Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Одновременный Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52855

Introduction

Электроретинограмму (ЭРГ) является хорошо отработанной технологией, которая может использоваться для записи электрической активности сетчатки, вызванного светом. Сигнал ЭРГ генерируется в основном изменения напряжения, вызванных радиальных токов (вдоль оси фоторецепторов и биполярных клеток), протекающей в резистивном внеклеточном пространстве сетчатки. Первый сигнал ЭРГ был записан в 1865 году Холмгреном от поверхности рыбий глаз 1. Эйнтховен и Джолли 1908 2 делится ответ ERG в начале света в трех различных волн, называемых А-, B- и С-волн, которые в настоящее время, как известно, отражает главным образом деятельность фоторецепторов, ПО биполярных клеток и пигментного эпителия Клетки, соответственно 3-8. ЭРГ может быть записан от глаз под наркозом животных или человека (в естественных условиях), с изолированной подготовки глаз 9, по изолированной неповрежденной сетчатки (экс естественных условиях) 3,10-15 или через определенные слои сетчатки с микроэлектродов (местноеЭРГ) 4,16. Из них в естественных условиях ЭРГ в настоящее время наиболее широко используемый метод для оценки функции сетчатки. Это неинвазивный метод, который может быть использован в целях диагностики или следовать прогрессирование заболеваний сетчатки у животных или пациентов. Тем не менее, в естественных условиях ERG записи производят сложную сигнал с нескольких перекрывающихся компонентов, часто загрязнены экстраокулярной физиологического шума (например, дыхания и сердечной деятельности).

Местное ЭРГ может быть использован для записи сигнала через конкретных слоев сетчатки, но это наиболее инвазивная и имеет самый низкий сигнал-шум (SNR) по сравнению с другими конфигурациями записи ЭРГ. Местное ЭРГ также технически сложных и требует дорогостоящего оборудования (например, микроскопа и Микроманипуляторы). Transretinal ЭРГ от неповрежденной, изолированные сетчатки (экс естественных ЭРГ) предлагает компромисс между в естественных условиях и местных методов ЭРГ позволяет стабильно и HIGч SNR записи из неповрежденных сетчатки животных и человека. 17 В последнее время этот метод был успешно использован для изучения функции палочек и колбочек фоторецепторов в млекопитающих, приматов и человека сетчатки 18-20. Кроме того, из-за отсутствия пигментного эпителия в сетчатку экс естественных условиях, положительно компонент с волны сигнала ERG удаляется и ярко выраженными негативными медленная компонента PIII раскрывается в Экс Vivo записей. Медленная компонента PIII было показано, происходят из деятельности Клетки Мюллера клеток в сетчатке 21-23. Таким образом, экс виво метод ЭРГ также может быть использован для изучения Мюллера клеток в интактной сетчатке. Несколько исследований также показали, что экс естественных условиях ERG записи может быть использован для измерения концентрации фармакологических агентов по сетчатке 24 и проверить безопасность и эффективность препаратов 25-27.

Несколько коммерческих систем в естественных условиях имеются ииспользуется во многих лабораториях, которые не обязательно имеют большой фон электрофизиологии. В отличие от экс естественных устройства не не были доступны до недавнего 17, и в результате только очень немногие лаборатории в настоящее время воспользоваться этой мощной техники. Это было бы выгодно, чтобы экс естественных ERG записи доступны более лабораториями в целях продвижения наши знания о сетчатки физиологии и патологии, а также разработать новые методы лечения для ослепления заболеваний. Покажем здесь простое и доступное экс виво ERG устройство 17 и показать, как оно может быть использовано в сочетании с несколькими коммерчески доступных систем в естественных условиях ЭРГ записывать rod- и конуса-опосредованной передачи сигналов (А- и В-волны) и функция Müller клеток (замедлить PIII) из неповрежденных сетчатки мыши дикого типа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные протоколы были в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом институциональной исследования животных в Вашингтонском университете в.

1. Настройка перфузии и Держатель образца

  1. Получают раствор для сетчатки перфузии свежей на день эксперимента. Используйте дистиллированную и деионизированную воду. Используйте один из следующих трех решений.
    1. Подготовьте бикарбонат-содержащие 'решение (1 л): 1 бутылка Эймса Ames' СМИ и 1,9 г NaHCO 3,
    2. Получают раствор Локка (в мм): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na сукцинат, 0,5 Na глутамат, 0,02 ЭДТА и 10,0 глюкозы, 0,1% MEM витаминов и амино кислоты
    3. Подготовьте HEPES-буферный раствор Рингера (в мМ): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl 2, CaCl 2, 1,0, 10,0 глюкозы, 0,01 ЭДТА, 12,0 HEPES, рНдоводят до 7,5 с ~ 5,8 мл 1 М NaOH, добавляют 0,72 г / л культуральной среды Леибовиц L-15. Используйте 20 - 50 мкМ DL-AP4 и 50 - 100 мкм BaCl 2 изолировать ответ фоторецепторов с любой перфузии средств массовой информации.
  2. Получают раствор для электродов 28 (в мм): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, MgCl2, 2,4, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 ЭДТА и доведения рН до 7,4 - 7,5 с помощью NaOH. Электрод раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  3. Подготовка и проверить держатель образца.
    1. Клей черный / серый фильтр на верхней части купола нижней части держателя образца (см рисунок 1А). Распространение двухкомпонентный 5 мин эпоксидный клей тщательно по краям плоскими вершинами куполов. При необходимости, сделайте это под микроскопом рассечение.
    2. Подождите, пока клей не станет почти сухим (около 4 минут), а затем нажмите на фильтровальную бумагу купола с помощью плоской пункта. Клей бумажный фильтр, по крайней мере за один день до эксперимента.фильтровальная бумага может быть использована несколько раз, но должен быть заменен после месяца записи. Используйте 70% этанола тщательно очистить от купола остатков клея перед установкой замены бумаги.
    3. Заполните электродов каналов с решением электрод пытается избежать пузырьков воздуха и винт на пеллетах электроды, заключенные с резьбовым переходником электродных каналов (см и В). Подключите верхние и нижние части держателя образца с помощью четырех винтов и заполнить перфузии линии с раствором электрода.
    4. Измерьте сопротивление и напряжение между выводами каждой пары электродов, используя мультиметр (рис 1B). Сопротивление должно быть ниже 100 П & и ниже 10 мВ напряжения, если каналы пузырьков и электроды находятся в хороших условиях.
  4. Залить 400 - 700 мл перфузии средств массовой информации в стеклянной бутылке. Отдельная еще 300 мл, которые будут использоваться в рассечения сетчатки и сразорвал его в холодильнике. Установите трубки перфузии в блоке теплообменника и поместите предварительно нагретой блок на нагревательной пластины (рис 1D).
  5. Приложите бутылку с крышкой, которая имеет соединения с CO 2 / O 2 газа (если используется Эймс "или Локка) и для перфузии трубки (рис 1D). Разогреть бутылку со СМИ до 37 ° С и поместить его на нагревательной пластины или на верхней части света единицы стимуляции в водяной бане до 37 - 39 ° С 17.
    1. Премьер перфузии линии, заполняя их перфузии СМИ инициировать поток тяжести приводом.
      1. В системе LKC, поместить бутылку на верхней части блока 17 стимулятора, чтобы обеспечить значительный гравитационный поток, который затем доводят с помощью регуляторов скорости потока без влияния на снижение уровня перфузии раствора в бутылке в процессе эксперимента.
      2. В системе Ocuscience, поместите рerfusion бутылки в клетке Фарадея, чтобы минимизировать шум и задолго перфузии выходных линий от держателя образца (см шаг 2,8) ниже уровня держатель образца (и перфузии бутылки) для увеличения гравитационного диск решения. Щит эти выходные линии и подключите экран к земле усилителя, чтобы предотвратить сцепление электромагнитного шума в сигнале ERG.
  6. Отрегулируйте перфузии до 3 - 5 мл / мин с помощью регуляторов расхода. Подключите 5% CO 2/95% O 2 газа из баллона с регулятором надлежащего и регулировать расход, чтобы обеспечить устойчивый пузырьков СМИ в бутылке через воздушный камень.

2. Подготовка образцов

  1. Соберите чистые и острые инструменты, включая рассечение прямой холодного microscissors, один или два 45 Ø пинцетом, и лезвие бритвы прямоугольного куска фильтровальной бумаги.
  2. Налейте около 200 мл холодной perfuSion раствор в большую чашку Петри таким образом, чтобы вся нижняя часть держателя образца (в том числе купола) можно погрузить в раствор. Этот шаг становится важным при монтаже сетчатки на куполах (см шаг 2,6). Хотя некоторые решения предназначены для быть насыщена карбогена (5% CO 2/95% O 2), это не является необходимым для целей рассечение и не было сделано в экспериментах, описанных здесь.
  3. Для типичного эксперимента, держать животных в 12/12 часов темный / цикл свет и тьма-адаптировать их в течение 6 - 12 часов до запланированного записей. Эвтаназии животное СО 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков при тусклом красном свете, и делать все следующие процедуры при тусклом красном или ИК света (например, использовать, красный фильтр перед источником света микроскоп).
    1. Потяните глаза с помощью пинцета и положите их в средствах массовой информации. Поместите один глаз, в то время на небольшом листе бумаги (например, некоторые регулярные фильтровальной бумаги) и сделать какгорит примерно на уровне зубчатый край, удерживая глаз с помощью пинцета (это делается за пределами решения здесь).
  4. Вырезать по зубчатый край (или ближе к экватору глаза) с microscissors и удалить роговицы и хрусталика. Поместите чашку глаз в холодной СМИ в большой чашке Петри и повторите ту же процедуру с другим глазом.
  5. Вырезать небольшой разрез от верхней части чаши глаза к зрительному нерву, сохраняя ножницы между сетчаткой и склеры, чтобы сохранить сетчатки, как нетронутыми, насколько это возможно. Ручка склеры с обеих сторон разреза с помощью двух пинцетов и тянуть пинцетом друг от друга, чтобы отделить сетчатку.
    1. Вырезать зрительного нерва и попытаться изолировать сетчатку с минимальным количеством физического контакта с дистальной поверхности. НПП будет в основном отделить автоматически от сетчатки в процессе вскрытия. Это более важно, чтобы избежать механического повреждения сетчатки, чем на выполнениерассечение быстро, как правило, сетчатки можно инкубировать в течение 30 мин в растворе без существенных эффектов на свойства реагирования.
  6. Установите сетчатки на куполах держателя образца (рис 1в). Погружают нижнюю часть держателя образца в чашке Петри с рассеченных сетчатки. Slide сетчатки фоторецепторов сторону (выпуклой поверхности изолированной сетчатки) вверх, выше купола и поднимите держатель образца таким образом, что сетчатка придает на фильтровальной бумаге. Повторите процедуру для другой сетчатке.
  7. Высушите держателе тщательно, чтобы предотвратить электрический перекрестных помех между сетчаткой, а также шума и сигнала шунтирование. Держатель образца имеет уплотнительные кольца вокруг нижней части купола, чтобы предотвратить разлив раствора между верхней и нижней частей держателя, а также, чтобы помочь электрическую изоляцию фоторецепторов и ганглиозных клеток сторон отдельных сетчатки. Прикрепите верхнюю часть держателя с четырьмя винтами (рис 1b) и заполнить каналы с перфузии перфузии раствором с помощью шприца и иглы.
  8. Передача Держатель образца рядом с блоком теплообменника тепла и подключить входные и выходные линии перфузии в держателе образца (рис 1D). Подключите электроды к усилителю ERG (топ электроды подключаются к земле / минус штифта в усилителе) и прикрепить блок стимулятор / управления на держатель образца с помощью адаптера или сдвиньте грелку в стимулятор устройства в зависимости от которого в естественных условиях Система ERG используется.

3. Записи

  1. Настройка усилителя и стимулирования параметров с помощью программного обеспечения системы в естественных условиях. Установите частоту приобретения до значения между 1 и 10 кГц и низкочастотной фильтрации до 300 Гц. Не использовать фильтрацию высоких частот. Используйте 60 Гц (или 50 Гц в Европе), если необходимо Notch Filter.
  2. Запись исходных без световой стимуляции и остроумиеч тусклый стимуляции (например., зеленый свет -35 дБ или 0,3 мкд см -2), чтобы проверить на хорошей электрической связи между электродами и сетчатки образца. Подождите 10 - 20 мин до начала сбора данных, так что температура и сетчатки функция достижения стабильного состояния.
    1. Выберите параметры по стимулированию в соответствии с какой-либо конкретной эксперимента и начать сбор данных. Например, использовать зеленый свет от -40 до 0 дБ или от 0,1 до 1000 мкд см -2 для скотопического семьи отклика. Используйте около 2 до 3 журнала-единицы ярче мигает фотопических записей, где стержни должны быть подавлены фонового освещения (3 - 30 CDM -2) или вспышки зонда (около 1,3 см -2 Cd = 1 дБ, рисунок 3).
    2. Однако помните, что точные значения интенсивности света может быть несколько в зависимости от вашего калибровки системы и условий эксперимента. Как правило, масштабные интенсивности вниз на 5 - 10 раз по сравнению с в естественных условиях 17. Черное покрытие с отверстиями над сетчатки (включенных в коммерческой системе адаптера) может быть использован для уменьшения рассеяния света в держатель образца и облегчить гомогенное и равного стимуляции обоих сетчатки в Ganzfeld сфере коммерческой системы в естественных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для записи с темно-адаптированных сетчатки, интенсивности тестовых вспышек, используемых в типичном эксперименте отбеливателя только ничтожная доля пигмента, так что отсутствие НПП приводом регенерации не проблема. Кроме того, было показано ранее, что регенерация конуса пигмент может еще иметь место в изолированной сетчатки с помощью Мюллер клеток зрительного цикла 20.
  3. Как правило, эксперименты длиться от 30 мин до нескольких часов, мониторинг базовой линии, уровень шума и стабильность реакции в ходе эксперимента, как изменения в них может указывать технические проблемы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение или уменьшение шумаамплитуды г реагирования может указывать пузырьков воздуха в перфузии или электродных каналов, слишком высокую или низкую температуру, решение утечка / разлива или смещения сетчатки.

4. Очистка

  1. Снять держатель образца от перфузии линий, откройте его и промойте сетчатку от фильтровальной бумаги. Удалите электроды и ополосните их дистиллированной водой (не используйте этанол). Очистить Держатель образца (в том числе перфузионных каналов) с этанолом и / или дистиллированной воды. Флеш трубки перфузии осторожно> 70% этанола.
  2. Промойте перфузии бутылку с дистиллированной водой (не используйте моющие средства). Этанол может быть также использован для очистки бутылку.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы записали флеш ответы темно-адаптированы дикого типа (WT), C57BL / 6 мыши сетчатки, следуя экспериментальные протоколы, описанные выше и показанные на рисунке 1, используя различные стандартные решения перфузии (Рисунок 2). Сигналы ответа и кинетика а также чувствительность фоторецепторов палочек появилось подобное в Эймса и СМИ Локка (фиг.2А и В). С другой стороны, в соответствии с HEPES-буферным раствором Рингера (бикарбонат или нет 5% CO 2/95% O 2) амплитуды отклика были значительно меньше. Мы также обнаружили, что в этих условиях стабильность б-волна была скомпрометирована. Добавление 40 мкМ APB (DL-АР4) удаляется положительный б-волна эффективно во всех трех средах (рис 2D-F). Удаление б-волны выявил большой медленный волну негатива (рис 2D), что было обусловлено деятельностью Müller клеток 21. Добавление 100 &# 956; М бария отменил этот компонент, открывая фоторецепторов ответ экс естественных ERG сигнала (рис 2D-F). Мы могли бы записать до 1 мВ насыщенных ответов фоторецепторов в Эймс 'и Локка, тогда как максимальные ответы были, как правило, около 200 мкВ до Ringer перфузии.

Конус ответы фоторецепторов были выделены ранее, так называемым методом двойной флэш-где яркая вспышка зонд насыщения стержней, а затем проверку вспышки в момент, когда шишки восстановили свою темную приспособлены государство, но стержни остаются насыщенными 19,29. Здесь мы выделили конус-опосредованной ЭРГ ответов (содержащий как А- и В-волны) в средствах массовой информации Эймса с добавлением 100 мкМ бария, но не DL-AP4 с помощью двойной метод вспышки (рисунок 3). Бария был использован для удаления медленно глиальных компонент, который, казалось, сделать поздний часть ответов более переменных, особенно при многократном использовании brighт мигает. Мы использовали вспышку постоянную зонда насытить стержней и переменные мигает тест 300 мс после вспышки зонда, чтобы получить ответы конуса. Семья ответ конус, полученный путем вычитания зонд вспышки ответ от «датчиков + испытаний флэш" ответов показано на рисунке 3B.

Фигура 1
Диаграмма 1. Использование экс виво ЭРГ держатель образца. (А) Заполнение электродов каналов и монтажа электродов. (Б) Тестирование собранном держателе образца перед рассечением путем измерения сопротивления и напряжения между парами электродов. (С) Установка сетчатки на фильтровальной бумаге в держатель образца. (D) держателя образца, подключенного к перфузии линий и ERG усилителя в коммерческом ЭРГ SYстволовых. Путь перфузии потока указано синими стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Фигура 2. семейства Flash-ответ, записанные с темно-адаптированы WT сетчатке мыши перфузии с Локка (а), Эймса (б) и HEPES-забуференном Рингера (C) среды. Мигает доставлены 3, 40, 130, 390 и 1400 мкм -2 фотонов (от -36 до -9 дБ или -3,6 -0,9 журнал (Cd см -2) зеленый свет (530 нм)). Черные следы в (DF) шоу ответов, записанных с сетчатки в (AC) после добавления 40 мкМ APB и 100 мкМ бария. Красные следы в (D) показывают ответов, записанных от сетчатки в (A) перфузию Локка с добавлением 40 мкМ APB, но не бария. Вставка показывает ответы на три тусклые вспышки в СМИ Локка, содержащих APB и барий. Мигает в диапазоне от 7 до 14000 фотонов мкм -2 (от -32 до +1 дБ зеленый свет) в (D), от 3 ​​до 1400 мкм -2 фотонов (от -36 до -9 дБ зеленый свет) в (E), и от 7 до 1400 фотонов мкм -2 (от -32 до -9 дБ зеленый свет) в (F). См Винберг и др. 2014 17 и Любарский др., 1999 30 и 2004 31 для деталей преобразования световой энергии Дневное приводятся в кд см -2 с фотонами мкм -2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

нагрузка / 52855 / 52855fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Выделение ответов конуса с двойным способом вспышки в WT мыши. () Ответ, чтобы исследовать вспышку (14000 фотонов мкм -2 или 1 дБ зеленый свет, черный) и ответ на вспышку зондировать, а затем проверку вспышки (81,000 фотоны мкм -2 или 9 дБ зеленый свет, красный). (Б) Конус флеш ответы на тест вспышки, начиная от 360 до 81000 фотонов мкм -2 (-14 до 10 дБ зеленый свет), выделенные путем вычитания ответ зонд вспышки от " Зонд + тест флэш "ответ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы демонстрируем здесь важные шаги для получения высококачественных экс естественных ERG записи одновременно с двумя изолированными сетчатки мыши с помощью компонентов в естественных условиях системы ЭРГ вместе с экс естественных ERG адаптера. В этом исследовании мы перфузии обе сетчатки от животного тем же раствором (либо Ames ', Локка или Рингера), но можно также заливать каждый сетчатку с другим раствором, например, для целей тестирования на наркотики. Наиболее важные шаги для получения данных высокого качества являются экранирующие от электромагнитных помех, тщательного вскрытия сетчатки, устойчивый и относительно быстрый поток перфузии с помощью передовых изготовленный на заказ держатель образца, а также выполнение всех процедур пробоподготовки при тусклом красном (или ИК) легкий. Метод, описанный здесь позволяет немедленное использование обоих сетчатки и двойного использования в естественных условиях установки ЭРГ выполнять в естественных условиях и бывших естественных условиях ЭРГ записей.

_content "> изготовленный на заказ экс естественных ЭРГ держатель образца недавно разработанный нами 17, и теперь в продаже, улучшает SNR по эффективной электрической изоляции проксимальных и дистальных отделов сетчатки и оптимизирует поток перфузии над сетчатки (курсу высокого разрешения .) Отсутствие медленных частотных составляющих шума в сигнале экс естественных ERG позволяет количественный анализ даже от очень маленьких ответов Тем не менее, мы обнаружили, что экс естественных записи более склонны к помехам линии переменного тока мощности шума (60 Гц в США;. 50 в Европе Гц), чем естественных условиях экспериментов в. Этот шум связан с сигналом в основном через перфузии линии, и это может быть в основном удалены экранирования (и заземления) всех компонентов перфузии (бутылки, трубки), проживающих за пределами клетки Фарадея или Ganzfeld сферы . Кроме того, иногда 60 Гц шума, соединенный с экс виво сигнала ЭРГ через теплообменник и этот шум может также быть удалена путем заземления. </ P>

Покажем, как удалить конкретные компоненты ЭРГ сигнала путем добавления фармакологических блокаторов в перфузии в ходе эксперимента, позволяющего рассечение функции различных типов клеток в том же эксперименте сетчатки / три различных физиологических средах перфузии (рисунок 2). Недавнее исследование показало, что выбор перфузии СМИ влияет фоторецепторов физиологию в отдельных записей клеток 32. Здесь мы использовали Эймса, Локка и Медиа HEPES звонарь ', чтобы записать темно-адаптированы ответов флеш в отсутствие и в присутствии реагентов, предназначенных фармакологических изолировать фоторецепторов составляющую сигнала ERG (рис 2). Бикарбонат буфером решения дали большие А- и B-волновых амплитуд, до 1 мВ. Фоторецепторов тусклый флеш ответы под среде Локка с блокаторами содержится сложный восстановления сигнала (см вставку на рис 2D), что не было видно с AmesR17; или звонка перфузии. При использовании экс естественных ERG становится более адаптированы лабораторий было бы полезно использовать те же средства массовой информации и перфузии стандартные методы, чтобы изолировать различные компоненты сигнала. В этот момент кажется, что наиболее универсальным вариантом является среде Эймса, потому что это дает стабильные и крупные А- и B-волновых амплитуд. Кроме того, реакция фоторецепторов, изолированный фармакологически в этом растворе, по-видимому, имеют простую форму волны, напоминающий, что записаны в отдельных фоторецепторов (рис 2E). Тем не менее, некоторые открытые вопросы остаются о существовании других компонентов ЭРГ сигнала наблюдается в условиях естественных. Например, в наших бывших естественных условиях съемки мы не видели видные колебательные потенциалы, 100 - 150 Гц колеблющиеся волны, что, как правило, наблюдается в фазе роста В-волны в естественных условиях ERG ответ. Таким образом, возможно, что внутренняя функция сетчатки в наш экс виво Экс Vivo B-волны причастны жизнеспособным ПО функции биполярного клеток. Будущие исследования должны решить ли изменения в экспериментальных протоколов, показанных здесь (рассечение, перфузии и т.д.) позволит нам записывать колебательные потенциалы под бывших естественных условиях.

Функция конуса является жизненно важным для нашего видения. Тем не менее, исследование конусов препятствует их небольшого размера и нехватки особенно в мыши сетчатки 33. Выделение функции конуса осложняется в мыши ЭРГ записей, потому что их М-конусы и стержни имеют почти идентичные спектральные чувствительности 30. Стандартные протоколы воспользоваться несколькими разницы лог-единицу между палочек и колбочек чувствительности с помощью стержня подавления фона свет. Тем не менее, устойчивый фон свет, как известно, уменьшают чувствительность стержней 34,35 и влияет на функции конуса, возможно, через модуляцию зазора соединительного связи между палочками и колбочками <SUP> 36,37. Таким образом, трудно найти справочную интенсивность света, что является достаточно ярким, чтобы держать стержни насыщенные, не затрагивая конусы. Здесь мы показываем, альтернативный метод двойного флэш, который использует как низкой чувствительности и быстрее кинетики восстановления конусов 19,29,30. Таким образом, легче выделить действительно темно-адаптированных конус-опосредованные ответы. Мы заметили, что в Ames 'или растворов Локка без каких-либо блокаторов, детали восстановления сигнала были несколько затронуты в ходе эксперимента по использованию ярких зонда и тестовых вспышек. Это усложнило анализ вычитание, чтобы изолировать ответов конуса. Тем не менее, удаление глиальных компонент барием позволило стабилизировать хвост ответов, указывающих, что изменчивость связано с компонентом Müller клеток. Таким образом, можно было получить темно-адаптированных конус управляемой реакции в WT мышей (рис 3). Ответы конуса, изолированных двойным вспышкиТехника от WT мышей появились меньше по сравнению с тем, записывается с WT мышей с помощью фонового света, чтобы подавить активность стержень 17,37. Это различие может быть объяснено хорошо охарактеризованных эффекта фонового света, медленно (в течение 10 мин) увеличивает амплитуду отклика конус, вероятно, из-за удаления стержня подавления опосредованной ответов конуса 37-39.

Таким образом, здесь было показано делает возможным исключая виво Электрофизиологические записи для изучения функции сетчатки. В будущем, мы надеемся, что намного больше лабораторий будет адаптировать этот мощный метод изучения физиологии и патологии животных и человеческой сетчатки и продвигать наше понимание функции сетчатки и разработать более эффективные методы лечения для ослепления заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Университет Вашингтона в Сент-Луисе имеет лицензионное соглашение с Xenotec, Inc. и могут получать роялти от продажи экс естественных адаптера.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH гранты EY019312 и EY021126 (VJK), EY002687 в Департамент офтальмологии и визуальных наук в Университете Вашингтона, и исследований, чтобы предотвратить слепоту.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Tags

Неврология выпуск 99 электрофизиологии электроретинограммы ЭРГ, сетчатки фоторецепторов штанга конус волны б-волна тестирование на наркотики
Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinberg, F., Kefalov, V.More

Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter