Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

متزامنة Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52855
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

Introduction

مخطط كهربية (أرج) هي تقنية راسخة والتي يمكن استخدامها لتسجيل النشاط الكهربائي للشبكية العين الناجم عن الضوء. يتم إنشاء إشارة أرج أساسا من تغيرات الجهد الناجم عن التيارات شعاعي (على طول محور مبصرات وخلايا ثنائية القطب) المتدفقة في الفضاء خارج الخلية مقاوم للشبكية. وسجلت أول إشارة أرج في عام 1865 من قبل هولمغرين من سطح العين الأسماك 1. آينتهوفن وجولي 1908 2 تقسيم استجابة ERG إلى ظهور الضوء إلى ثلاث موجات مختلفة، ودعا أ، ب، ج-الأمواج، والتي هي معروفة الآن لتعكس أساسا على نشاط خلايا مستقبلة للضوء، ON خلايا ثنائية القطب، والظهارة الصبغية الخلايا على التوالي 3-8. أرج يمكن تسجيلها من عيون الحيوانات تخدير أو البشر (في الجسم الحي)، من إعداد معزولة العين 9، عبر شبكية العين سليمة المعزولة (خارج الجسم الحي) 3،10-15 أو عبر طبقات الشبكية محددة مع الميكروية (المحليةأرج) 4،16. هذه، في الجسم الحي أرج حاليا الوسيلة الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم وظيفة الشبكية. وهو أسلوب موسع التي يمكن استخدامها لأغراض التشخيص أو لمتابعة تطور أمراض شبكية العين في الحيوانات أو المرضى. ومع ذلك، في الجسم الحي تسجيلات أرج تنتج إشارة معقدة مع العديد من المكونات متداخلة، غالبا ما تكون ملوثة بسبب الضوضاء خارج العين الفسيولوجية (على سبيل المثال، في التنفس ونشاط القلب).

أرج المحلية يمكن استخدامها لتسجيل إشارة عبر طبقات محددة من شبكية العين ولكنه هو الأكثر الغازية ويحتوي على نسبة أدنى إشارة إلى الضوضاء (SNR) بالمقارنة مع تكوينات أخرى تسجيل أرج. أرج المحلي هو أيضا يتطلب تقنية عالية وتتطلب معدات مكلفة (على سبيل المثال، المجهر وmicromanipulators). Transretinal أرج من سليمة، وشبكية العين معزولة (خارج الحي أرج) تقدم حلا وسطا بين في الجسم الحي وطرق أرج المحلية السماح مستقرة والمهزومةالتسجيلات ح SNR من شبكية العين سليمة من الحيوانات أو البشر 17. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لدراسة قضيب والمخروط مبصرة وظيفة في الثدييات، الرئيسيات والإنسان شبكية العين 18-20. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم وجود الظهارة الصبغية في شبكية العين خارج الحي، تتم إزالة عنصر ج الموجة الإيجابية للإشارة أرج وكشف سلبي بطيئة مكون PIII بارز في خارج الحي التسجيلات. وقد تبين المكون PIII بطيء أن تنشأ من نشاط الخلايا الدبقية مولر في شبكية العين 21-23. وبالتالي، يمكن أن تستخدم أيضا خارج الحي طريقة أرج لدراسة الخلايا مولر في الشبكية سليمة. وقد أظهرت العديد من الدراسات يمكن أن تستخدم أيضا أن خارج الجسم الحي تسجيلات أرج لقياس تركيز كلاء الدوائية في جميع أنحاء شبكية العين 24 واختبار سلامة وفعالية الأدوية 25-27.

هم تجارية متعددة في أنظمة الجسم الحي المتاحة وتستخدم في العديد من المختبرات التي ليس لها بالضرورة خلفية الكهربية واسعة النطاق. في المقابل، والأجهزة فيفو السابقين لم تكن متاحة حتى وقت قريب 17 ونتيجة لذلك إلا عدد قليل جدا من المختبرات تجري حاليا الاستفادة من هذه التقنية قوية. وسيكون من المفيد لجعل التسجيلات خارج الحي أرج متاحة لمزيد من المختبرات من أجل المضي قدما معرفتنا علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض شبكية العين، وإلى تطوير علاجات جديدة للأمراض المسببة للعمى. علينا أن نظهر هنا جهاز بسيط وبأسعار معقولة خارج الحي أرج 17 وإظهار كيف يمكن أن تستخدم في تركيبة مع عدة متاحة تجاريا في أنظمة الجسم الحي أرج لتسجيل إشارات rod- وبوساطة مخروط (أ ب موجات) وظيفة خلايا مولر (بطيء PIII) من سليمة من النوع البري شبكية العين الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة الدراسات الحيوانية المؤسسية في جامعة واشنطن.

1. إعداد الإرواء وعينة حامل

  1. إعداد حل لشبكية العين نضح جديدة في يوم التجربة. استخدام الماء المقطر ومنزوع الأيونات. استخدام أحد الحلول الثلاثة التالية.
    1. إعداد بيكربونات التي تحتوي على "حل (1 L): 1 زجاجة من أميس 'أميس وسائل الإعلام و 1.9 غرام من NaHCO 3،
    2. يعد حل لوك (مم): 112.5 كلوريد الصوديوم، و 3.6 بوكل، 2.4 MgCl 2، 1.2 CaCl 2، 10.0 HEPES، 20.0 NaHCO 3، 3.0 نا سوسينات، و 0.5 نا الصوديوم، 0.02 EDTA، و 10.0 الجلوكوز، 0.1٪ الفيتامينات MEM والأمينية الأحماض
    3. إعداد HEPES مخزنة حل قارع الأجراس (مم): 133.3 كلوريد الصوديوم، 3.3 بوكل، 2.0 MgCl 2، 1.0 CaCl 2، 10.0 الجلوكوز، 0.01 EDTA، 12.0 HEPES، ودرجة الحموضةتعديل إلى 7.5 مع ~ 5.8 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، إضافة 0،72 ز / L يبوفيتش مستنبت L-15. استخدام 20-50 ميكرومتر DL-AP4 و50-100 ميكرومتر بووتون 2 لعزل استجابة مستقبلة للضوء مع أي وسيلة إعلامية الارواء.
  2. يعد حل لأقطاب 28 (مم): 140.0 كلوريد الصوديوم، و 3.6 بوكل، 2.4 MgCl 2، 1.2 CaCl 2، 3 HEPES، 0.01 EDTA وضبط درجة الحموضة إلى 7،4-7،5 مع هيدروكسيد الصوديوم. ويمكن تخزين الحل الكهربائي في RT لعدة أشهر.
  3. إعداد واختبار حامل العينة.
    1. الغراء أسود / رمادي رقة الترشيح على رأس القباب من الجزء السفلي صاحب العينة (انظر الشكل 1A). نشر مركبين 5 دقائق الايبوكسي الغراء بعناية حول حواف قمم مسطحة من القباب. إذا لزم الأمر، أن تفعل ذلك تحت المجهر تشريح.
    2. انتظر حتى يجف الغراء تقريبا (حوالي 4 دقائق) واضغط على ورق الترشيح على القباب باستخدام عنصر ثابت. ورق الترشيح الغراء قبل التجربة بيوم واحد على الأقل. الورقة فلتر قابل للاستخدام عدة مرات ولكن يجب أن يتم استبدالها بعد شهر من التسجيلات. استخدام الايثانول 70٪ لتنظيف القباب بعناية من أي بقايا الغراء قبل تثبيت ورقة الاستبدال.
    3. ملء قنوات القطب مع الحل القطب محاولة لتجنب أي فقاعات الهواء والمسمار الأقطاب بيليه المغلقة مع محول مترابطة في قنوات القطب (أنظر الشكلين 1A و B). توصيل القطع العلوية والسفلية من صاحب العينة مع أربعة مسامير وملء خطوط نضح مع حل الكهربائي.
    4. قياس المقاومة والجهد بين الخيوط من كل زوج الكهربائي باستخدام المتعدد (الشكل 1B). يجب أن تكون مقاومة أقل من 100 Ωk والجهد أقل من 10 فولت اذا القنوات هي خالية من فقاعة والأقطاب هم في ظروف جيدة.
  4. صب 400-700 مل من وسائل الاعلام نضح في زجاجة. تفصل 300 مل أخرى لاستخدامها في تشريح شبكية العين والصورةمزق بها في الثلاجة. تعيين أنابيب نضح في كتلة مبادل حراري ووضع كتلة محمى على لوحة التدفئة (انظر الشكل 1D).
  5. ضع زجاجة مع غطاء أن لديه اتصالات في شركة 2 / O 2 الغاز (إذا تم استخدام أميس "أو لوك) ونضح أنابيب (انظر الشكل 1D). تسخين زجاجة مع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية ووضعه على لوحة التدفئة أو على رأس وحدة التحفيز الخفيفة في حمام مائي لتعيين 37-39 درجة مئوية (17).
    1. رئيس الخطوط نضح عن طريق ملء لهم مع وسائل الاعلام نضح لبدء تدفق يحركها الجاذبية.
      1. في نظام LKC، ضع زجاجة على رأس وحدة مشجعا 17 إلى توفير تدفق الجاذبية الكبير الذي يتم بعد ذلك تعديل من قبل المنظمين معدل تدفق دون أن تتأثر مستوى خفض الحل نضح في زجاجة أثناء التجربة.
      2. في نظام Ocuscience، ضع صزجاجة erfusion داخل قفص فاراداي للحد من الضوضاء ووضع خطوط الانتاج نضح طويل من صاحب العينة (راجع الخطوة 2.8) أقل بكثير من مستوى لصاحب العينة (وزجاجة رذاذ) إلى زيادة الدافع الجاذبية من الحل. حماية هذه الخطوط الانتاج وربط الدرع إلى أرض الواقع مكبر للصوت لمنع اقتران الضجيج الكهرومغناطيسي للإشارة أرج.
  6. ضبط نضح إلى 3-5 مل / دقيقة باستخدام المنظمين معدل التدفق. ربط 5٪ CO 2/95٪ O 2 الغاز من اسطوانة مع منظم السليم وضبط معدل تدفق لضمان محتدما مستمر من وسائل الإعلام في زجاجة من خلال حجر الهواء.

إعداد 2. عينة

  1. تجميع أدوات تشريح نظيفة وحادة بما في ذلك microscissors البيضاء على التوالي، واحد أو اثنين 45 س ملاقط، شفرة حلاقة وقطعة مستطيلة من ورق الترشيح.
  2. صب حوالي 200 مل من perfu الباردحل سيون في طبق بتري كبير بحيث يمكن أن تكون مغمورة في الجزء السفلي كله لصاحب العينة (بما في ذلك القباب) في الحل. تصبح هذه الخطوة الهامة عند تركيب شبكية العين على القباب (راجع الخطوة 2.6). على الرغم من أن تصميم بعض الحلول التي يمكن مشبعة كربوجين (5٪ CO 2/95٪ O 2)، وهذا ليس من الضروري لأغراض تشريح ولم يحدث في التجارب وصفها هنا.
  3. لتجربة نموذجية، والحفاظ على الحيوانات في 12/12 ساعة مظلمة دورة / الضوء والظلام-تكييفها ل6-12 ساعة قبل التسجيلات. الموت ببطء الحيوانية CO 2 الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم تحت ضوء أحمر خافت والقيام بكل الإجراءات التالية تحت الحمراء خافت أو ضوء الأشعة تحت الحمراء (استخدم على سبيل المثال، مرشح أحمر أمام مصدر ضوء المجهر).
    1. سحب العينين من خلال استخدام ملاقط ووضعها في وسائل الإعلام. وضع العين في وقت واحد على قطعة صغيرة من الورق (على سبيل المثال، بعض ورق الترشيح العادية) وكما جعلمضاءة تقريبا على مستوى أورا مشرشر حين الضغط على العين مع ملاقط (يتم ذلك خارج من الحل هنا).
  4. قطع على طول مشرشر أورا (أو أقرب إلى خط الاستواء من العين) مع microscissors وإزالة القرنية والعدسة. ضع الكأس العين في وسائل الإعلام البارد في طبق بتري كبير وكرر نفس الإجراء مع العين الأخرى.
  5. قطع شق صغير من أعلى الكوب العين نحو العصب البصري عن طريق الحفاظ على مقص بين شبكية العين والصلبة من اجل الحفاظ على شبكية العين كما سليمة قدر الإمكان. قبضة الصلبة من كلا الجانبين من شق طريق استخدام اثنين من ملاقط وسحب ملاقط بعيدا عن بعضها البعض لفصل شبكية العين.
    1. قطع العصب البصري ومحاولة لعزل شبكية العين مع الحد الأدنى من الاتصال الجسدي إلى السطح البعيدة. سوف RPE فصل في الغالب تلقائيا من شبكية العين أثناء عملية التشريح. هو أكثر أهمية لتجنب اضطراب الميكانيكي للشبكية العين من لأداءتشريح بسرعة، وعادة شبكية العين يمكن تحضين 30 دقيقة على الأقل في حل من دون آثار كبيرة على خصائص الاستجابة.
  6. تركيب شبكية العين على القباب لصاحب العينة (الشكل 1C). تزج الجزء السفلي من صاحب العينة في طبق بيتري مع شبكية العين تشريح. حرك الشبكية، جنبا مبصرة (السطح المحدب للشبكية العين معزولة) صعودا، فوق القبة ورفع صاحب العينة بحيث تعلق شبكية العين على ورقة الترشيح. كرر الإجراء لشبكية العين الأخرى.
  7. تجف لوحة حامل بعناية لمنع تداخل الإشارات الكهربائية بين شبكية العين وكذلك الضوضاء وإشارة تحويلة. حامل العينة ديه O حلقات حول القباب الجزء السفلي لمنع تسرب حل بين الجزء السفلي وأجزاء العليا للحامل وكذلك للمساعدة في العزل الكهربائي من الجانبين مستقبلة للضوء والخلايا العقدية للشبكية العين الفردية. نعلق الجزء العلوي من حامل مع المسامير الأربعة (انظر الشكل 1B) وملء القنوات نضح مع حل نضح باستخدام حقنة وإبرة.
  8. نقل صاحب العينة المقبل للحرارة كتلة المبادلات وربط المدخلات والمخرجات نضح خطوط لصاحب العينة (1D الشكل). توصيل الأقطاب الكهربائية إلى مكبر للصوت أرج (أعلى أقطاب الاتصال على الأرض / ناقص دبوس في مكبر للصوت) ونعلق وحدة مشجعا / السيطرة على حامل العينة باستخدام محول أو الانزلاق وسادة التدفئة في وحدة التحفيز والتشجيع واعتمادا على أي في الجسم الحي ويستخدم نظام أرج.

3. تسجيلات

  1. تكوين إعدادات مكبر للصوت والتحفيز باستخدام برنامج نظام في الجسم الحي. ضبط وتيرة اكتساب إلى قيمة تتراوح بين 1 و 10 كيلو هرتز والمنخفضة تمرير تصفية إلى 300 هرتز. لا تستخدم عالية تمرير التصفية. استخدام 60 هرتز (أو 50 هرتز في أوروبا) الشق فلتر إذا لزم الأمر.
  2. سجل خط الأساس دون التحفيز الخفيفة والطرافةح التحفيز خافت (على سبيل المثال، الضوء الأخضر من -35 ديسيبل أو 0.3 MCD SM -2) لاختبار الربط الكهربائي جيد بين الأقطاب وعينة شبكية العين. الانتظار 10-20 دقيقة قبل البدء في جمع البيانات بحيث درجة حرارة الشبكية وظيفة وصول إلى حالة مستقرة.
    1. اختيار المعلمات التحفيز وفقا لأية تجربة محددة والبدء في جمع البيانات. على سبيل المثال، استخدم الضوء الأخضر من -40 إلى 0 ديسيبل أو من 0.1 إلى 1000 MCD SM -2 لأسرة استجابة ظلامية. استخدام حوالي 2 إلى 3 وحدات سجل أكثر إشراقا ومضات في التسجيلات فوتوبيك حيث لها قضبان ليتم قمعها من قبل ضوء الخلفية (3-30 آلية التنمية النظيفة -2) أو التحقيق فلاش (حوالي 1.3 سم الكادميوم -2 = 1 ديسيبل، انظر الشكل 3).
    2. ومع ذلك، تذكر أن القيم شدة الضوء الدقيق قد يعتمد إلى حد ما على معايرة النظام الخاص بك والظروف التجريبية. وكقاعدة عامة من الإبهام، وشدة على نطاق وبنسبة 5-10 أضعاف مقارنة في الجسم الحي 17. A غطاء أسود مع فتحات فوق شبكية العين (المدرجة في نظام محول التجاري) يمكن استخدامها للحد من تشتت الضوء في حامل العينة وتسهيل التحفيز متجانس وعلى قدم المساواة على حد سواء شبكية العين من قبل فريق Ganzfeld المجال للالتجارية في الجسم الحي النظم.
      ملاحظة: للحصول على تسجيلات من شبكية العين الظلام تكييفها، وشدة ومضات الاختبار المستخدمة في التبييض تجربة نموذجية سوى جزء ضئيل من صبغة ذلك أن عدم وجود يحركها RPE تجديد ليست قضية. وبالإضافة إلى ذلك، فقد ثبت سابقا أن مخروط الصباغ تجديد لا تزال تجري في شبكية العين معزولة عن طريق خلية مولر دورة البصرية 20.
  3. كما التجارب تستمر عادة من 30 دقيقة تصل إلى عدة ساعات، ومراقبة الانجراف خط الأساس، ومستوى الضجيج والاستقرار استجابة أثناء التجربة على أنها تغييرات في هذه قد يشير إلى مشاكل فنية.
    ملاحظة: زيادة الضوضاء أو نقصانقد يشير سعة د استجابة فقاعات الهواء في القنوات نضح أو الكهربائي، ودرجة حرارة منخفضة جدا أو مرتفعة، حل تسرب / تسرب أو تشريد شبكية العين.

4. تنظيف

  1. فصل حامل عينة من خطوط نضح، فتحه ومسح شبكية العين من ورقة الترشيح. إزالة الأقطاب وشطف لهم بالماء المقطر (لا تستخدم الإيثانول). تنظيف حامل العينة (بما في ذلك قنوات نضح) مع الإيثانول و / أو الماء المقطر. تدفق نضح أنابيب بعناية مع> 70٪ من الإيثانول.
  2. شطف الزجاجة نضح بالماء المقطر (لا تستخدم المنظفات). الإيثانول يمكن أن تستخدم أيضا لتنظيف زجاجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سجلنا الردود فلاش من الظلام تكييفها البرية من نوع (WT) C57BL / 6 شبكية العين الماوس عن طريق اتباع البروتوكولات التجريبية المذكورة أعلاه وموضح في الشكل 1 باستخدام مختلف الحلول نضح القياسية (الشكل 2). ويبدو أن الطول الموجي استجابة وحركية وكذلك حساسية المستقبلات الضوئية قضيب مماثلة في أميس "وسائل الإعلام لوك (الشكل 2A و B). من ناحية أخرى، تحت HEPES مخزنة حل قارع الأجراس (لا بيكربونات أو 5٪ CO 2/95٪ O 2) سعة الاستجابة كانت أصغر بكثير. كما وجدنا أنه في هذه الظروف تعرض للخطر الاستقرار ب الموجة. إزالة مضيفا 40 ميكرومتر APB (DL-AP4) إيجابية ب الموجة بكفاءة في جميع وسائل الإعلام الثلاث (أرقام 2D-F). إزالة ب الموجة كشفت بطيئة موجة سلبية كبيرة (الشكل 2D) التي نسبت إلى نشاط الخلايا مولر 21. بإضافة 100 &# 956؛ M من الباريوم إلغاء هذا المكون، وكشف عن استجابة مستقبلة للضوء من خارج الحي ERG إشارة (أرقام 2D-F). نحن يمكن تسجيل ما يصل إلى 1 ردود مبصرة بالسيارات المشبعة في أميس "ولوك بينما كانت أقصى قدر من الردود عادة حوالي 200 μV تحت قارع الأجراس الارواء.

وقد تم عزل ردود مبصرة مخروط من قبل ما يسمى تقنية فلاش مزدوج حيث يتبع التحقيق مضة مشرقة تشبع قضبان من خلال اختبار فلاش في وقت استعادت المخاريط دولتهم الظلام تكييفها ولكن تظل قضبان مشبعة 19،29. نحن هنا معزولة بوساطة مخروط الردود أرج (التي تحتوي على كل من أ و ب الموجة) في وسائل الإعلام أميس "تستكمل مع 100 ميكرومتر من الباريوم ولكن ليس DL-AP4 باستخدام تقنية فلاش مزدوجة (الشكل 3). تم استخدام الباريوم لإزالة مكون الدبقية البطيء الذي ظهر لجعل جزء تأخر الردود المزيد من متغير خصوصا أثناء الاستخدام المتكرر لمشرقار ومضات. استخدمنا التحقيق فلاش المستمر لتشبع قضبان ومضات اختبار متغير 300 ميللي ثانية بعد فلاش التحقيق إلى الحصول على ردود مخروط. ويرد الأسرة استجابة مخروط الحصول عليها عن طريق طرح استجابة فلاش المسبار من "مسبار + اختبار فلاش" الردود في الشكل 3B.

الشكل 1
الشكل 1. استخدام خارج الحي أرج صاحب العينة. (A) ملء قنوات القطب والمتصاعدة من الأقطاب الكهربائية. (B) اختبار لصاحب العينة تجميعها قبل تشريح عن طريق قياس المقاومة والجهد بين أزواج الكهربائي. (C) تركيب من شبكية العين على ورقة الترشيح في حامل العينة. (D) صاحب العينة متصلا خطوط نضح ومكبر للصوت أرج في أرج سي التجاريالجذعية. يشار إلى مسار تدفق نضح بها السهام الزرقاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الرقم الأسر استجابة 2. فلاش المسجلة من شبكية العين الظلام تكييفها WT الماوس مع perfused لوك (A)، أميس '(B)، وHEPES مخزنة الرنين (C) متوسطة. سلمت ومضات 3، 40، 130، 390 و 1400 الفوتونات ميكرون -2 (من -36 إلى -9 ديسيبل أو -3.6 إلى -0.9 سجل (الكادميوم SM -2) الضوء الأخضر (530 نانومتر)). آثار سوداء في (DF) عرض الردود المسجلة من شبكية العين في (AC) بعد إضافة 40 ميكرومتر APB و 100 ميكرومتر الباريوم. آثار حمراء اللون في (D) عرض الردود المسجلة من شبكية العين في (A) مع perfused لوك تستكمل مع 40 ميكرومتر APB لكن ليس الباريوم. يظهر أقحم الردود على الأكثر خفوت ومضات ثلاثة في وسائل الإعلام لوك تحتوي على APB والباريوم. وتراوحت ومضات من 7 إلى 14000 الفوتونات ميكرون -2 (من -32 إلى 1 الضوء الأخضر ديسيبل) في (D)، في الفترة من 3 إلى 1400 الفوتونات ميكرون -2 (من -36 إلى -9 ديسيبل الضوء الأخضر) في (E)، والفترة من 7 إلى 1400 الفوتونات ميكرون -2 (من -32 إلى -9 ديسيبل الضوء الأخضر) في (F). رؤية Vinberg وآخرون. 2014 17 وLyubarsky وآخرون. 1999 30 و 2004 31 للاطلاع على تفاصيل تحويل الطاقة مضيئة فوتوبيك بالنظر في مؤتمر نزع السلاح SM -2 إلى الفوتونات ميكرون -2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحميل / 52855 / 52855fig3.jpg "/>
الرقم 3. عزل ردود مخروط مع طريقة فلاش مزدوج في WT الماوس. (A) استجابة للتحقيق فلاش (14،000 الفوتونات ميكرون -2 أو 1 ديسيبل الضوء الأخضر والأسود) واستجابة للتحقيق فلاش يليه اختبار فلاش (81،000 الفوتونات ميكرون -2 أو 9 الضوء الأخضر ديسيبل، أحمر). (B) ردود فلاش مخروط لاختبار ومضات تتراوح ما بين 360 إلى 81000 الفوتونات ميكرون -2 (-14 إلى 10 الضوء الأخضر ديسيبل) معزولة عن طريق طرح استجابة التحقيق فلاش من " مسبار + اختبار فلاش "استجابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

علينا أن نظهر هنا الخطوات الحاسمة للحصول على جودة عالية السابقين التسجيلات الحية أرج في وقت واحد من اثنين من شبكية العين الماوس المعزولة باستخدام المكونات في الجسم الحي نظام أرج جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين أرج محول. في هذه الدراسة نحن perfused لكلا شبكية العين من الحيوان مع نفس الحل (إما أميس "، لوك أو قارع الأجراس) ولكن من الممكن أيضا أن يروي كل شبكية العين مع حل مختلف على سبيل المثال، لأغراض الاختبار المخدرات. أهم الخطوات للحصول على بيانات عالية الجودة يحمون من الضجيج الكهرومغناطيسي، وتشريح دقيق لشبكية العين وثابتة وتدفق نضح السريع نسبيا باستخدام متقدمة مبنية خصيصا صاحب العينة، والقيام بجميع إجراءات إعداد العينة تحت الحمراء خافت (أو IR) ضوء. الطريقة الموصوفة هنا يسمح استخدام الفوري لكل من شبكية العين والاستخدام المزدوج للفي الجسم الحي أرج الإعداد لأداء في الجسم الحي وخارج الحي تسجيلات أرج.

_content "> وخارج الحي أرج حامل العينة مبنية خصيصا صممت مؤخرا من قبلنا 17، والآن متاحة تجاريا، ويحسن SNR عن طريق العزل الكهربائية كفاءة القريبة والبعيدة أجزاء من شبكية العين ويحسن تدفق نضح فوق (سعر الصرف حل ارتفاع شبكية العين .) يسمح غياب بطيئة مكونات الضوضاء تردد في إشارة خارج الحي أرج التحليل الكمي حتى من الردود صغيرة جدا ومع ذلك، وجدنا أن التسجيل خارج الجسم الحي هو أكثر عرضة للتدخل من ضجيج خط AC-الطاقة (60 هرتز في الولايات المتحدة؛ 50 هرتز في أوروبا) مما كانت عليه في التجارب المجراة. هذا الضجيج بالإضافة إلى إشارة بشكل رئيسي من خلال خط التروية، ويمكن إزالتها في الغالب السلامة (والتأريض) جميع مكونات التروية (زجاجة والأنابيب) المقيمين خارج قفص فاراداي أو فريق Ganzfeld المجال وبالإضافة إلى ذلك، في بعض الأحيان 60 هرتز الضوضاء يقترن إلى خارج الجسم الحي إشارة أرج من خلال المبادل الحراري ويمكن أيضا إزالة هذه الضوضاء عن طريق التأريض. </ P>

نحن لشرح كيفية إزالة مكونات إشارة أرج محددة عن طريق إضافة حاصرات الدوائية في نضح خلال التجربة السماح تشريح وظيفة من أنواع مختلفة من الخلايا في نفس شبكية العين / تجربة مع ثلاثة مختلف وسائل الاعلام نضح الفسيولوجية (الشكل 2). أظهرت دراسة حديثة أن اختيار وسائل الاعلام نضح يؤثر فسيولوجيا مستقبلة للضوء في تسجيلات خلية واحدة (32). نحن هنا تستخدم أميس "، لوك و" وسائل الاعلام HEPES-قارع الأجراس "لتسجيل استجابات فلاش الظلام تكييفها في غياب وجود الكواشف الدوائية تهدف إلى عزل المكون مبصرة للإشارة أرج (الشكل 2). أعطت الحلول مخزنة بيكربونات أكبر سعة A و B موجة، وتصل إلى 1 بالسيارات. مبصرة خافت الردود فلاش تحت المتوسطة لوك مع حاصرات الواردة الموجي الانتعاش معقدة (انظر أقحم من الشكل 2D) التي لم يكن ينظر مع AmesR17؛ أو قارع الأجراس الارواء. عند استعمال خارج الحي أرج يصبح تكييفها من قبل المزيد من مختبرات أنه سيكون من المفيد استخدام وسائل الإعلام نضح نفسها والأساليب القياسية لعزل مكونات إشارة مختلفة. في هذه المرحلة يبدو أن الخيار الأكثر تنوعا هو أميس "المتوسطة لأنها تعطي أ ب الموجة سعة مستقرة وكبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاستجابة مبصرة، دواء معزولة في هذا الحل، ويبدو ان هناك الموجي بسيط يذكرنا التي سجلت من خلايا مستقبلة للضوء واحدة (الشكل 2E). ومع ذلك لا تزال هناك بعض الأسئلة المفتوحة حول وجود عناصر إشارة أرج أخرى لوحظ في ظل ظروف في الجسم الحي. على سبيل المثال، في المجراة سابقا ظروفنا تسجيل لم نر إمكانات متذبذبة بارزة، 100 - 150 هرتز الموجات المتذبذبة التي لوحظت عادة في مرحلة طلوع ب الموجة لفي الجسم الحي أرج استجابة. بالتالي فمن الممكن أن وظيفة الشبكية الداخلية في منطقتنا خارج الجسم الحي خارج الحي ب موجات تورط القابلة للحياة على وظيفة خلايا القطبين. ينبغي أن الدراسات المستقبلية لحل ما إذا كان إدخال تعديلات على البروتوكولات التجريبية هو موضح هنا (التشريح، ونضح الخ) من شأنه أن يسمح لنا لتسجيل الإمكانات متذبذبة في ظل ظروف خارج الحي.

وظيفة مخروط أمر حيوي لرؤيتنا. ومع ذلك، يتم إعاقة التحقيق في الأقماع التي كتبها صغر حجمها وقلة خصوصا في الماوس شبكية العين 33. عزل وظيفة مخروط تعقيدا في الماوس أرج التسجيلات بسبب تعرض M-الأقماع وقضبان حساسيات الطيفية متطابقة تقريبا 30. البروتوكولات القياسية الاستفادة من العديد من الفرق وحدة سجل بين قضيب ومخروط الحساسيات باستخدام ضوء خلفية قمع قضيب. ولكن من المعروف ضوء خلفية ثابتة لتوعي قضبان 34،35 وتؤثر على وظيفة مخروط ربما من خلال تعديل الفجوة موصلي اقتران بين قضبان ومخاريط <سوب> 36،37. وبالتالي، فمن الصعب العثور على شدة الضوء الخلفية الذي هو مشرق بما فيه الكفاية للحفاظ على قضبان المشبعة دون أن يؤثر ذلك المخاريط. نحن هنا لشرح طريقة فلاش مزدوج البديل الذي يستفيد من كل من أقل حساسية وحركية الانتعاش بشكل أسرع من المخاريط 19،29،30. بهذه الطريقة أنه من الأسهل لعزل الردود بوساطة مخروط داكنة تكييفها حقا. لاحظنا أنه في أميس "أو حلول لوك دون أي معوقات، وتفاصيل الموجي الانتعاش تأثرت إلى حد ما خلال التجربة عن طريق استخدام مشرق التحقيق واختبار ومضات. هذا تعقيد التحليل الطرح لعزل الردود مخروط. ومع ذلك، إزالة المكون الدبقية التي كتبها الباريوم ساعد على تحقيق الاستقرار في ذيل الردود مشيرا إلى أن التباين يرجع إلى عنصر الخلية مولر. وبهذه الطريقة كان من الممكن الحصول على استجابات مدفوعة مخروط الظلام تكييفها في WT الفئران (الشكل 3). ردود مخروط المعزولة فلاش مزدوجتقنية من WT الفئران ظهرت أصغر بالمقارنة مع تلك التي تم تسجيلها من WT الفئران باستخدام ضوء الخلفية لقمع النشاط قضيب 17،37. هذا الاختلاف يمكن تفسير تأثير-تتميز بشكل جيد للضوء الخلفية التي ببطء (في غضون 10 دقيقة) يعزز سعة استجابة مخروط ربما يرجع ذلك إلى إزالة قمع بوساطة قضيب الردود مخروط 37-39.

وباختصار، فإن الأسلوب هو موضح هنا يجعل الممكنة التسجيلات خارج الحي الكهربية لدراسة وظيفة شبكية العين. في المستقبل، ونحن نأمل أن العديد من المختبرات ستتكيف مع هذا سيلة قوية لدراسة علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من شبكية العين الحيوانية والبشرية وتطوير فهمنا من وظيفة الشبكية وتطوير علاجات أفضل للعمى الأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جامعة واشنطن في سانت لويس لديها اتفاق ترخيص مع Xenotec، وشركة قد تتلقى إتاوة من بيع محول خارج الحي.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY019312 وEY021126 (VJK)، EY002687 إلى قسم العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن، والبحوث للوقاية من العمى.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
In vivo ERG system OcuScience HMsERG www.ocuscience.us/id77.html
In vivo ERG system LKC Technologies UTAS-E 3000 www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex vivo adapter OcuScience Ex VIVO ERG adapter www.ocuscience.us/id107.html
Dissection microscope North Central Instruments Leica M80 May use any brand
IR emitter Opto Diode Corp. OD-50L www.optodiode.com
Prowler Night Vision Scopes B.E. Meyers Electro Optics D4300-I Military grade product.
Red filter Rosco Laboratories Roscolux #27 Medium Red May be used instead of IR system
Red head light OcuScience ERGX011 www.ocuscience.us/catalog/i29.html
Microscissors WPI, Inc. 500086 www.wpiinc.com/
Dumont tweezers #5 WPI, Inc. 14101
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 www.emsdiasum.com
Scale Metler Toledo AB54-S/FACT May use any brand
pH meter and electrode Beckman Coulter pHI 350 May use any brand
NaCl Sigma-Aldrich S7653 May use any brand
KCl Sigma-Aldrich 60129 May use any brand
MgCl2 Sigma-Aldrich 63020 1.0 M solution
CaCl2 Sigma-Aldrich 21114 1.0 M solution
EDTA Sigma-Aldrich 431788 May use any brand
HEPES Sigma-Aldrich H3375 May use any brand
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 May use any brand
Ames medium Sigma-Aldrich A1420 May use any brand
BaCl2 Sigma-Aldrich B0750 May use any brand
DL-AP4 Tocris Bioscience 101 May use any brand
Succinic acid disodium salt Sigma-Aldrich 224731 May use any brand
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G2834 May use any brand
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 May use any brand
Leibovitz culture medium L-15 Sigma-Aldrich L4386 May use any brand
MEM vitamins Sigma-Aldrich M6895
MEM amino acids Sigma-Aldrich M5550
Carbogen Airgas UN3156 5% CO2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
  2. Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
  3. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
  4. Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
  5. Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
  6. Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
  8. Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
  9. Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
  10. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  11. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
  12. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
  13. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
  15. Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
  16. Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
  17. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
  18. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  19. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  20. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  21. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
  22. Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
  23. Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
  24. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
  25. Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
  26. Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
  27. Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
  28. Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
  29. Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
  30. Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
  31. Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
  32. Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
  33. Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
  34. Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
  35. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
  36. Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
  37. Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
  38. Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
  39. Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).

Tags

علم الأعصاب، العدد 99، الكهربية، مخطط كهربية، أرج،
متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinberg, F., Kefalov, V.… More

Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System. J. Vis. Exp. (99), e52855, doi:10.3791/52855 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter