमक। हम कोन प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए 300 मिसे जांच फ्लैश के बाद छड़ और चर परीक्षण चमक तर करने के लिए एक निरंतर जांच फ़्लैश इस्तेमाल किया। 'जांच + टेस्ट फ्लैश' प्रतिक्रियाओं से जांच फ़्लैश प्रतिक्रिया subtracting द्वारा प्राप्त एक शंकु प्रतिक्रिया परिवार 3B चित्रा में दिखाया गया है।

चित्र 1
इलेक्ट्रोड चैनलों की चित्रा 1. पूर्व vivo एर्ग नमूना धारक का प्रयोग करें। (ए) भरने और इलेक्ट्रोड जोड़े के बीच प्रतिरोध और वोल्टेज को मापने के द्वारा विच्छेदन से पहले इकट्ठे नमूना धारक के इलेक्ट्रोड के बढ़ते। (B) परीक्षण। (सी) बढ़ते नमूना धारक में फिल्टर पेपर पर रेटिना की। (डी) वाणिज्यिक एर्ग एसवाई में छिड़काव लाइनों और एर्ग एम्पलीफायर से जुड़ा नमूना धारकस्टेम। छिड़काव प्रवाह पथ नीले तीर द्वारा संकेत दिया है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
लोके (ए) के साथ perfused काले अनुकूलित गुम्मट माउस रेटिना, एम्स '(बी), और HEPES के बफर घंटी (सी) मध्यम से दर्ज चित्रा 2. फ्लैश प्रतिक्रिया परिवारों। चमक (-0.9 प्रवेश करने के लिए -9 डीबी -36 या -3.6 से (सीडी एस एम -2) हरी बत्ती (530 एनएम)) 3, 40, 130, 390 और 1,400 फोटॉनों माइक्रोन -2 दिया। 40 माइक्रोन एपीबी और 100 माइक्रोन बेरियम के अलावा के बाद (एसी) में रेटिना से दर्ज (लोमो) शो प्रतिक्रियाओं में काला निशान। में रेटिना से दर्ज (डी) शो प्रतिक्रियाओं में लाल निशान (ए) साथ perfused लोके 40 माइक्रोन एपीबी लेकिन नहीं बेरियम के साथ पूरक। इनसेट एपीबी और बेरियम युक्त लोके के मीडिया में तीन dimmest चमक के लिए प्रतिक्रियाओं से पता चलता है। चमक, 3 1400 के लिए फोटॉनों से माइक्रोन -2 (-36 से करने के लिए -9 DB हरी बत्ती) में (ई), 7 -2 माइक्रोन फोटॉनों 14,000 (डी) में (-32 से डीबी हरे रंग का प्रकाश करने के लिए 1) से लेकर और 7 1400 के लिए फोटॉनों माइक्रोन से -2 में (एफ) (-32 से -9 DB हरी बत्ती के लिए)। Vinberg एट अल। 2014 में 17 और Lyubarsky एट अल। 1999 में 30 और फोटॉनों माइक्रोन -2 के लिए सीडी एस.एम. में दी गई photopic चमकदार ऊर्जा -2 परिवर्तित करने के विवरण के लिए 2004 में 31। देखें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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गुम्मट माउस में डबल फ्लैश विधि के साथ शंकु प्रतिक्रियाओं की चित्रा 3. अलगाव। (ए) फ्लैश (14,000 फोटॉनों माइक्रोन -2 या 1 DB हरी बत्ती, काले) और एक परीक्षण फ्लैश द्वारा पीछा फ्लैश की जांच के लिए एक प्रतिक्रिया जांच के लिए एक प्रतिक्रिया (81,000 फोटॉनों माइक्रोन -2 या 9 डीबी हरी बत्ती, लाल)। (बी) शंकु फ़्लैश जवाब "से जांच फ़्लैश प्रतिक्रिया घटाकर द्वारा पृथक 360 81,000 करने के लिए फोटॉनों से माइक्रोन -2 (-14 10 डीबी हरी बत्ती को लेकर चमक) परीक्षण करने के लिए जांच + टेस्ट फ़्लैश "प्रतिक्रिया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम यहाँ एक पूर्व vivo एर्ग एडाप्टर के साथ मिलकर इन विवो एर्ग प्रणाली घटकों का उपयोग करके दो पृथक माउस रेटिना से एक साथ उच्च गुणवत्ता वाले पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रदर्शित करता है। इस अध्ययन में हम एक ही समाधान (या तो एम्स ', लोके या घंटी) के साथ जानवर से दोनों retinas के perfused लेकिन यह दवा परीक्षण प्रयोजनों के लिए, एक अलग समाधान के साथ जैसे प्रत्येक रेटिना छिड़कना भी संभव है। उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम एक उन्नत कस्टम निर्मित नमूना धारक का उपयोग कर, और मंद लाल (या आईआर) के तहत सभी नमूना तैयार प्रक्रियाओं के प्रदर्शन से विद्युत शोर, रेटिना के सावधान विच्छेदन, स्थिर और अपेक्षाकृत तेजी से छिड़काव प्रवाह से रक्षा कर रहे हैं प्रकाश। यहाँ वर्णित विधि विवो और पूर्व vivo एर्ग रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन करने के लिए दोनों रेटिना और एक में विवो एर्ग सेटअप के दोहरे उपयोग की तत्काल उपयोग की अनुमति देता है।

_content "> हाल ही में अमेरिका में 17 से तैयार है, और अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कस्टम निर्मित पूर्व vivo एर्ग नमूना धारक, समीपस्थ और रेटिना के बाहर का भागों के कुशल बिजली के अलगाव से SNR में सुधार और रेटिना (उच्च समाधान विनिमय दर के ऊपर छिड़काव प्रवाह का अनुकूलन ।) पूर्व vivo एर्ग संकेत में धीमी गति आवृत्ति शोर घटकों की अनुपस्थिति बहुत छोटी प्रतिक्रियाओं से भी मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है लेकिन, हम चाहते हैं कि पूर्व vivo रिकॉर्डिंग एसी बिजली लाइन शोर (अमेरिका में 60 हर्ट्ज के हस्तक्षेप की संभावना है पाया;। 50 इन विवो प्रयोगों की तुलना में यूरोप में हर्ट्ज)। मुख्य रूप से छिड़काव लाइन के माध्यम से संकेत करने के लिए मिलकर यह शोर है, और यह ज्यादातर फैराडे पिंजरे या Ganzfeld क्षेत्र के बाहर रहने वाले) की बोतल, ट्यूबिंग (परिरक्षण (और ग्राउंडिंग) सभी छिड़काव घटकों द्वारा हटाया जा सकता है । इसके अलावा, कभी कभी 60 हर्ट्ज शोर हीट एक्सचेंजर के माध्यम से पूर्व vivo एर्ग संकेत करने के लिए मिलकर और इस शोर भी ग्राउंडिंग द्वारा हटाया जा सकता है। </ P>

हम तीन अलग अलग शारीरिक छिड़काव मीडिया (चित्रा 2) के साथ एक ही रेटिना / प्रयोग में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के समारोह के विच्छेदन की अनुमति के प्रयोग के दौरान छिड़काव में औषधीय ब्लॉकर्स जोड़कर विशिष्ट एर्ग संकेत घटकों को दूर करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। एक ताजा अध्ययन में छिड़काव मीडिया के विकल्प एकल कक्ष रिकॉर्डिंग 32 में फोटोरिसेप्टर शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है कि पता चला है। यहाँ हम अभाव और एर्ग संकेत (चित्रा 2) के फोटोरिसेप्टर घटक को अलग-थलग करने का इरादा औषधीय अभिकर्मकों की उपस्थिति में काले अनुकूलित फ़्लैश प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए एम्स ', लोके और' HEPES-घंटी 'मीडिया का इस्तेमाल किया। बिकारबोनिट बफर समाधान एम वी 1 अप करने के लिए, बड़ा एक- और बी-लहर आयाम दे दिया। ब्लॉकर्स के साथ लोके मध्यम तहत फोटोरिसेप्टर मंद फ़्लैश प्रतिक्रियाओं AmesR साथ नहीं देखा गया था कि जटिल वसूली तरंग (चित्रा 2 डी का इनसेट देखें) निहित17; या घंटी छिड़काव। पूर्व vivo एर्ग का उपयोग अधिक प्रयोगशालाओं द्वारा रूपांतरित हो जाता है जब यह अलग संकेत घटकों को अलग करने के लिए एक ही छिड़काव मीडिया और मानक तरीकों का उपयोग करने में मददगार होगा। इस बिंदु पर यह यह स्थिर और बड़े एक- और बी-लहर आयाम देता है क्योंकि सबसे बहुमुखी विकल्प एम्स 'मध्यम है कि लगता है। इसके अलावा, फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रिया, पृथक औषधीय इस समाधान में, एकल फोटोरिसेप्टर (चित्रा 2 ई) से दर्ज की याद ताजा करती है कि एक साधारण तरंग हो गया लगता है। फिर भी, कुछ खुले सवालों के जवाब में विवो शर्तों के तहत मनाया अन्य एर्ग संकेत घटकों के अस्तित्व के बारे में रहते हैं। आम तौर पर एक vivo में एर्ग प्रतिक्रिया की बी-लहर की बढ़ती चरण में मनाया जाता है कि 150 हर्ट्ज दोलन लहरें - उदाहरण के लिए, हमारे पूर्व vivo रिकॉर्डिंग की स्थिति में हम प्रमुख oscillatory क्षमता, 100 नहीं देखा था। इस प्रकार यह संभव है कि हमारे पूर्व vivo में भीतरी रेटिना समारोह पूर्व vivo बी-तरंगों द्विध्रुवी सेल समारोह पर व्यवहार्य फंसा हालांकि M> शर्तों के साथ छेड़छाड़ की गई थी। भविष्य के अध्ययन यहाँ दिखाया गया प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में संशोधन (विच्छेदन, छिड़काव आदि) अमेरिका के पूर्व vivo शर्तों के तहत oscillatory क्षमता को रिकॉर्ड करने की अनुमति होगी कि क्या हल करना चाहिए।

कोन समारोह हमारी दृष्टि के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, शंकु की जांच के लिए विशेष रूप से 33 रेटिना माउस में उनके छोटे आकार और कमी आड़े आती है। उनके एम शंकु और छड़ लगभग समान वर्णक्रमीय संवेदनशीलता 30 क्योंकि शंकु समारोह के अलगाव माउस एर्ग रिकॉर्डिंग में आगे जटिल है। मानक प्रोटोकॉल रॉड-दबा पृष्ठभूमि प्रकाश का उपयोग करके रॉड और कोन संवेदनशीलता के बीच कई लॉग-इकाई अंतर का फायदा उठाते हैं। हालांकि, स्थिर पृष्ठभूमि प्रकाश छड़ 34,35 असंवेदनशील और छड़ और शंकु के बीच की खाई junctional युग्मन के मॉडुलन के माध्यम से संभवतः शंकु समारोह को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है <समर्थन> 36,37। इस प्रकार, यह शंकु को प्रभावित किए बिना संतृप्त छड़ रखने के लिए काफी उज्ज्वल है कि एक पृष्ठभूमि के प्रकाश की तीव्रता खोजने के लिए मुश्किल है। यहाँ हम कम संवेदनशीलता और शंकु 19,29,30 की तेजी से वसूली कैनेटीक्स दोनों का लाभ लेता है कि एक वैकल्पिक डबल फ्लैश विधि प्रदर्शित करता है। इस तरह से यह सही मायने में अंधेरे अनुकूलित शंकु की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं को अलग करने के लिए आसान है। हम एम्स 'या किसी भी ब्लॉकर्स बिना लोके के समाधान में, वसूली तरंग का विवरण कुछ हद तक उज्ज्वल जांच और परीक्षण चमक के उपयोग के द्वारा प्रयोग के दौरान प्रभावित कर रहे थे। इस शंकु की प्रतिक्रियाएं अलग करने के लिए घटाव विश्लेषण जटिल। हालांकि, बेरियम द्वारा glial घटक को हटाने परिवर्तनशीलता मुलर सेल घटक की वजह से था यह दर्शाता है कि प्रतिक्रियाओं की पूंछ को स्थिर करने में मदद की। इस तरह से यह WT चूहों (चित्रा 3) में अंधेरे अनुकूलित कोन संचालित प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए संभव था। डबल फ्लैश द्वारा अलग शंकु की प्रतिक्रियाएंरॉड गतिविधि 17,37 को दबाने के लिए पृष्ठभूमि प्रकाश का उपयोग करके WT चूहों से दर्ज की गई है उन लोगों की तुलना के रूप में WT चूहों से तकनीक में छोटे दिखाई दिया। इस अंतर को धीरे-धीरे (न्यूनतम 10) के भीतर शायद कारण शंकु प्रतिक्रियाएं 37-39 की रॉड की मध्यस्थता दमन को हटाने के लिए कोन प्रतिक्रिया आयाम को बढ़ाता है कि पृष्ठभूमि प्रकाश की एक अच्छी तरह से विशेषता प्रभाव से समझाया जा सकता है।

सारांश में, यहाँ का प्रदर्शन विधि रेटिना के समारोह का अध्ययन करने के लिए संभव पूर्व vivo electrophysiological रिकॉर्डिंग बनाता है। भविष्य में, हम कई और अधिक प्रयोगशालाओं जानवर और मानव रेटिना के शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस शक्तिशाली विधि अनुकूल होगा और रेटिना समारोह के बारे में हमारी समझ के अग्रिम और रोगों चकाचौंध के लिए बेहतर चिकित्सा के विकास की उम्मीद है।

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Disclosures

सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय Xenotec, इंक के साथ एक लाइसेंस समझौता किया है और पूर्व vivo एडाप्टर की बिक्री से रॉयल्टी प्राप्त हो सकता है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच अनुदान EY019312 और EY021126 (VJK), वाशिंगटन विश्वविद्यालय में नेत्र विज्ञान विभाग और दृश्य विज्ञान के लिए EY002687 द्वारा समर्थित किया गया था, और अनुसंधान के द्वारा अंधापन रोकने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 99 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी electroretinogram एर्ग, रेटिना फोटोरिसेप्टर रॉड शंकु एक लहर बी-लहर औषधि परीक्षण
समकालिक<em&gt; पूर्व vivo</emदो Retinas की&gt; कार्यात्मक परीक्षण से<em&gt; Vivo</em&gt; Electroretinogram सिस्टम
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Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

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