Introduction
Elettroretinogramma (ERG) è una tecnica ben consolidata che può essere utilizzato per registrare l'attività elettrica della retina innescata dalla luce. Il segnale ERG è generato principalmente dalle variazioni di tensione causate da correnti radiali (lungo l'asse dei fotorecettori e cellule bipolari) scorre nello spazio extracellulare resistivo della retina. Il primo segnale ERG è stato registrato nel 1865 dal Holmgren dalla superficie di un occhio di pesce 1. Einthoven e Jolly 1908 2 diviso la risposta ERG all'insorgenza di luce in tre differenti onde, denominato a-, b-, e c-onde, che sono ormai noti per riflettere principalmente l'attività dei fotorecettori, cellule bipolari ON, e dell'epitelio pigmentato cellule, rispettivamente 3-8. ERG può essere registrato dagli occhi di animali o esseri umani (in vivo) anestetizzati, dalla preparazione isolato occhio 9, attraverso isolato retina intatto (ex vivo) 3,10-15 o attraverso strati della retina specifici con i microelettrodi (localeERG) 4,16. Di questi, in vivo ERG è attualmente il metodo più usato per valutare la funzione della retina. Si tratta di una tecnica non invasiva che può essere usato per scopi diagnostici o per seguire la progressione di malattie retiniche negli animali o pazienti. Tuttavia, in vivo registrazioni ERG producono un segnale complicato con diversi componenti sovrapposti, spesso contaminato da rumore extraocular fisiologico (ad esempio, la respirazione e l'attività cardiaca).
ERG locale può essere utilizzato per registrare il segnale attraverso strati specifici della retina ma è il più invasivo e ha il segnale-rumore più basso (SNR) rispetto alle altre configurazioni di registrazione ERG. ERG locale è anche tecnicamente impegnativo e richiede costose attrezzature (ad esempio, microscopio e micromanipolatori). Transretinal ERG dal intatto, isolato retina (ex vivo ERG) offre un compromesso tra in vivo e metodi ERG locali permettendo stabile e high SNR registrazioni da retine intatte di animali o esseri umani 17. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato con successo per studiare l'asta e cono fotorecettori funzione in mammiferi, primati e umani retine 18-20. In aggiunta, a causa dell'assenza di dell'epitelio pigmentato in ex vivo retina, il componente c-onda positiva del segnale ERG viene rimosso e un componente importante negativo lento PIII è rivelato nelle ex vivo registrazioni. Il componente lenta PIII è stato dimostrato che provengono dalla attività delle cellule glia Müller nella retina 21-23. Così, ex vivo metodo ERG potrebbe essere utilizzato anche per studiare le cellule Müller nella retina intatto. Diversi studi hanno anche dimostrato che ex vivo registrazioni ERG potrebbero essere utilizzati per misurare la concentrazione di agenti farmacologici in giro per la retina 24 e testare la sicurezza e l'efficacia dei farmaci 25-27.
Commerciale multipla sistemi in vivo sono disponibili eutilizzato in molti laboratori che non hanno necessariamente vasta elettrofisiologia sfondo. Al contrario, ex vivo dispositivi non sono stati disponibili fino a poco 17 e come risultato solo pochi laboratori sono attualmente in corso vantaggio di questa tecnica potente. Sarebbe utile per effettuare registrazioni ex vivo ERG disponibile per più laboratori per far avanzare le nostre conoscenze sulla fisiologia della retina e la patologia, e di sviluppare nuove terapie per le malattie accecante. Dimostriamo qui un dispositivo semplice ed economico ex vivo ERG 17 e mostriamo come può essere utilizzato in combinazione con diversi sistemi disponibili in commercio in vivo ERG per registrare la segnalazione Rod- e cono-mediata (a- e b-onde) e la funzione di cellule Müller (lenta PIII) da intatte retine di topo wild-type.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale Animal Studies presso la Washington University.
1. Impostazione perfusione e Campione di laboratorio
- Preparare la soluzione per perfusione retina fresco il giorno dell'esperimento. Utilizzare acqua distillata e deionizzata. Utilizzare una delle seguenti tre soluzioni.
- Preparare Bicarbonato contenenti 'soluzione (1 L): 1 bottiglia di Ames' Ames media e 1,9 g di NaHCO 3,
- Preparare la soluzione di Locke (in mM): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO 3, 3.0 Na succinato, 0,5 Na glutammato, 0,02 EDTA, e 10,0 di glucosio, 0,1% vitamine MEM e ammino Acidi
- Preparare soluzione tamponata HEPES Ringer (in mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 glucosio, 0,01 EDTA, 12.0 HEPES, pHregolato a 7,5 con ~ 5,8 ml di 1 M NaOH, aggiungere 0,72 g / L Leibovitz mezzo di coltura L-15. Usare 20 - 50 mM DL-AP4 e 50 - 100 pM BaCl 2 per isolare la risposta fotorecettore con qualsiasi mezzo di perfusione.
- Preparare la soluzione per elettrodi 28 (in mM): NaCl 140,0, KCl 3.6, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3, HEPES 0,01 EDTA e aggiustare il pH a 7,4-7,5 con NaOH. Soluzione elettrodo può essere conservata a temperatura ambiente per diversi mesi.
- Preparare e testare il supporto del campione.
- Incollare il nero / carta grigia filtro in cima alle cupole della parte inferiore del titolare del campione (vedi Figura 1A). Distribuire accuratamente bicomponente 5 min colla epossidica intorno ai bordi delle cime piane delle cupole. Se necessario, farlo al microscopio dissezione.
- Attendere che la colla è quasi asciutto (circa 4 min) e premere la carta filtro cupole utilizzando un elemento piatta. Carta da filtro colla almeno un giorno prima dell'esperimento. Ilcarta da filtro può essere utilizzato più volte, ma deve essere sostituito dopo un mese di registrazioni. Usa il 70% di etanolo per pulire accuratamente cupole da eventuali residui di colla prima di installare la carta sostitutiva.
- Riempire i canali degli elettrodi con soluzione elettrodo cercando di evitare le bolle d'aria e vite elettrodi pellet chiusa con un adattatore filettato nei canali elettrodi (vedi figure 1 A e B). Collegare i superiore e inferiore pezzi del supporto del campione con quattro viti e riempire le linee di perfusione con soluzione elettrodi.
- Misurare la resistenza e la tensione tra i conduttori di ciascuna coppia di elettrodi con un multimetro (Figura 1B). La resistenza deve essere inferiore a 100 Ωk e la tensione sotto 10 mV se i canali sono senza bolle e gli elettrodi sono in buone condizioni.
- Versare 400-700 ml di supporti perfusione nella bottiglia. Indipendente altri 300 ml da utilizzare nella dissezione di retine e sstrappò in un frigorifero. Impostare il tubo di perfusione nel blocco scambiatore di calore e posizionare il blocco preriscaldato sulla piastra di riscaldamento (vedi Figura 1D).
- Racchiudere la bottiglia con un tappo che ha collegamenti di CO 2 / O 2 gas (se si usa Ames 'o Locke) e per le tubazioni perfusione (Figura 1D). Preriscaldare la bottiglia con il supporto a 37 o C e posizionarlo sulla piastra di riscaldamento o sulla parte superiore dell'unità stimolazione luminosa in bagnomaria a 37-39 ° C 17.
- Prime linee di perfusione di riempimento d'supporti perfusione di avviare il flusso di gravità-driven.
- Nel sistema LKC, posizionare la bottiglia sulla parte superiore dell'unità stimolatore 17 per fornire un flusso gravitazionale significativo che viene poi regolata da regolatori di portata senza essere influenzato dal livello di riduzione della soluzione di perfusione nella bottiglia durante l'esperimento.
- Nel sistema di Ocuscience, posizionare il pbottiglia erfusion all'interno della gabbia di Faraday per minimizzare il rumore e posizionare linee di uscita lungo perfusione del portacampioni (vedi passo 2.8) ben al di sotto del livello del portacampioni (e bottiglia perfusione) per aumentare l'azionamento gravitazionale della soluzione. Schermare le linee di uscita e collegare lo schermo a terra dell'amplificatore per evitare l'accoppiamento del rumore elettromagnetico al segnale ERG.
- Prime linee di perfusione di riempimento d'supporti perfusione di avviare il flusso di gravità-driven.
- Regolare la perfusione di 3 - 5 ml / min utilizzando regolatori di portata. Collegare 5% di CO 2/95% O 2 gas da una bombola con una corretta regolazione e regolare la portata per garantire gorgoglio costante dei mezzi di comunicazione nella bottiglia attraverso una pietra d'aria.
Preparazione 2. campione
- Montare gli strumenti di dissezione pulite e nitide compreso microscissors straight-lame, uno o due 45 o pinzette, lama di rasoio e un pezzo rettangolare di carta da filtro.
- Versare circa 200 ml di perfu freddosoluzione sione in un grande piatto Petri in modo che tutta la parte inferiore del supporto del campione (comprese le cupole) può essere immerso nella soluzione. Questo passaggio diventa importante quando si monta la retina sui cupole (vedi punto 2.6). Sebbene alcune soluzioni sono progettate per essere saturo di CarboGen (5% CO 2/95% O 2), questo non è essenziale ai fini di dissezione e non è stato fatto negli esperimenti qui descritti.
- Per un tipico esperimento, tenere gli animali in 12/12 ore scuro ciclo / luce e buio si adattano per 6-12 ore prima delle registrazioni. Euthanize l'animale da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale sotto fioca luce rossa e fare tutte le seguenti procedure previste fioca luce rossa o IR (usare, ad esempio, il filtro rosso davanti alla sorgente luminosa del microscopio).
- Estrarre gli occhi con l'ausilio di una pinzetta e metterli nei media. Inserire un occhio per volta su un piccolo pezzo di carta (ad esempio, carta da filtro regolare) e fare comeilluminato approssimativamente il livello di ora serrata tenendo l'occhio con una pinzetta (questo è fatto di fuori della soluzione qui).
- Tagliare lungo la serrata (o più vicino all'equatore dell'occhio) con microscissors e rimuovere la cornea e la lente. Posizionare l'oculare nei media freddo nella grande capsula di Petri e ripetere la stessa procedura con l'altro occhio.
- Tagliare una piccola incisione dall'alto della tazza occhio verso il nervo ottico, mantenendo la forbice tra la retina e sclera per mantenere la retina intatto possibile. Grip sclera da entrambi i lati dell'incisione utilizzando due pinzette e tirare le pinzette distanti per staccare la retina.
- Tagliare il nervo ottico e tentare di isolare la retina con una quantità minima di contatto fisico alla superficie distale. RPE sarà principalmente staccare automaticamente dalla retina durante il processo di dissezione. È più importante evitare disturbo meccanico della retina che per eseguire ladissezione rapidamente, generalmente retine può essere incubato almeno 30 min in soluzione senza effetti significativi sulle proprietà di risposta.
- Montare le retine sulle cupole del supporto del campione (Figura 1C). Immergere la parte inferiore del supporto del campione nella scatola di Petri con la retina sezionato. Scorrere la retina, fotorecettori lato (la superficie convessa della retina isolata) verso l'alto, sopra la cupola e sollevare il supporto del campione in modo che la retina attacca sulla carta da filtro. Ripetere la procedura per l'altro retina.
- Asciugare con cura la piastra porta per evitare interferenze elettriche tra la retina, così come il rumore e il segnale shunt. Portacampione anelli O-ring intorno cupole parte inferiore per impedire soluzione fuoriuscita tra il fondo e le parti superiori del titolare, nonché per aiutare l'isolamento elettrico dei fotorecettori e cellule gangliari lati dei singoli retine. Fissare la parte superiore del supporto con le quattro viti (Figura 1B) e riempire i canali di perfusione con soluzione di perfusione utilizzando una siringa e un ago.
- Trasferire il titolare del campione accanto al blocco scambiatore di calore e collegare le linee di ingresso e di uscita di perfusione al titolare del campione (Figura 1D). Collegare gli elettrodi all'amplificatore ERG (top elettrodi collegano alla terra / meno pin nel amplificatore) e collegare l'unità stimolatore / di controllo sul supporto del campione utilizzando un adattatore o far scorrere la piastra elettrica nell'unità stimolatore a seconda di quale in vivo Sistema ERG è utilizzato.
3. Registrazioni
- Configurare le impostazioni dell'amplificatore e di stimolo utilizzando il software del sistema in vivo. Impostare la frequenza di acquisizione di un valore compreso tra 1 e 10 kHz e filtrazione passabasso a 300 Hz. Non utilizzare il filtro passa-alto. Utilizzare 60 Hz (o 50 Hz in Europa) segnare il filtro, se necessario.
- Record di base senza stimolazione luminosa e lo spiritoh stimolazione dim (ad es., la luce verde di -35 dB o 0.3 mCd sm -2) per testare per buon collegamento elettrico tra gli elettrodi e il campione retina. Attendere 10 - 20 min prima di iniziare la raccolta di dati in modo che la temperatura e la funzione retinica raggiungere uno stato stabile.
- Scegli i parametri di stimolo secondo qualsiasi esperimento specifico e avviare la raccolta dei dati. Ad esempio, utilizzare la luce verde da -40 a 0 dB o da 0,1 fino a 1.000 mCd sm -2 per una famiglia risposta scotopic. Usa circa 2 a 3 log-unità più luminoso lampeggia registrazioni fotopiche dove aste devono essere soppressi dalla luce di fondo (3-30 Cdm -2) o un'unità flash sonda (circa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, vedi figura 3).
- Tuttavia, ricordare che gli esatti valori di intensità della luce potrebbe essere un po 'dipende dal sistema di calibrazione e condizioni sperimentali. Come regola generale, le intensità di scala in calo di 5 - 10 volte rispetto a in vivo 17. Un coperchio nero con aperture sopra la retina (inclusi nel sistema adattatore commerciale) può essere utilizzato per ridurre la dispersione della luce nel portacampioni e facilitare omogenea e stimolo uguale dei due retine dalla sfera Ganzfeld dei sistemi commerciali in vivo.
NOTA: Per le registrazioni di retina adattata al buio, le intensità dei lampi di prova utilizzati in un tipico esperimento di candeggina solo una frazione trascurabile del pigmento in modo che la mancanza di rigenerazione RPE-driven non è un problema. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che la rigenerazione pigmento cono può ancora avvenire nella retina isolata mediante la cella Müller ciclo visivo 20.
- Come esperimenti durano in genere da 30 minuti fino a diverse ore, monitorare la deriva della linea di base, il livello di rumore e la stabilità di risposta durante l'esperimento come movimenti di questi potrebbero indicare problemi tecnici.
NOTA: L'aumento o la diminuzione del rumoreampiezze d risposta possono indicare bolle d'aria nei canali di perfusione o elettrodi, troppo bassa o alta temperatura, la soluzione di perdita / fuoriuscita o spostamento della retina.
4. Pulizia
- Staccare il supporto del campione dalle linee di perfusione, aprirlo e lavare la retina dalla carta da filtro. Rimuovere gli elettrodi e sciacquare con acqua distillata (non utilizzare etanolo). Pulire il supporto del campione (compresi i canali di perfusione) con etanolo e / o di acqua distillata. Tubazione perfusione Lavare accuratamente con> 70% di etanolo.
- Sciacquare la bottiglia di perfusione con acqua distillata (non utilizzare detergenti). L'etanolo può essere utilizzata anche per pulire la bottiglia.
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Representative Results
Abbiamo registrato risposte flash di tipo selvaggio adattata al buio (WT) C57BL / 6 retine topo seguendo i protocolli sperimentali sopra descritte ed illustrate in figura 1 utilizzando diverse soluzioni standard di perfusione (Figura 2). Le forme d'onda di risposta e la cinetica e sensibilità bastoncelli apparsi simili in Ames 'e mezzi di Locke (Figura 2A e B). D'altra parte, in soluzione di Ringer HEPES-buffered (senza bicarbonato o 5% CO 2/95% O 2) le ampiezze di risposta erano significativamente più piccola. Abbiamo anche trovato che in queste condizioni la stabilità b-wave è stato compromesso. L'aggiunta di 40 mM APB (DL-AP4) rimosso positivo b-wave in modo efficiente in tutti e tre i mezzi (figure 2D-F). La rimozione del b-wave ha rivelato un grande lento onda negativa (Figura 2D), che è stato attribuito all'attività delle cellule Müller 21. Aggiunta di 100 &# 956; M di bario abolito questa componente, rivelando la risposta fotorecettore della ex vivo segnale di ERG (figure 2D-F). Potremmo registrare fino a 1 risposte fotorecettori mV saturi in Ames 'e Locke che risposte massimi erano tipicamente di circa 200 mV sotto perfusione Ringer.
Risposte dei fotorecettori cono sono stati isolati in precedenza dal cosiddetto tecnica doppio flash dove flash sonda luminosa saturare le aste è seguita da un lampo di prova nel momento in cui coni hanno ripristinato il loro stato adattato al buio ma aste rimangono saturi 19,29. Qui abbiamo isolato le risposte ERG cono-mediata (contenente sia a- e b-wave) in mezzi Ames 'integrati con 100 micron di bario, ma non DL-AP4 utilizzando la tecnica doppio flash (Figura 3). Bario è stato utilizzato per rimuovere il componente gliale lento che sembrava rendere tardo parte delle risposte più variabili specialmente durante l'uso ripetuto di bright lampeggiante. Abbiamo usato un lampo sonda costante a saturare aste e prova lampeggia variabili 300 msec dopo il flash della sonda per ottenere risposte a cono. Una famiglia risposta cono ottenuto sottraendo sonda risposta flash da 'Flash sonda + test' risposte è mostrato in Figura 3B.
Figura 1. Uso di portacampioni ex vivo ERG. (A) Riempimento di canali elettrodi e il montaggio degli elettrodi. (B) Controllo del portacampioni montato prima dissezione misurando la resistenza e la tensione tra le coppie di elettrodi. (C) Montaggio della retina sulla carta da filtro nel portacampione. (D) Il portacampione collegato alle linee di perfusione e ERG amplificatore in ERG sy commercialegambo. Il percorso del flusso di perfusione è indicato da frecce blu. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Flash famiglie di risposta registrati da retine adattati al buio WT topo perfusi con Locke (A), Ames '(B), e HEPES-buffered Ringer (C) media. I flash consegnati 3, 40, 130, 390 e 1.400 fotoni micron -2 (da -36 a -9 dB o -3.6 a -0,9 log (Cd sm -2) luce verde (530 nm)). Tracce nere in (DF) mostrano risposte registrate da retine a (AC) dopo aggiunta di 40 micron APB e 100 micron di bario. Tracce rosse in (D) mostrano risposte registrate dalla retina in (A) perfusi con Locke integrato con 40 micron APB, ma non bario. L'inserto mostra le risposte alle tre più debole lampeggia mezzi di Locke contenenti APB e bario. I lampi variava da 7 a 14.000 fotoni micron -2 (da -32 a 1 dB luce verde) a (D), da 3 a 1.400 micron fotoni -2 (da -36 a -9 dB luce verde) in (E), e da 7 a 1.400 micron fotoni -2 (da -32 a -9 dB luce verde) a (F). Vedi Vinberg et al. 2014 17 e Lyubarsky et al., 1999 30 e 2004 31 per i dettagli della conversione fotopico energia luminosa dato a Cd sm -2 a fotoni micron -2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Isolamento di risposte a cono con il metodo del doppio flash a WT mouse. (A) Una risposta per sondare flash (14.000 fotoni micron -2 o 1 dB luce verde, nero) e una risposta per sondare lampo seguito da un lampo di prova (81,000 fotoni micron -2 o 9 dB luce verde, rosso). (B) Cono risposte flash per testare flash che vanno da 360 a 81.000 fotoni micron -2 (-14 a 10 dB luce verde) isolato sottraendo la risposta della sonda flash dalla " Sonda + flash test "risposta. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dimostriamo qui i passaggi critici per l'ottenimento di alta qualità ex registrazioni vivo ERG contemporaneamente da due retine isolate del mouse utilizzando componenti in vivo del sistema ERG insieme ad un ex vivo adattatore ERG. In questo studio abbiamo perfusione entrambe le retine da animali con la stessa soluzione (sia Ames ', Locke o Ringer), ma è anche possibile perfusione ogni retina con una soluzione diversa per esempio, a scopo di test di droga. I passi più importanti per ottenere i dati di alta qualità sono schermatura dal rumore elettromagnetico, attenta dissezione della retina, stabile e relativamente rapido flusso di perfusione utilizzando un supporto avanzato su misura esemplare, e l'esecuzione di tutte le procedure di preparazione del campione sotto rosso dim (o IR) leggero. Il metodo qui descritto consente di utilizzare immediatamente sia le retine e duplice uso di un setup di ERG in vivo per eseguire in vivo e ex vivo registrazioni ERG.
_content "> L'ex vivo fermavetrino ERG custom-built recentemente progettato da noi 17, e ora disponibile in commercio, migliora SNR efficiente isolamento elettrico del prossimale e parti distali della retina e ottimizza il flusso di perfusione sopra la retina (tasso di cambio elevato soluzione .) L'assenza delle componenti di rumore di frequenza lenti a segnale ex vivo ERG permette un'analisi quantitativa anche da molto piccoli risposte Tuttavia, abbiamo scoperto che la registrazione ex vivo è più incline a disturbi di rumore di linea rete elettrica (60 Hz negli Stati Uniti;. 50 Hz in Europa) di esperimenti in vivo. Questo rumore accoppiato al segnale principalmente attraverso la linea di perfusione, e potrebbe essere principalmente rimossi mediante schermatura (e messa a terra) tutti i componenti di perfusione (bottiglia, tubi) esterno alla gabbia o Ganzfeld sfera Faraday . Inoltre, a volte 60 Hz rumore accoppiato al segnale ex vivo ERG attraverso lo scambiatore di calore e questo rumore potrebbe anche essere rimosso con messa a terra. </ P>Abbiamo dimostrato come rimuovere specifici componenti di segnale ERG aggiungendo bloccanti farmacologici nella perfusione durante l'esperimento permettendo dissezione della funzione di diversi tipi di cellule nella stessa retina / esperimento con tre diversi media perfusione fisiologica (Figura 2). Uno studio recente ha dimostrato che la scelta dei mezzi di comunicazione di perfusione influisce fotorecettori fisiologia nelle registrazioni delle celle singole 32. Qui abbiamo usato Ames ', Locke e' supporti HEPES-Ringer 'per registrare le risposte in flash adattati al buio in assenza e presenza di reagenti farmacologiche volte a isolare la componente fotorecettore del segnale ERG (Figura 2). Soluzioni bicarbonato-buffered dato grandi ampiezze A e B-wave, fino a 1 mV. Fotorecettore dim risposte in flash sotto media di Locke con bloccanti contenuti complicata forma d'onda di recupero (vedi riquadro della Figura 2D) che non è stato visto con AmesR17; o perfusione Ringer. Quando l'uso di ex vivo ERG viene adattato da più laboratori sarebbe utile utilizzare lo stesso supporto di perfusione e metodi standard per isolare diverse componenti di segnale. A questo punto sembra che l'opzione più versatile è medio Ames 'perché dà A e B-wave ampiezze stabili e di grandi dimensioni. Inoltre, la risposta dei fotorecettori, isolato farmacologicamente in questa soluzione, sembra avere una semplice forma d'onda ricorda quella registrata da fotorecettori singoli (figura 2E). Tuttavia, alcune domande aperte rimangono circa l'esistenza di altri componenti del segnale ERG osservati in condizioni in vivo. Ad esempio, nei nostri ex vivo condizioni di registrazione non abbiamo visto importanti potenzialità oscillatori, 100 - 150 Hz onde oscillanti che sono tipicamente osservate nella fase di salita del b-wave di un vivo risposta ERG. È quindi possibile che la funzione retina interna nel nostro ex vivo ex vivo b-onde implicati praticabile ON la funzione delle cellule bipolari. Gli studi futuri dovrebbero risolvere se le modifiche nei protocolli sperimentali indicati qui (dissezione, perfusione ecc) permetterebbe di registrare i potenziali oscillatori sotto ex vivo condizioni.
Funzione del cono è di vitale importanza per la nostra visione. Tuttavia, indagini di coni è ostacolato dalla loro piccola dimensione e la scarsità soprattutto nel topo retina 33. Isolamento di funzione cono è ulteriormente complicata in topo ERG registrazioni perché i loro M-coni e bastoncelli hanno sensibilità spettrale quasi identici 30. Protocolli standard sfruttano le varie differenze di log-unità tra i coni e bastoncelli sensibilità utilizzando sfondo chiaro-rod soppressione. Tuttavia, costante sfondo chiaro è noto per desensibilizzare aste 34,35 e influire sulla funzione cono eventualmente attraverso la modulazione di accoppiamento giunzionale divario tra coni e bastoncelli <sup> 36,37. Così, è difficile trovare un fondo intensità della luce che è abbastanza luminosa per mantenere aste saturi senza influenzare coni. Qui mostriamo un metodo lampo doppia alternativa che sfrutta sia la sensibilità più bassa e la cinetica di recupero più veloci di coni 19,29,30. In questo modo è più facile isolare risposte cono-mediata veramente adattata al buio. Abbiamo notato che in Ames 'o soluzioni di Locke senza alcun bloccanti, i dettagli della forma d'onda di recupero sono stati alquanto invariati durante il corso dell'esperimento con l'uso di sonde e luminosi prova lampeggia. Questo complica l'analisi sottrazione di isolare le risposte cono. Tuttavia, la rimozione del componente gliale da bario contribuito a stabilizzare la coda delle risposte indicano che la variabilità è dovuta alla componente cellulare Müller. In questo modo è stato possibile ottenere risposte cono-driven scuro adattate in topi WT (Figura 3). Risposte cono isolato dal doppio flashtecnica da WT topi è apparso più piccoli rispetto a quelli registrati da WT topi utilizzando sfondo chiaro di sopprimere l'attività asta 17,37. Questa differenza può essere spiegata da un effetto ben caratterizzato a sfondo luce che lentamente (entro 10 min) migliora ampiezze di risposta cono probabilmente dovuto alla rimozione della soppressione biella-mediata delle risposte cono 37-39.
In sintesi, il metodo illustrato qui rende possibili ex vivo registrazioni elettrofisiologiche per studiare la funzione della retina. In futuro, ci auguriamo che molti altri laboratori adatteranno questo potente metodo per studiare la fisiologia e la patologia della retina animale e umana e far progredire la nostra comprensione della funzione della retina e sviluppare terapie migliori per accecante malattie.
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Disclosures
Washington University di St. Louis ha un accordo di licenza con Xenotec, Inc. e può ricevere una royalty dalla vendita dell'adattatore ex vivo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni EY019312 e EY021126 (vjk), EY002687 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive presso la Washington University, e da Research per prevenire la cecità.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
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