Introduction
Elektroretinogram (ERG) ışıkla tetiklenir retina elektriksel aktivitesi kaydetmek için kullanılabilen bir köklü bir tekniktir. ERG sinyal retinanın rezistif dışı uzayda akan radyal akımların neden olduğu gerilim değişiklikleri (fotoreseptör ve bipolar hücrelerin ekseni boyunca) ağırlıklı olarak üretilir. İlk ERG sinyali bir balık gözü 1 yüzeyinden Holmgren, 1865 kaydedilmiştir. Einthoven ve Jolly 1908 2 b-, a- denilen üç farklı dalgaların içine ışık başlangıcından ERG yanıtı, ve c-dalgalar, şimdi bipolar hücreler ON fotoreseptör esas aktivitesini yansıttığı bilinmektedir ve pigment epiteli bölünmüş Hücreler sırasıyla 3-8. ERG, yerel (mikroelektrotla (ex vivo) izole sağlam retina arasında, izole edilmiş bir göz Hazırlama 9'da elde edilen, anestezi uygulanmış hayvanlar ya da (in vivo) insan gözüyle 3,10-15 ya arasında belirli bir retina katmanları kaydedilebilirERG) 4,16. Bunlardan in vivo ERG şu anda retina fonksiyonunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu teşhis amaçlı kullanılabilir veya hayvanlarda veya hastalarda retina hastalıklarının ilerlemesini takip etmek invaziv olmayan bir tekniktir. Ancak, in vivo ERG kayıtları genellikle ekstraoküler fizyolojik gürültü (örneğin, solunum ve kalp aktivitesi) ile kirlenmiş, birkaç örtüşen bileşenleri ile karmaşık bir sinyal üretmek.
Yerel ERG retina spesifik katmanlar arasında sinyalini kaydetmek için kullanılabilir, ancak, en invaziv ve diğer ERG kayıt konfigürasyonları ile karşılaştırıldığında düşük bir sinyal-gürültü oranı (SNR) sahip olmasıdır. Yerel ERG ayrıca teknik olarak ve pahalı donanımları (örn mikroskop ve mikromanipülatörler) gerektirir. Sağlam, izole retina gelen Transretinal ERG (ex vivo ERG) istikrarlı ve HIG izin in vivo ve yerel ERG yöntemleri arasında bir uzlaşma sunuyorhayvanlar ya da insanlar 17 sağlam retina h SNR kayıtları. Son zamanlarda, bu yöntem, memeli primat ve insan retina 18-20 çubuk ve koni fotoreseptör fonksiyonunu incelemek için başarıyla kullanılmaktadır. Buna ek olarak, ex vivo olarak, retina pigment epiteli olmaması, ERG sinyalinin pozitif Cı dalga bileşeni çıkarılır ve önemli bir negatif yavaş PIII bileşeni ex vivo kayıtları ortaya çıkar. Yavaş PIII bileşeni retina 21-23 Müller glia hücrelerinin aktivitesi kaynaklı gösterilmiştir. Bu nedenle, ex vivo olarak ERG yöntemi de sağlam retinada Müller hücreleri incelemek için kullanılabilir. Çeşitli çalışmalarda da bu ex vivo ERG kayıtları retina 24 civarında farmakolojik ajanların konsantrasyonu ölçmek ve uyuşturucu 25-27 güvenliğini ve etkinliğini test etmek için kullanılan olabilir göstermiştir.
In vivo sistemlerde birden fazla ticari mevcuttur vemutlaka geniş elektrofizyoloji altyapıya sahip olmayan birçok laboratuvarlarında kullanılan. Buna karşılık, ex vivo cihazlar son zamanlarda 17 kadar ve sadece çok az laboratuarlar anda bu güçlü tekniği yararlanarak bir sonucu olarak mevcut olmamıştır. Bu retina fizyolojisi ve patolojisi hakkında bilgimizi ilerletmek ve hastalıkları kör için yeni tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla laboratuvarlara ex vivo ERG kayıtları kullanılabilir hale getirmek için yararlı olacaktır. Burada, bir basit ve uygun fiyatlı bir ex vivo ERG aygıtı 17 göstermektedir ve bu çubuk ve koni aracılı sinyal kaydetmek için çeşitli ticari olarak temin edilebilir, in vivo ERG sistemleri ile kombinasyon halinde kullanılabilir göstermek (a- ve b-dalgası) ve fonksiyonu görmemiş vahşi tip fare retinaları Müller hücrelerinin (PIII yavaş).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyumlu olduğunu ve Washington Üniversitesi'nde kurumsal Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Perfüzyon ve Numune Tutucu Kurma
- Deney gününde taze retina perfüzyonu için çözelti hazırlayın. Distile ve deiyonize su kullanın. Aşağıdaki üç çözümlerden birini kullanın.
- , Medya ve NaHCO 3 1.9 g 'Ames 1 şişe (1 L) çözeltisi' Ames bikarbonat içeren hazırlanması
- (MM olarak) Locke çözeltisi hazırlayın: 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl2, 1.2 CaCl2, 10.0 HEPES, 20.0 NaHCO 3, 3.0 Na süksinat, 0.5 Na glutamat, 0.02 EDTA ve 10.0 glikoz,% 0.1 MEM vitamin ve amino asitler
- (MM olarak) Hazırlama HEPES-tamponlu Ringer solüsyonu: 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl2, 1.0 CaCl2, 10.0 glikoz, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pH1 M NaOH 5,8 mi ~ ile 7.5'e ayarlandı, 0.72 g / L kültür ortamı Leibovitz L-15 ekleyin. Herhangi bir perfüzyon medya ile fotoreseptör yanıtı izole etmek için 100 mcM BaCl 2 - 50 mcM DL-AP4 ve 50 - 20 kullanın.
- (MM olarak) elektrot 28 için çözelti hazırlayın: 140.0 NaCl, 3.6 KCl, CaCl2, 3 HEPES, 0.01 EDTA 2.4 MgCl2, 1.2 ve 7.4 pH ayarlamak - NaOH ile 7.5 olarak değiştirilmişti. Elektrot çözeltisi bir kaç ay için oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
- Hazırlayın ve numune tutucu test edin.
- Numune sahibinin taban kısmının kubbelerin üstünde siyah / gri filtre kağıdı Tutkal (Şekil 1A bakınız). Kubbelerin düz üstleri kenarlarda dikkatlice iki bileşenli 5 dk epoksi tutkal sürün. Gerekirse, diseksiyon mikroskobu altında bunu.
- Tutkal neredeyse kuru (yaklaşık 4 dakika) kadar bekleyin ve düz öğesini kullanarak kubbe üzerinde filtre kağıdı bastırın. Tutkal filtre kağıdı deneyden önce en az bir gün.Filtre kağıdı, birden çok kez kullanılabilir ancak kayıtların bir ay sonra değiştirilmelidir. Yedek kağıt yüklemeden önce herhangi bir yapışkan kalıntısı dikkatlice kubbeleri temizlemek için% 70 etanol kullanın.
- Elektrot çözelti hava kabarcıklarını önlemek ve elektrot kanallarına dişli adaptör ile kapalı pelet elektrotlar (Şekil 1A ve B) vida çalışıyor elektrot kanalları doldurun. Dört vida ile numune tutucu üst ve alt parçaları bağlayın ve elektrot çözeltisi ile perfüzyon çizgileri doldurmak.
- Multimetre (Şekil 1B) kullanarak her bir elektrot çiftinin uçları arasındaki direnci ve voltajı ölçün. Direnç 100 Ωk ve 10 mV altında geriliminin kanalları kabarcık-ücretsiz ve elektrotlar iyi şartlarda iseniz altında olmalıdır.
- Cam şişe perfüzyon medya 700 ml - 400 dökün. Başka bir 300 mi retina ve s diseksiyon kullanılacak AyrıBir buzdolabına yırttı. Eşanjör bloğunda perfüzyon tüp ayarlayın ve ısıtıcı plaka üzerinde ısıtılmış blok yerleştirin (Şekil 1D bakınız).
- (Şekil 1D bakınız) (Ames 'ya da Locke kullanılması durumunda) bağlantıları 2 / O 2 gazı CO olan bir kapakla şişe ve perfüzyon tüp için sarmalar. 37 o C medya ile şişeyi Onceden ve ısıtma plakası veya 37 ayarlanmış su banyosunda hafif stimülasyon birimi üzerine yerleştirin - 39 o C 17.
- Prime yerçekimi ile çalışan akmayı başlatmak için perfüzyon ortamı ile doldurularak perfüzyon hattı.
- LKC sisteminde, daha sonra deney sırasında şişede perfüzyon çözeltisi düşürücü seviyesi etkilenmeden akış hızı regülatörü ile ayarlanır önemli bir yer çekimsel bir akış sağlamak için stimülatör ünitesi 17 üzerine şişe yerleştirin.
- Ocuscience sisteminde, s yernumune tutucu uzun perfüzyon çıkış hatları gürültüyü en aza indirmek ve yerleştirmek amacıyla Faraday kafesi içinde erfusion şişe çözümünün yerçekimi sürücü artırmak için de numune tutucu (ve perfüzyon şişesinin) seviyesinin altına (adım 2.8 bakınız). Bu çıkış hatlarını koruyun ve ERG sinyal elektromanyetik gürültü bağlanmasını engellemek için amplifikatörün toprağa kalkanı bağlayın.
- Prime yerçekimi ile çalışan akmayı başlatmak için perfüzyon ortamı ile doldurularak perfüzyon hattı.
- Debi regülatörleri kullanarak / dk 5 ml - 3 perfüzyon ayarlayın. Doğru regülatör ile bir silindirden% 5 CO 2 /% 95 O 2 gazı bağlayın ve bir hava taşı ile şişe medyanın sürekli köpüren sağlamak için akış hızını ayarlayın.
2. Numune Hazırlama
- Düz kanatlı microscissors, bir ya da iki 45 o cımbız, jilet ve filtre kağıdı dikdörtgen bir parça da dahil olmak üzere, temiz ve keskin diseksiyon aletleri birleştirin.
- Soğuk perfu yaklaşık 200 ml dökünbüyük bir Petri kabındaki yon çözeltisi (kubbe dahil olmak üzere), numune tutucu bütün alt kısmı çözeltisi içine daldırılmış şekilde. Kubbelerin üzerindeki retina monte ederken Bu adım önemli hale (adım 2.6 bakınız). Bazı çözeltiler karbojen (% 5 CO 2/95% O x 2), doymuş üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu diseksiyon amaçları için gerekli değildir ve burada tarif edilen deneylerde yapılmadı.
- Kayıtların önce 12 saat - Tipik bir deney için, aydınlık / karanlık döngüsü ve 6 onları koyu adapte 12/12 saat içinde hayvanlar tutmak. (Mikroskop ışık kaynağının önünde, örneğin kırmızı filtre kullanın) loş kırmızı ışık altında servikal dislokasyon tarafından takip CO 2 inhalasyon yoluyla hayvan Euthanize ve loş kırmızı veya kızılötesi ışık altında aşağıdaki işlemleri yapmak.
- Cımbız kullanarak gözleri dışarı çekin ve medya koyun. Kağıt (örneğin, bazı düzenli filtre kağıdı) küçük bir parça üzerinde bir seferde bir göz yerleştirin ve olarak yapmakCımbız ile göz (bu burada çözümün dışında yapılır) tutarken ora serrata düzeyinde yaklaşık yaktı.
- Ora serrata boyunca kesin (ya da yakın gözün ekvatora) microscissors ve kornea ve lensi çıkarın. Büyük Petri kabındaki soğuk medyada göz fincan koyun ve diğer gözle aynı işlemi tekrarlayın.
- Mümkün olduğunca sağlam olarak retina tutmak için retina ve sklera arasındaki makas tutarak optik sinir doğru göz fincan üstünden küçük bir kesi kesin. Kavrama iki cımbız kullanarak ve retina ayırmak için birbirinden uzakta cımbız çekin tarafından kesi her iki taraftan sklera.
- Optik siniri kesin ve uzak yüzeye fiziksel temas minimum miktarda retina izole etmeye çalışın. RPE çoğunlukla diseksiyon işlemi sırasında retina otomatik olarak ayırmak olacaktır. Bu gerçekleştirmek için daha retinanın mekanik rahatsızlık önlemek için daha önemlidirDiseksiyon hızlı bir şekilde, genel olarak retina yanıtı özellikleri üzerinde önemli etki olmadan çözelti içinde en az 30 dakika inkübe edilebilir.
- Numune tutucu (Şekil 1C) kubbe üzerinde retina monte edin. Disseke retina ile Petri kabındaki numune tutucu alt kısmını daldırın. Kubbenin üzerindeki retinayı yukarı fotoreseptör tarafı (izole retinanın dışbükey yüzeyi), Slayt ve retina filtre kağıdı üzerinde verdiği, böylece numune tutucu kaldırın. Diğer retina için aynı işlemi tekrarlayın.
- Elektrik retina arasındaki karışma yanı sıra gürültü ve sinyal şant önlemek için dikkatli bir şekilde tutucu plakayı kurutun. Numune tutucu tutucu alt ve üst parçaları arasındaki çözüm dökülme önlemek için yanı sıra bireysel retina fotoreseptör ve ganglion hücre tarafı elektrik izolasyonu yardım etmek için alt kısmı kubbe etrafında O-halkalarını vardır. (Dört vida ile sahibinin üst kısmını takınŞekil 1B) ve bir şırınga ve iğne kullanılarak perfüzyon çözeltisi ile perfüzyon kanalları doldurun.
- Isı değiştirici blok sonraki numune tutucu aktarın ve numune tutucu (Şekil 1D) giriş ve çıkış perfüzyon hatlarını bağlayın. (Üst elektrotlar amplifikatör toprak / eksi pin bağlantı) ERG amplifikatör elektrotlar bağlayın ve bir adaptör kullanılarak numune tutucuya stimülatörü / kontrol ünitesi takın veya bağlı stimülatörü ünitesine ısıtma yastığı kaydırın in vivo hangi ERG sistemi kullanılmaktadır.
3. Kayıtlar
- In vivo sistemin yazılımını kullanarak amplifikatör ve uyarıcı ayarlarını yapılandırın. 300 Hz filtreleme 1 ile 10 kHz ve low-pass arasında bir değere satın alma frekansını ayarlayın. Yüksek geçiren filtreleme kullanmayın. 60 Hz (veya Avrupa'da 50 Hz) Gerekiyorsa filtreyi çentik kullanın.
- Işık uyarımı ve zekâ olmadan Tutanak temelh loş stimülasyon (örn., -35 dB veya 0.3 mCd şiddetindeki sm -2 yeşil ışık) elektrotlar ve retina örnek arasında iyi elektrik bağlantısı için test etmek. Retina sıcaklık ve fonksiyon istikrarlı duruma ulaşması ve böylece veri toplama başlamadan önce 20 dakika - 10 bekleyin.
- Herhangi bir özel deneye göre uyaran parametrelerini seçin ve veri toplama başlar. Örneğin, 0 dB kadar ya da 0.1 1.000 kadar mCd şiddetindeki sm den -40 yeşil ışık kullanmak -2 bir skotopik yanıt aile için. Çubuklar arka plan ışığı tarafından bastırılmış gereken Fotopik kayıtlarda yaklaşık 2 parlak log-birimleri 3 yanıp söner kullanın (3-30 Cdm -2) ya da bir prob flaş (-2 = 1 dB yaklaşık 1.3 Cd sm, bakınız Şekil 3).
- Ancak, tam ışık şiddeti değerleri sistem kalibrasyonu ve deneysel koşullara biraz bağımlı olabileceğini unutmayın. Genel bir kural olarak, aşağı 5 ölçek yoğunlukları - 10 kat in vivo karşılaştırıldığında 17 kullanarak. (Ticari bağdaştırıcı sistemine dahil) retina üzerinde delikler olan bir siyah kapağı numune tutucu ışık saçılması: azaltmak ve in vivo sistemler ticari Ganzfeld çevrede her iki retina homojen ve eşit bir uyarım kolaylaştırmak için kullanılabilir.
NOT: koyu adapte retina kayıtları, tipik bir deney ağartıcı pigment sadece önemsiz bir kısmını kullanılan test yanıp söner yoğunlukları böylece RPE odaklı rejenerasyon eksikliği söz konusu değildir. Buna ek olarak, daha önce koni pigment rejenerasyon hala Müller hücresi görsel döngüsü 20 üzerinden izole retinada yer alabilir gösterilmiştir.
- Deneyler birkaç saat 30 dakika kadar tipik son gibi bu değişiklikler teknik sorunlara işaret edebileceğiniz gibi, deney sırasında bazal sürüklenme, gürültü seviyesi ve yanıt istikrarı izlemek.
NOT: Artan gürültü ya da azalmad tepki genlikleri hava perfüzyon veya elektrot kanalları kabarcıklar, çok düşük ya da yüksek sıcaklık, çözüm sızıntı / dökülme veya retina deplasman gösterebilir.
4. Temizlik
- Perfüzyon hatları numune tutucu ayırın açın ve filtre kağıdı retina yıkayın. Elektrotları çıkarın ve damıtılmış su (etanol kullanmayın) ile durulayın. Etanol ve / veya distile su ile (perfüzyon kanalları dahil) numune tutucu temizleyin. Dikkatlice yıkayın perfüzyon boru 70> ile% etanol.
- Damıtılmış su (deterjanlar kullanmayın) ile perfüzyon şişesini durulayın. Etanol, aynı zamanda şişe temizlemek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu koyu adapte yabani tip flaş yanıtları kaydedildi deney protokolleri farklı standart perfüzyon için solüsyonlar (Şekil 2) ile, yukarıda tarif edilen ve Şekil 1 'de gösterilen izleyerek (WT), C57BL / 6 fare retinaları. tepki dalga ve kinetik yanı sıra çubuk fotoreseptör duyarlılığı Ames "ve Locke'un medya (Şekil 2A ve B) benzer çıktı. Öte yandan, HEPES-tamponlu Ringer çözeltisi (Resim bikarbonat ya da% 5 CO 2/95% O 2) altında tepki genlikleri, anlamlı daha küçük. Biz de bu koşullarda b-dalgası istikrar tatlıya bulundu. 40 uM APB ekleme (DL-AP4) her üç medya (Şekil 2D-F) verimli pozitif B-dalga kaldırıldı. B- dalga çıkarılması Müller hücre aktivitesi 21 atfedilmiştir büyük yavaş negatif dalga (Şekil 2D) saptandı. Ekleme 100# 956; baryum M ex vivo ERG sinyali (Şekil 2D-F) fotoreseptör yanıtını açığa Bu bileşeni kaldırıldı. Maksimum tepkiler Ringer perfüzyon altında yaklaşık 200 mV tipik oysa biz Ames 've Locke 1 mV doymuş fotoreseptör yanıtları kadar kayıt olabilir.
Koni fotoreseptör yanıtları kozalakları onların koyu adapte devleti restore ama çubuklar 19,29 doymuş kalır zaman çubuklar doyurarak parlak bir prob flaş bir anda bir test flaş izler sözde çift flaş tekniği daha önce izole edilmiştir. Burada çift flaş tekniği (Şekil 3) kullanılarak 100 baryum uM değil DL-AP4 ile desteklenmiş Ames medyada (a- ve b-dalgası hem de içeren) koni aracılı ERG yanıtları izole. Baryum özellikle brigh tekrarlayan kullanımı sırasında tepkilerin daha fazla değişken geç parçası haline göründü yavaş glial bileşeni kaldırmak için kullanılant yanıp söner. Biz koni tepkiler 300 msn prob flaş sonra çubuklar ve değişken testi yanıp doyurmak için sürekli sonda flaş kullanılır. 'Prob + test flaş' yanıtlardan prob flaş yanıtını çıkarılarak elde edilen bir koni tepki ailesi Şekil 3B gösterilmiştir.
Elektrot kanalları Şekil 1. ex vivo ERG numune tutucu kullanılması. (A) Doldurma ve elektrot çiftleri arasındaki direnci ve gerilim ölçerek diseksiyonu önce monte numune sahibinin elektrotların montajı. (B) Testi. (C) Montaj Numune tutucu filtre kağıdı üzerinde retinanın. (D) Ticari ERG sy perfüzyon hatları ve ERG amplifikatöre bağlı numune tutucukök. perfüzyon akış yolu mavi oklarla gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Locke (A) ile perfüze koyu adapte WT fare retinaları, Ames (B) ve HEPES-tamponlu Ringer (C) ortamdan kaydedilen Şekil 2. Flaş yanıtı aileler. yanıp söner (-0.9 günlüğüne -9 dB -36 ya da -3,6 dan (Cd sm -2) yeşil ışık (530 nm)) 3, 40, 130, 390 ve 1.400 fotonlar mikron -2 teslim. 40 uM APB 100 uM baryum ilavesinden sonra (ac) 'de retina kaydedilen (DF) göster yanıtlarında siyah izleri. Retinanın kaydedilen (D) show yanıtlarında Kırmızı izleri (A) ile perfüze Locke 40 uM APB değil, baryum ile takviye edilmiştir. içerlek APB ve baryum içeren Locke'un medyada üç dimmest yanıp söner tepkilerini gösterir. yanıp söner, 3 1.400 fotonlarından um -2 (-36 den -9 dB yeşil ışık) (E), 7 -2 mikron fotonlar 14000 (D) (-32 den dB yeşil ışık 1) arasında değişmekteydi 7 1.400 fotonlar um -2 in (F) (-32 -9 dB yeşil ışık için). Vinberg ve ark., 2014 17 ve Lyubarsky ark., 1999 30 ve fotonların um -2 Cd sm verilen Fotopik ışık enerjisini -2 dönüştürme ayrıntılar için 2004 31. Bakınız , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yük / 52855 / 52855fig3.jpg "/>
WT fare çift flaş yöntemi ile koni yanıtları Şekil 3. izolasyonu. (A) Flaş (14.000 fotonlar um -2 veya 1 dB yeşil ışık, siyah) ve bir test flaş ardından flaş soruşturma bir yanıt prob bir yanıtı (81.000 fotonlar um -2 veya 9 dB yeşil ışık, kırmızı). (B) Koni flaş yanıtları "prob flaş yanıtını çıkarılarak izole 360 81.000 kadar fotonlarından um -2 (-14 10 dB yeşil ışık değişen yanıp söner) test etmek prob + test flaş "yanıtı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada bir ex vivo ERG adaptörü ile birlikte in vivo ERG sistem bileşenlerini kullanarak iki izole fare retina aynı anda yüksek kaliteli ex vivo ERG kayıtları elde etmek için kritik adımlar göstermektedir. Bu çalışmada, aynı solüsyonu (ya Ames ', Locke ya da Ringer) ile hayvandan her iki retina perfüze ama uyuşturucu test amaçlı, farklı bir çözüm örneğin her retina serpmek de mümkündür. yüksek kaliteli veri elde etmek için en önemli adımlar, gelişmiş bir ısmarlama numune tutucu kullanarak ve loş kırmızı (veya IR) altındaki tüm numune hazırlama prosedürlerini uygulayarak elektromanyetik gürültü, retinanın dikkatli diseksiyon, istikrarlı ve nispeten hızlı perfüzyon akışı koruyucu vardır Işık. Burada tarif edilen yöntem, in vivo ve ex vivo ERG kayıtları gerçekleştirmek için iki retina ve bir in vivo ERG kurulum çift kullanım anında kullanımına izin verir.
_content "> geçenlerde bizim 17 tarafından tasarlanan ve halen piyasada mevcut ısmarlama ex vivo ERG numune tutucu, proksimal ve retinanın uzak bölgelerinde verimli elektrik izolasyonu ile SNR geliştirir ve retina (yüksek çözüm kur üzerinde perfüzyon akışını optimize .) ex vivo ERG sinyal yavaş frekanslı gürültü bileşenlerinin olmaması çok küçük yanıtlardan bile nicel analiz sağlar Ancak, bu ex vivo kayıt AC güç hattı gürültü (ABD'de 60 Hz girişime daha eğilimli olduğunu gördük;. 50 in vivo deneyler Avrupa'da daha Hz). esas olarak perfüzyon hattı boyunca sinyale bağlanmış Bu gürültü ve çoğunlukla Faraday kafesi ya Ganzfeld kürenin dışında bulunan) bir şişe, tüp (koruyucu (ve topraklama) Tüm perfüzyon parçaları çıkarılabilir olabilir . Buna ek olarak, zaman zaman 60 Hz gürültü ısı eşanjöründen ex vivo ERG sinyali ile birleştirilir ve bu gürültü, aynı zamanda topraklama ile çıkarılabilir. </ P>Biz üç farklı fizyolojik perfüzyon ortamına (Şekil 2) ile aynı retina / deneyde farklı hücre tiplerinin fonksiyonu diseksiyonu sağlayan deney sırasında perfüzyon içine farmakolojik blokerleri ekleyerek belirli ERG sinyal bileşenleri kaldırmak için nasıl gösterilmektedir. Yeni yapılan bir çalışmada perfüzyon medya seçimi tek hücre kayıtları 32 fotoreseptör fizyolojisini etkilediğini göstermiştir. Burada yokluğunda ve ERG sinyal (Şekil 2) fotoreseptör bileşenini izole etmek amaçlı farmakolojik reaktiflerin varlığında koyu adapte flaş yanıtları kaydetmek için Ames ', Locke ve' HEPES-Ringer 'medya kullanıldı. Bikarbonat tamponlu çözümler mV 1'e kadar, daha geniş a- ve b-dalgası genlikleri verdi. Bloker Locke'un ortamı altında fotoreseptör loş flaş yanıtları AmesR ile görülmedi karmaşık kurtarma dalga formu (Şekil 2D inset bakınız) içeriyordu17; veya Zil perfüzyon. Ex vivo ERG kullanımı daha laboratuarlar tarafından uyarlanmış olur zaman farklı sinyal bileşenlerini izole etmek için aynı perfüzyon medya ve standart yöntemleri kullanmak yararlı olacaktır. Bu noktada o kararlı ve büyük a- ve b-dalgası genlikleri verir çünkü çok yönlü bir seçenek Ames 'orta görünüyor. Buna ek olarak, fotoreseptör tepkisi, izole edilmiş bir farmasötik olarak, bu çözelti içinde tek fotoreseptörlerin (Şekil 2E) için kaydedilen andıran basit bir dalga biçimine sahip olduğu görülmektedir. Ancak bazı açık sorular in vivo koşullarda gözlenen diğer ERG sinyal bileşenlerinin varlığı hakkında kalır. Tipik bir in vivo ERG yanıtı b-dalga yükselen fazında gözlenen 150 Hz salınan dalgalar - Örneğin, ex vivo kayıt koşullarına biz önde gelen salınım potansiyeller, 100 görmedim. Bu nedenle mümkün olduğu bizim ex vivo iç retina fonksiyonu ex vivo b-dalgalar bipolar hücre fonksiyonu AÇIK yaşayabilir karıştığı rağmen m> durumlar tatlıya bağlandı. Gelecekteki çalışmalar burada gösterilen deneysel protokollerde değişiklikler (diseksiyon, perfüzyon vs.) bizi ex vivo koşullarda salınım potansiyelleri kaydetmek için izin edip çözmelidir.
Koni fonksiyonu vizyonumuzun için hayati önem taşımaktadır. Ancak, koni soruşturma, özellikle 33 retina fare kendi küçük boyutu ve kıtlık nedeniyle engellenmektedir. Onların M-koni ve çubuk hemen hemen aynı spektral hassasiyetleri 30 çünkü koni fonksiyonunun İzolasyon fare ERG kayıtları daha karmaşıktır. Standart protokoller çubuk bastıran arka plan ışığı kullanarak çubuk ve koni duyarlılıkları arasındaki birkaç günlük birimi farkından yararlanmak. Ancak, sabit arka plan ışığı çubuklarını 34,35 duyarsız ve çubuk ve koni arasındaki boşluk kavşak kaplin modülasyonu yoluyla muhtemelen koni işlevini etkilediği bilinmektedir <sup> 36,37. Böylece, koniler etkilemeden doymuş çubuklar tutmak için yeterince parlak bir arka plan ışık yoğunluğunu bulmak zor. Burada düşük hassasiyet ve koni 19,29,30 hızlı iyileşme kinetik hem yararlanır alternatif çift flaş yöntem ortaya koymaktadır. Bu şekilde, gerçek-karanlık adapte koni aracılı yanıtları izole etmek daha kolaydır. Biz Ames 'ya da herhangi bir bloker olmadan Locke'un çözümleri, kurtarma dalga detayları biraz parlak prob ve test yanıp söner kullanımı ile deney sırasında etkilendiğini fark ettim. Bu koni yanıtları izole etmek için çıkarma analizi karmaşık. Bununla birlikte, baryum ile glial öğenin çıkarılması değişkenliği Müller hücre bileşenine bağlı olduğunu gösteren tepkilerinin kuyruk stabilize yardımcı oldu. Bu şekilde, WT farelerinde (Şekil 3), koyu adapte koni tahrik yanıtlar elde etmek mümkün olmuştur. Çift flaş ile izole koni yanıtlarıÇubuk aktivitesi 17,37 bastırmak için arka plan ışığı kullanarak WT farelerden kaydedilen kıyasla olarak WT farelerden tekniği küçük ortaya çıktı. Bu fark, yavaş yavaş (en az 10 olan) muhtemelen konik tepkilerinin 37-39 çubuk aracılı bastırılması kaldırılması konik tepki genlikleri artırır Arka ışığın iyi karakterize edilmiş bir etkisi ile açıklanabilir.
Özetle, burada gösterilen yöntem retinanın işlevini incelemek mümkündür ex vivo elektrofizyolojik kayıtlar yapar. Gelecekte, daha birçok laboratuarlar, hayvan ve insan retina fizyolojisi ve patolojisi incelemek için bu güçlü bir yöntem adapte olacaktır ve retina fonksiyonun anlayışımızı ilerletmek için ve hastalıkları kör için daha iyi tedaviler geliştirmek umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
St Louis Washington Üniversitesi Xenotec, Inc. ile bir lisans anlaşması olan ve ex vivo adaptörün satışından elde bir telif alabilirsiniz.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe EY019312 ve EY021126 (VJK), Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları Anabilim Dalı ve Görsel Bilimler EY002687 tarafından desteklenen ve Araştırma tarafından Körlük Önlemek için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vivo ERG system | OcuScience | HMsERG | www.ocuscience.us/id77.html |
| In vivo ERG system | LKC Technologies | UTAS-E 3000 | www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html |
| Ex vivo adapter | OcuScience | Ex VIVO ERG adapter | www.ocuscience.us/id107.html |
| Dissection microscope | North Central Instruments | Leica M80 | May use any brand |
| IR emitter | Opto Diode Corp. | OD-50L | www.optodiode.com |
| Prowler Night Vision Scopes | B.E. Meyers Electro Optics | D4300-I | Military grade product. |
| Red filter | Rosco Laboratories | Roscolux #27 Medium Red | May be used instead of IR system |
| Red head light | OcuScience | ERGX011 | www.ocuscience.us/catalog/i29.html |
| Microscissors | WPI, Inc. | 500086 | www.wpiinc.com/ |
| Dumont tweezers #5 | WPI, Inc. | 14101 | |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | www.emsdiasum.com |
| Scale | Metler Toledo | AB54-S/FACT | May use any brand |
| pH meter and electrode | Beckman Coulter | pHI 350 | May use any brand |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | May use any brand |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60129 | May use any brand |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63020 | 1.0 M solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21114 | 1.0 M solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | May use any brand |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | May use any brand |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | May use any brand |
| Ames medium | Sigma-Aldrich | A1420 | May use any brand |
| BaCl2 | Sigma-Aldrich | B0750 | May use any brand |
| DL-AP4 | Tocris Bioscience | 101 | May use any brand |
| Succinic acid disodium salt | Sigma-Aldrich | 224731 | May use any brand |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2834 | May use any brand |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | May use any brand |
| Leibovitz culture medium L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | May use any brand |
| MEM vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| MEM amino acids | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| Carbogen | Airgas | UN3156 | 5% CO2 |
References
- Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).
- Einthoven, W., Jolly, W. A. The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities. Q J Exp Physiol. 1, 43 (1908).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. J. Physiol. 77, 207-239 (1933).
- Penn, R. D., Hagins, W. A. Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave. Nature. 223, 201-204 (1969).
- Stockton, R. A., Slaughter, M. M. B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity. J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).
- Robson, J. G., Frishman, L. J. Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram. Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).
- Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave. Nature. 227, 728-730 (1970).
- Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature. Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. J. Physiol. 167, 156-168 (1963).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).
- Bastian, B. L., Fain, G. L. Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium. J. Physiol. 297, 493-520 (1979).
- Arden, G. B. Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina. J. Physiol. 256, 333-360 (1976).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Res. 101, 108-117 (2014).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
- Newman, E. A. Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells. Brain Res. 498, 308-314 (1989).
- Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina. Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).
- Walter, P., Luke, C., Sickel, W. Antibiotics and light responses in superfused bovine retina. Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).
- Luke, M., et al. The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).
- Januschowski, K., et al. Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model. Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses. J Vis Exp. , (2012).
- Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina. Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).
- Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments. J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).
- Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG. Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).
- Azevedo, A. W., Rieke, F. Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold. J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).
- Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in vertebrate photoreceptors. Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).
- Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics. J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).
- Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling. J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).
- Gouras, P., MacKay, C. J. Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).
- Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation. Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).
