Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Samtidig Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52855

Introduction

Elektroretinogram (ERG) är en väletablerad teknik som kan användas för att registrera den elektriska aktiviteten i näthinnan utlöses av ljus. ERG signal genereras huvudsakligen av spänningsändringar orsakade av radiella strömmar (längs axeln av fotoreceptorer och bipolära celler) som flyter i det resistiva extracellulära utrymmet av näthinnan. Den första ERG signalen spelades in 1865 av Holmgren från ytan av ett fisköga 1. Einthoven och Jolly 1908 2 dividerat ERG svar på uppkomsten av ljus i tre olika vågor, kallade a-, b-, och c-vågor, som nu är kända för att reflektera huvudsakligen aktiviteten av fotoreceptorer, ON bipolära celler, och pigmentepitel celler, respektive 3-8. ERG kan spelas in från ögonen på sövda djur eller människor (in vivo), från isolerade ögonpreparat 9, över isolerad intakt näthinnan (ex vivo) 3,10-15 eller över specifika näthinnan skikt med mikroelektroder (lokalERG) 4,16. Av dessa är in vivo-ERG för närvarande den mest använda metoden för att bedöma näthinnefunktion. Det är en icke-invasiv teknik som kan användas för diagnostiska ändamål eller för att följa framskridandet av retinala sjukdomar hos djur eller patienter. Men in vivo ERG inspelningar producera en komplicerad signal med flera överlappande komponenter, ofta förorenade av extraocular fysiologiska buller (t.ex. andning och hjärtverksamhet).

Lokal ERG kan användas för att spela in signalen över specifika skikt i näthinnan, men det är den mest invasiva och har den lägsta signal-till-brusförhållandet (SNR) jämfört med de andra ERG inspelningskonfigurationer. Lokal ERG är också tekniskt krävande och kräver dyr utrustning (t.ex. mikroskop och mikromanipulatorer). Transretinal ERG från den intakta, isolerade näthinnan (ex vivo ERG) erbjuder en kompromiss mellan in vivo och lokala ERG metoder möjliggör en stabil och high SNR inspelningar från intakta näthinnor av djur eller människor 17. På senare tid har denna metod använts framgångsrikt för att studera tappar och stavar ljusmätare funktion i däggdjurs, primat och mänskliga näthinnor 18-20. På grund av bristande pigmentepitel i ex vivo näthinnan, den positiva c-vågkomponent av ERG signalen bort och en framstående negativ långsam PIII komponent avslöjas i ex vivo inspelningar. Den långsamma PIII komponent har visat sig härröra från aktiviteten hos Müller gliaceller i näthinnan 21-23. Sålunda kunde ex vivo ERG metoden också användas för att studera Muller-celler i intakt näthinna. Flera studier har också visat att ex vivo ERG inspelningar kan användas för att mäta koncentrationen av farmakologiska medel runt näthinnan 24 och testa säkerheten och effekten av droger 25-27.

Flera kommersiella in vivo system finns ochanvänds i många laboratorier som inte nödvändigtvis har omfattande elektro bakgrund. Däremot har ex vivo-enheter inte varit tillgänglig förrän nyligen 17 och som ett resultat endast ett fåtal laboratorier för närvarande drar nytta av denna kraftfulla teknik. Det skulle vara fördelaktigt att göra ex vivo ERG inspelningar tillgängliga för fler laboratorier i syfte att förbättra vår kunskap om retinal fysiologi och patologi, och att utveckla nya terapier för bländande sjukdomar. Vi visar här en enkel och prisvärd ex vivo ERG anordningen 17 och visar hur den kan användas i kombination med flera kommersiellt tillgängliga in vivo ERG-system för att spela in stång- och kon-förmedlad signalering (A- och B-vågor) och funktionen hos Müller-celler (långsam PIII) från intakta vildtyp mus näthinnor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella protokoll överensstämde med handledningen för vård och användning av försöksdjur och godkändes av Institutional Animal Studies kommittén vid Washington University.

1. Installera Perfusion och provhållare

  1. Bered lösningen för näthinnan perfusion färskt på dagen för experimentet. Använda destillerat och avjoniserat vatten. Använd ett av följande tre lösningar.
    1. Förbered bikarbonatinnehållande Ames lösning (1 L): 1 flaska Ames media och 1,9 g NaHCO 3,
    2. Bered Lockes lösning (i mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCla 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCOs 3, 3,0 Na-succinat, 0,5 Na-glutamat, 0,02 EDTA och 10,0 glukos, 0,1% MEM-vitaminer och amino- syror
    3. Förbered HEPES-buffrad Ringer-lösning (i mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCla 2, 10,0 glukos, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHjusterades till 7,5 med ~ 5,8 ml av 1 M NaOH, tillsätt 0,72 g / I Leibovitz odlingsmedium L-15. Använd 20-50 iM DL-AP4 och 50-100 iM BaCl2 att isolera ljusmätare svar med någon perfusion medier.
  2. Bered lösningen för elektroderna 28 (i mm): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCla 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA och justera pH till 7,4-7,5 med NaOH. Elektrod lösning kan förvaras vid rumstemperatur under flera månader.
  3. Förbered och testa preparathållaren.
    1. Limma svart / grå filterpapper ovanpå kupoler av provhållarens underdel (se figur 1A). Sprid två-komponent 5 minuter epoxilim försiktigt runt kanterna på de plana topparna av kupoler. Om det är nödvändigt, gör det under dissektion mikroskop.
    2. Vänta tills limmet är nästan torr (ca 4 min) och tryck på filterpapper på kupolerna med hjälp av en platt post. Lim filterpapper åtminstone en dag före försöket. Denfilterpapper kan användas flera gånger men bör bytas efter en månad av inspelningar. Använd 70% etanol för att rengöra kupoler försiktigt från någon limrester innan du installerar ny pappers.
    3. Fyll elektrodkanaler med elektrod lösning försöker undvika luftbubblor och skruva pellets elektroder medföljer en gängad adapter till elektrod kanaler (se figurerna 1A och B). Anslut övre och nedre delar av provhållaren med fyra skruvar och fylla perfusion linjer med elektrodlösning.
    4. Mät resistansen och spänningen mellan ledningarna för varje elektrod par med hjälp av en multimeter (Figur 1B). Motstånd bör vara under 100 Ωk och spänningen under 10 mV, om kanalerna är bubbelfri och elektroderna är i gott skick.
  4. Häll 400-700 ml perfusion medier i glasflaska. Separat ytterligare 300 ml för att användas i dissektion av näthinnor och sslet den i ett kylskåp. Ställ perfusionen slangen i värmeväxlarblocket och placera den förvärmda blocket på värmeplattan (se figur 1D).
  5. Inneslut flaskan med en kapsyl, som har anslutningar till CO 2 / O 2 gasen (om Ames 'eller Lockes används) och för perfusion slang (se figur 1D). Värm flaskan med media till 37 ° C och placera den på värmeplattan eller på toppen av ljusstimuleringsenheten i vattenbad inställd på 37 till 39 ° C 17.
    1. Prime perfusion linjer genom att fylla dem med perfusion medier för att initiera allvar driven strömning.
      1. I LKC systemet, placera flaskan på toppen av stimulatorns enheten 17 för att åstadkomma en betydande gravitationsflöde som sedan justeras med flödeshastighetsregulatorer utan att påverkas av den sänkta nivån av perfusionslösningen i flaskan under experimentet.
      2. I Ocuscience system placera perfusion flaska inuti Faradays bur för att minimera buller och placera lång perfusion utgångsledningar från provhållaren (se steg 2,8) långt under nivån för provhållaren (och perfusion flaska) för att öka gravitations enhet av lösningen. Skydda dessa utgångsledningar och anslut skärmen till förstärkarens marken för att förhindra koppling av elektromagnetiskt brus till ERG signalen.
  6. Justera perfusionen till 3 - 5 ml / min med användning av flödeshastighetsregulatorer. Anslut 5% CO2 / 95% O 2 gas från en cylinder med lämplig regulator och justera flödet för att säkerställa stadig bubblande av medierna i flaskan genom en luft sten.

2. Provberedning

  1. Montera rena och vassa dissektion instrument, däribland rakt blad microscissors, en eller två 45 o pincett, rakblad och en rektangulär bit filterpapper.
  2. Häll ca 200 ml kall perfusionslösning i en stor petriskål så att hela bottendelen av provhållaren (inklusive kupoler) kan doppas i lösningen. Detta steg blir viktig vid montering av näthinnor på kupolerna (se steg 2.6). Även om vissa lösningar är utformade för att vara mättad med karbogen (5% CO2 / 95% O2), är detta inte väsentligt för dissekering ändamål och inte skedde i de experiment som beskrivs här.
  3. För ett typiskt experiment, hålla djur i 12/12 timmar mörker / ljuscykel och mörk anpassa dem för 6 - 12 timmar före inspelningarna. Euthanize djuret genom CO 2 inandning följt av halsdislokation vid dåliga rött ljus och göra alla de följande förfarandena i dim rött eller IR-ljus (använd t.ex. rödfilter framför mikroskopet ljuskällan).
    1. Dra ögonen genom att använda pincett och lägg dem i media. Placera ett öga i taget på en liten bit papper (t.ex. en viss regelbunden filterpapper) och göra såtände ungefär på samma nivå som ora serrata medan du håller ögat med pincett (detta görs utanför lösningen här).
  4. Klipp längs ora serrata (eller närmare ekvatorn i ögat) med mikrosax och ta bort hornhinnan och linsen. Placera ögonkoppen i kylan media i stora petriskål och upprepa samma procedur med det andra ögat.
  5. Skär ett litet snitt från toppen av ögonkoppen mot synnerven genom att hålla saxen mellan näthinnan och sklera för att hålla näthinnan så intakt som möjligt. Grepp sklera från båda sidor av snittet genom att använda två pincett och dra pincetten bort från varandra för att lösgöra näthinnan.
    1. Skär synnerven och försöka isolera näthinnan med en minimal mängd av fysisk kontakt med den distala ytan. RPE kommer mestadels loss automatiskt från näthinnan under dissektionen processen. Det är viktigare att undvika mekanisk störning av näthinnan än att utföradissektion snabbt, i allmänhet näthinnor kan inkuberas minst 30 minuter i lösningen utan signifikanta effekter på responsegenskaperna.
  6. Montera näthinnor på kupoler av preparathållaren (Figur 1C). Sänk den nedre delen av preparathållaren i petriskål med dissekerade näthinnor. Skjut näthinnan, ljusmätare sida (den konvexa ytan av den isolerade näthinnan) uppåt, ovanför kupolen och lyft preparathållaren så att näthinnan fäster på filterpapper. Upprepa proceduren för den andra näthinnan.
  7. Torka hållarplattan noga för att förhindra elektrisk överhörning mellan näthinnor samt buller och signal växling. Provhållare har O-ringar runt den nedre delen kupoler för att förhindra lösningen spill mellan botten- och topp delar av hållaren samt att hjälpa elektrisk isolering av fotoreceptorer och gangliecell sidor av enskilda näthinnor. Fäst den övre delen av hållaren med de fyra skruvarna (se figur 1 B) och fylla perfusion kanaler med perfusionslösning genom användning av en spruta och en nål.
  8. Överför provhållare bredvid värmeväxlarblocket och anslut input och output perfusion linjer till provhållaren (Figur 1D). Anslut elektroderna till ERG förstärkare (bästa elektroder ansluta till marken / minus stift i förstärkaren) och fäst stimulatorn / styrenhet på provhållaren med hjälp av en adapter eller skjut värmedynan i stimulatorn enheten beroende på vilken in vivo ERG-systemet används.

3. Record

  1. Konfigurera förstärkare och stimulans inställningar med hjälp av systemets in vivo programvara. Ställ förvärvsfrekvensen till ett värde mellan 1 och 10 kHz och lågpassfiltrering till 300 Hz. Använd inte högpassfiltrering. Använd 60 Hz (eller 50 Hz i Europa) notchfiltret om det behövs.
  2. Spela baslinjen utan ljus stimulans och kvickheth dim stimulering (t.ex.., grönt ljus av -35 dB eller 0,3 MCD sm -2) för att testa för god elektrisk förbindelse mellan elektroderna och näthinnan provet. Vänta 10 - 20 minuter innan datainsamlingen så att retinal temperatur och funktion uppnå ett stabilt tillstånd.
    1. Välj stimulansparametrar enligt något specifikt experiment och starta datainsamlingen. T.ex. använder grönt ljus från -40 upp till 0 dB eller från 0,1 upp till 1000 McD sm -2 för en scotopic svar familj. Använd ca 2 till 3 log-enheter ljusare blinkar fotopiska inspelningar där stavar måste undertryckas av bakgrundsljus (3-30 Cdm -2) eller en sond blixt (ca 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, se Figur 3).
    2. Kom dock ihåg att de exakta ljusintensitetsvärden kan vara något beroende på din systemkalibrering och experimentella förhållanden. Som en tumregel, skalnivåer minskade med 5 - 10 gånger jämfört med in vivo 17. En svart omslag med öppningar ovanför näthinnor (ingår i det kommersiella adaptersystem) kan användas för att minska ljusspridning i provhållare och underlätta homogen och lika stimulering av båda näthinnor genom Ganzfeld sfär av kommersiella in vivo system.
      OBS: För inspelningar från mörkt anpassade näthinnan, intensiteten av test blinkar används i ett typiskt experiment blekmedel endast en försumbar del av pigment så att bristen på RPE-drivna förnyelse är inte ett problem. Dessutom har det tidigare visats att kon pigment regenerering fortfarande kan ske i den isolerade näthinnan via Müller cell visuella cykel 20.
  3. Som experiment varar normalt från 30 min upp till flera timmar, övervaka baslinjedrift, ljudnivå och svars stabilitet under försöket som förändringar i dessa kan tyda på tekniska problem.
    OBS: Ökad brus eller minskningd svar amplituder kan tyda på luftbubblor i perfusion eller elektrodkanaler, för låg eller hög temperatur, lösning läcka / spill eller förskjutning av näthinnan.

4. Rengöring

  1. Lossa provhållaren från perfusion linjer, öppna den och spola näthinnor från filterpapper. Ta bort elektroderna och skölj dem med destillerat vatten (använd inte etanol). Rengör provhållaren (inklusive perfusion kanaler) med etanol och / eller destillerat vatten. Flush perfusion slangar försiktigt med> 70% etanol.
  2. Skölj perfusion flaska med destillerat vatten (använd inte rengöringsmedel). Etanol kan också användas för att rengöra flaskan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi spelade in flash svar från mörk-anpassad vildtyp (WT) C57BL / 6 mus näthinnor genom att följa de experimentella protokoll som beskrivs ovan och illustreras i figur 1 genom att använda olika standard perfusionslösningar (Figur 2). De svarsvågformer och kinetik samt känslighet spö fotoreceptorer dök liknande Ames "och Lockes media (Figur 2A och B). Å andra sidan, i enlighet med HEPES-buffrad Ringer-lösning (ingen bikarbonat eller 5% CO2 / 95% O2) svars amplituder var betydligt mindre. Vi fann också att under dessa förhållanden b-våg stabilitet äventyras. Lägga 40 iM APB (DL-AP4) bort positiva B-våg effektivt i alla tre medierna (figurerna 2D-F). Borttagning av b-vågen visade en stor långsam negativ våg (Figur 2D) som har tillskrivits Müller cellaktivitet 21. Lägga 100 &# 956; M barium avskaffades denna komponent, avslöjar ljusmätare svaret från ex vivo ERG signal (Fig 2D-F). Vi kunde spela in upp till 1 mV mättade fotoreceptorsvar i Ames 'och Lockes medan maximala svar var typiskt runt 200 μV enligt Ringer perfusion.

Cone ljusmätare svar har tidigare isolerats genom så kallad dubbel blixt teknik där en ljus sond flash mätta stavarna följs av en testblixt i en tid då kottar har återställt sin mörka anpassad tillstånd men stavar förblir mättad 19,29. Här isolerade vi kon-medierad ERG svar (innehållande både a- och b-våg) i Ames media kompletterat med 100 | iM av barium men inte DL-AP4 med dubbel blixt teknik (Figur 3). Barium användes för att avlägsna den långsamma glia komponent som föreföll att göra den senare delen av svaren flera variabla särskilt under upprepad användning av bright blinkar. Vi använde en konstant sond blixt för att mätta stavar och variabla prov blinkar 300 msek efter sond blixten att framkalla kon svar. En kon svar familj erhålls genom att subtrahera sond flash svar från "sond + testblixt svar visas i figur 3B.

Figur 1
Figur 1. Användning av ex vivo ERG preparathållaren. (A) Fyllning av elektrodkanaler och montering av elektroderna. (B) Provning av det sammansatta provhållaren innan dissektion genom att mäta resistansen och spänningen mellan elektrodparen. (C) Montering av näthinnan på filterpapper i provhållaren. (D) Den preparathållaren ansluten till perfusion linjer och ERG förstärkare i kommersiella ERG systam. Perfusionen flödesbana indikeras med blå pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Flash svars familjer som spelats in från mörkt anpassade WT mus näthinnor perfusion med Lockes (A), Ames "(B), och HEPES-buffrat Ringer (C) medium. De blinkar levererade 3, 40, 130, 390 och 1.400 fotoner pm -2 (från -36 till -9 dB eller -3,6 till -0,9 log (Cd sm -2) grönt ljus (530 nm)). Svarta spår i (DF) visar svar som spelats in från näthinnor i (AC) efter tillsats av 40 iM APB och 100 iM barium. Röda spår i (D) visar svar som spelats in från näthinnan i (A) perfusion med Lockes kompletterat med 40 | iM APB men inte barium. Den infällda bilden visar svaren på de tre dimmest blinkar i Lockes medium innehållande APB och barium. De blinkar varierade från 7 till 14.000 fotoner pm -2 (från -32 till 1 dB grönt ljus) i (D), från 3 till 1.400 fotoner pm -2 (från -36 till -9 dB grönt ljus) i (E), och från 7 till 1.400 fotoner pm -2 (från -32 till -9 dB grönt ljus) i (F). Se et al. Vinberg 2014 17 och Lyubarsky et al. 1999 30 och 2004 31 för mer information om konvertering av fotopiska ljusenergi ges i Cd sm -2 till fotoner im -2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

belastning / 52.855 / 52855fig3.jpg "/>
Figur 3. Isolering av kon svar med dubbel blixt metod i WT mus. (A) Ett svar på sond blixt (14.000 fotoner pm -2 eller 1 dB grönt ljus, svart) och ett svar för att undersöka flash följt av en testblixt (81.000 fotoner pm -2 eller 9 dB grönt ljus, röd). (B) Cone flash svar på testet blinkar som sträcker sig från 360 till 81.000 fotoner pm -2 (-14 till 10 dB grönt ljus) isolerade genom att subtrahera sond flash svar från " sond + testblixt "svar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi visar här de kritiska stegen för att erhålla högkvalitativa ex vivo ERG inspelningar samtidigt från två isolerade mus näthinnor genom att använda in vivo ERG systemkomponenter tillsammans med en ex vivo ERG adapter. I denna studie perfunderades vi båda näthinnor från djuret med samma lösning (antingen Ames ', Lockes eller Ringers) men det är även möjligt att BEGJUTA varje näthinna med en annan lösning, t.ex., för läkemedelsteständamål. De viktigaste stegen för att erhålla data av hög kvalitet är avskärmning från elektromagnetiska störningar, noggrann dissektion av näthinnan, stadig och relativt snabb perfusion flöde med hjälp av en avancerad specialbyggd preparathållare, och utföra alla förfaranden provberedning vid dåliga röd (eller IR) ljus. Den metod som beskrivs här tillåter omedelbar användning av både näthinnor och dubbel användning av en in vivo ERG setup för att utföra in vivo och ex vivo ERG inspelningar.

_content "> Den specialbyggda ex vivo ERG provhållaren nyligen designad av oss 17, och nu kommersiellt tillgängliga, förbättrar SNR genom effektiv elektrisk isolering av proximala och distala delar av näthinnan och optimerar perfusion flöde över näthinnan (högt lösning växelkurs .) Avsaknad av de långsamma frekvensbruskomponenter i ex vivo ERG signal tillåter kvantitativ analys även från mycket små reaktioner Men vi fann att ex vivo inspelningen är mer känsliga för störningar i AC-kraftledningen buller (60 Hz i USA,. 50 Hz i Europa) än in vivo-experiment. Detta brus kopplad till signal främst genom perfusionsledningen, och det kan oftast avlägsnas genom avskärmning (och jordning) alla perfusion komponenter (flaska, slang) bosatta utanför Faradays bur eller Ganzfeld sfär . Dessutom, ibland 60 Hz brus kopplad till ex vivo ERG signal genom värmeväxlaren och detta buller kan också tas bort genom jordning. </ P>

Vi visar hur du tar bort vissa ERG signalkomponenter genom att lägga farmakologiska blockerare i perfusion under försöket tillåter dissektion av funktionen hos olika celltyper i samma retina / experiment med tre olika fysiologiska perfusion medier (Figur 2). En nyligen genomförd studie visade att valet av perfusion medier påverkar ljusmätare fysiologi i en enda cell inspelningar 32. Här har vi använt Ames ", Lockes och" HEPES-Ringer "media för att spela in mörka anpassade flash svar i frånvaro och närvaro av farmakologiska reagenser som är avsedda att isolera ljusmätare del av ERG signalen (Figur 2). Bikarbonatbuffrade lösningar gav större A- och B-vågsamplituder, upp till 1 mV. Ljusmätare dim flash svar enligt Lockes medium med blockerare innehöll komplicerad återhämtning vågform (se inlägg i figur 2D) som inte sågs med AmesR17; eller Ringers perfusion. När användningen av ex vivo ERG blir anpassas av flera laboratorier det skulle vara bra att använda samma perfusion medier och standardmetoder för att isolera olika signalkomponenter. På denna punkt verkar det som den mest mångsidiga alternativet är Ames "mediet eftersom det ger stabila och stora A- och B-vågsamplituder. Dessutom fotoreceptorn svaret, i denna lösning förefaller isolerat farmakologiskt att ha en enkel vågform som påminner om det som registrerats från enstaka fotoreceptorer (fig 2E). Men vissa öppna frågor återstår om det finns andra ERG signalkomponenter som observerats under in vivo-betingelser. Till exempel i våra ex vivo inspelningsförhållanden vi inte se framstående oscillerande potentialer, 100-150 Hz oscillerande vågor som normalt observeras i den stigande fasen av b-vågen av en in vivo ERG svar. Det är således möjligt att den inre näthinnan funktion i vår ex vivo ex vivo b-vågor inblandade livskraftig PÅ bipolär cellfunktion. Framtida studier bör lösa om ändringar i de experimentella protokoll som visas här (dissektion, perfusion etc.) skulle göra det möjligt för oss att spela svängnings potentialer enligt ex vivo förhållanden.

Cone funktion är avgörande för vår vision. Emellertid är undersökningar av koner hindras av deras ringa storlek och brist särskilt i mus näthinnan 33. Isolering av kon funktion kompliceras ytterligare i mus ERG inspelningar eftersom deras M-koner och stavar har nästan identiska spektrala känslighet 30. Standardprotokoll utnyttja flera log-enhet skillnad mellan tappar och stavar känslig genom användning av stavtrycka bakgrundsljus. Men är stadig bakgrundsljus känt att okänsliga stavar 34,35 och påverka kon funktion eventuellt genom modulering av kanalförbindelsekoppling mellan stavar och koner <sup> 36,37. Således är det svårt att hitta en bakgrund ljusintensitet som är stark nog att hålla stavarna mättade utan att påverka kottar. Här visar vi ett alternativt dubbelblixtmetod som drar nytta av både lägre känslighet och snabbare återhämtning kinetik koner 19,29,30. På detta sätt är det lättare att isolera verkligt mörk-anpassade kon-medierade svar. Vi märkte att i Ames "eller Lockes lösningar utan några blockerare, var detaljerna i återhämtnings vågformen något påverkas under försöket genom användning av ljusa sond och test blinkar. Detta komplicerade subtraktion analys för att isolera kon svar. Men att ta bort gliaceller komponent av barium bidragit till att stabilisera svansen av svaren tyder på att variationen berodde på Müller cellkomponenten. På detta sätt var det möjligt att erhålla mörk anpassade kon drivna svar i WT-möss (figur 3). Cone svar isolerade genom dubbel blixtteknik från WT möss verkade mindre jämfört med de som registrerats från WT-möss genom att använda bakgrundsljus för att undertrycka stav aktivitet 17,37. Denna skillnad kan förklaras med en väl karakteriserad effekten av bakgrundsljus som långsamt (inom 10 min) förbättrar kon respons amplituder förmodligen på grund av avlägsnandet av den stav medierad suppression av kon svar 37-39.

Sammanfattningsvis metoden demonstreras här möjliggör ex vivo elektrofysiologiska inspelningar att studera funktionen av näthinnan. I framtiden hoppas vi att många fler laboratorier kommer att anpassa denna kraftfull metod för att studera fysiologi och patologi för djurs och människors näthinnan och att öka vår förståelse av retinal funktion och utveckla bättre behandlingsmetoder för bländande sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Washington University i St Louis har ett licensavtal med Xenotec, Inc. och kan få en royalty från försäljning av ex vivo-adaptern.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH bidrag EY019312 och EY021126 (VJK), EY002687 till Ögonkliniken och Visual Sciences vid Washington University, och forskning för att förebygga blindhet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Tags

Neurovetenskap Electrophysiology elektroretinogram ERG, näthinna ljusmätare stång kon en våg b-våg drogtestning
Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinberg, F., Kefalov, V.More

Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter