Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

الايريديوم (III) الفلورسنت التحقيق للكشف عن البروتين ملاريا العلامات البيولوجية الحامض الأميني ريتش بروتين-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

ويعرض هذا العمل على توليف الخالية من الانبعاثات، cyclometalated عير (III) المجمع، عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (IR1)، الذي يتسبب سريعة، المعمرة إشارة الفسفورية عندما منسقة لhistidine- تحتوي على البروتين ثبتوا على سطح الجسيمات المغناطيسية. توليف IR1، في عوائد عالية، هو O كاملة / N وينطوي على تقسيم الوالد cyclometalated عير (III) ديمر-سد كلورو إلى قسمين حكمه من مجمع الإذابة بالإكترونات. لتأكيد خصوصية، تم بحث العديد من الأحماض الأمينية لنشاط التنسيق عند إضافتها إلى التحقيق توليفها، والحامض الاميني الوحيد إلى استجابة الإشارة. استخدام BNT-II، وهو تقليد الببتيد متفرعة من العلامات البيولوجية للملاريا البروتين الحامض الأميني ريتش II (pfHRP-II)، والتحقق من صحة التحقيق الايريديوم كأداة للكشف عن HRP-II. وقد لوحظت آثار التبريد في المعايرة BNT-II / IR1 بالمقارنة مع الحامض الأميني L-/ IR1، ولكن نسبت هذه إلى عائق الفراغية وثلاثيPLET التبريد الدولة. وقد استخدم Biolayer التداخل لتحديد حركية في الوقت الحقيقي من تفاعل IR1 مع BNT-II. مرة واحدة وكان محسن النظام، تم العثور على الحد من الكشف عن rcHRP-II باستخدام مسبار لتكون 12.8 نانومتر في الحل. عندما يجمد هذا البروتين على سطح 50 ميكرون المغناطيسي الجسيمات الاغاروز، كان الحد من الكشف 14.5 نانومتر. استجابة قوية إشارة من هذا التحقيق غير العضوية، فضلا عن المرونة استخدامه في حل أو يجمد على السطح، ويمكن ان تقدم نفسها تجاه مجموعة متنوعة من التطبيقات، من استخدام التشخيص التصوير.

Introduction

وضع العلامات اللونية والفلورسنت هو وسيلة هامة للكشف وتتبع من الجزيئات الكيميائية الحيوية والعمليات 1،2. علامات الفلورسنت الأكثر شيوعا هي منخفضة الوزن الجزيئي الأصباغ العضوية 3،4، ولكن هذه الجزيئات لا تملك دائما الخصائص البصرية مثالية. الأصباغ الفلورية عرضة للphotobleaching من، غالبا ما يكون التحولات ستوكس صغيرة، وربما متداخلة الإثارة والأطياف الانبعاثات. وكثيرا ما يتم وضع العلامات اللونية من خلال استخدام بطاقات الأنزيمية، والتي لها إشارة تضخيم مفيدة في المناعه الكمي 5،6. تتمتع هذه الانزيمات أيضا سلبياتها، بما في ذلك حساسية للضوء، وظروف التفاعل، والركيزة قصيرة الصلاحية. هذه الخصائص تميل إلى تتطلب المناعية وطرق وضع العلامات البروتين الذي يتعين القيام به في ظل الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد باستخدام الكواشف مكلفة.

تم استكشافها المجمعات الانتقال المعادن انبعاثاتها كنهج بديل العلامات FOص كشف الكيمياء الحيوية. على وجه الخصوص، cyclometalated عير (III) وقد درس في سياق ضوء الثنائيات العضوية (شاشات OLED) 7-9 الأوكسجين الاستشعار 10، 11 الحفز، وبروتين / خلية تلطيخ 12-14. صمود عالية وكفاءة الكم جعل هذه الفئة من تحقيقات مرشحا جيدا للكشف عن جزيء حيوي 15،16. وجد سابقا أن cyclometalated عير (III) المجمعات، النموذج [عير (C ^ N) 2 (يذاب) 2] ربط بشكل لا رجعة فيه الحامض الاميني واستثارة رد فعل إشارة الأخضر والأزرق 12،17. هذه المجمعات هي غير انبعاثاتها في ولاية solvento، ولكن عندما نزوح الحامض الاميني جزيئات المذيب وبربط مركز معدنية، يطلقون إشارة الفسفورية مكثفة بعد التشعيع موجة طويلة للأشعة فوق البنفسجية. هذه الإشارة يحدث إلا بعد استبدال يجند، ونتيجة لالإلكترون دولة الثلاثي الاسترخاء للدولة أرض الواقع من خلال تفعيل المعادن نقل المسؤول يجند (3 ML CT) ويجند تركزت نقل (3 LC) مسارات 8،15. يمكن أن يحتمل هذه المجمعات استخدامها تحقيقات الكشف عن البروتينات الحامض الاميني الغنية.

البروتينات الحامض الاميني الغنية ومستويات تنظيمها مهمة في كثير من الأمراض، بما في ذلك تليف الكبد، والسرطان، واضطرابات thrombic 18 المتصورة المنجلية الحامض الأميني غني البروتين II (pfHRP-II) على وجه الخصوص هو التحقق من صحة العلامات البيولوجية جيدا للعدوى طفيل الملاريا. هذا البروتين هو 67 كيلو دالتون ويحتوي على 34٪ الحامض الاميني، معظمها داخل مميزة AHHAHHAAD تكرار الزخارف 19. ويمكن لهذه يكرر الحامض الاميني ربط أيونات معدنية مجانا 19 و 20 الهيم مجمعات في الدم المضيف. تم الكشف عن pfHRP-II عادة في البيئات المنخفضة الموارد باستخدام الاختبارات التشخيصية السريعة المناعي (أفرقة المديرين الإقليميين)، ولكن هذه الاختبارات غالبا ما تكون غير دقيقة بسبب ظروف العينة، وانخفاض تركيز العلامات البيولوجية، معايير التصنيع الفقيرة، وتدهور الأجسام المضادة 21.

"jove_content"> تحقيقات الفسفورية القائم على المعادن مثل عير cyclometalated (III) المجمعات المذكورة أعلاه هي خيارات جذابة للكشف عن pfHRP-II بسبب من انتقائية ملزمة من الحامض الاميني ومستقر وانبعاث كفاءة ممتلكاتهم. في هذه الورقة، واستخدام [عير (PPY) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) للكشف عن BNT-II، وهو تقليد الببتيد متفرعة من pfHRP-II هو استكشاف 22. تم رصد حركية هذا التفاعل في الوقت الحقيقي باستخدام تقنيات biolayer التداخل. وقد تم تكييف فحص أيضا إلى تنسيق ELISA نوع على حبة، حيث تحققت حدود nanomolar من الكشف. هذا الاختبار يحمل من المزايا أكثر من ELISAs التقليدية لأنها لا يمكن أن يؤديها في اقل من 2 ساعة مع الكواشف خالية من الأجسام المضادة، بدلا من ساعة 4-5 والكواشف الحيوية المطلوبة مع ELISAs نموذجية.

Protocol

1. توليف إيريديوم (III) مجمع

  1. تزن من 53.6 ملغ (50 ميكرومول) من [عير (PPY) 2 -Cl] 2 وتذوب في 5 مل من كلوريد الميثيلين. إضافة هذا الحل إلى قارورة 50 مل مخروطي مزودة بقضيب.
  2. تزن من 26.2 ملغ (100 ميكرومول) من AgOTf وتذوب في 5 مل من الميثانول.
  3. إضافة AgOTf المنحل إلى [عير (PPY) 2 -Cl] (2) حل ويقلب لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: كريم الملونة الطين ينبغي أن يؤدي.
  4. بعد 1 ساعة، تصفية الطين من خلال هلام السيليكا إلى 25 × 95 مم درهم قارورة وتتبخر من المذيبات المتبقية باستخدام المبخر الدوار (5-10 دقيقة).
  5. بمجرد إزالة معظم المذيبات، تأكد من بقايا الصفراء الزيتية يبقى في قارورة. لهذه المخلفات، إضافة 1 مل من الميثانول لإعادة حل المنتجات ويجفد 1-2 أيام لانتاج المنتج الصلب الأصفر.
  6. تميز عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 + المنتج (IR1) من خلال H <سوب> 1 NMR (في CDCl 3)، ESI والأشعة فوق البنفسجية فيس كما هو موضح سابقا. 23

2. تفاعلات IR1 مع الأحماض الأمينية مختلفة

  1. إعداد محلول 2 ملم من IR1 في الميثانول (MW 537.10 جم / مول). دوامة لضمان حل كامل للصلب.
  2. إعداد 100 ميكرومتر حلول من الأحماض الأمينية والجزيئات الحيوية التالية في HEPES مخزنة المالحة (HBS، 100 ملي HEPES، 137 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) علاء، ASP، السيستئين، صاحب، إيل، ليس، سر، في محاولة، فال.
  3. ماصة 100 ميكرولتر من كل الأحماض الأمينية إلى سوداء لوحة 96-جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من HBS لوحة لتكون بمثابة فارغة.
  4. إضافة 2.5 ميكرولتر من 2 ملي IR1 حل لكل عينة ويهز لوحة على لوحة شاكر لمدة 10 دقيقة.
  5. بعد 10 دقيقة، والحصول على أطياف الانبعاث من العينات باستخدام قارئ لوحة 96-جيدا (365 EX / 400-700 م).
    1. وضع لوحة في الصك وفتح برنامج قارئ لوحة لإنشاء تجربة جديدة.
    2. تعيين إكسب جديدeriment لقراءة تفحص مضان مع الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر، وعرض الشق من 9 نانومتر مع البصريات في المرتبة الأولى.
    3. قراءة الانبعاثات 300-700 نانومتر مع حجم الخطوة من 5 نانومتر.
    4. تصدير البيانات لتحليل البيانات.
  6. نقل العينات إلى اضحة وحة 96 جيدا وصورة الانبعاثات باستخدام نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية.

3. معايرة IR1 مع BNT-II

  1. إعداد 1 ملم حل سهم BNT-II (MW 8233.6 ز / مول) في HBS فضلا عن حل 2 ملم من IR1 في الميثانول.
  2. من محلول المخزون، وإعداد 1 مل من 100 ميكرومتر BNT-II في HBS. دوامة أنبوب microcentrifuge لضمان عينة مختلطة.
  3. تمييع متسلسل 100 ميكرومتر BNT-II بمقدار النصف في HBS إلى تركيز النهائي من 1.56 ميكرومتر BNT-II.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في ثلاث نسخ، مع HBS بمثابة فارغة، إلى الآبار من 96 لوحة جيدا. لكل عينة، إضافة 2.5 ميكرولتر من 2 ملي IR1.
  5. الشيخأك لوحة لمدة 10 دقيقة على لوحة شاكر.
  6. بعد الهز، وقراءة كثافة الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 365 نانومتر) باستخدام قارئ لوحة 96-جيدا.
    1. وضع لوحة في الصك وفتح برنامج قارئ لوحة لإنشاء تجربة جديدة.
    2. تعيين تجربة جديدة لقراءة نقطة النهاية مضان مع الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 510 نانومتر. تعيين عرض الشق لكل من الأطوال الموجية ل9nm، مع البصريات في المرتبة الأولى.
    3. قراءة لوحة وتصدير البيانات لتحليلها.
  7. نقل العينات إلى اضحة وحة 96 جيدا وصورة المعايرة باستخدام نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية.

4. في الوقت الحقيقي التحليل الحركي للنظام IR1 / BNT-II عن طريق التداخل Biolayer

  1. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة الحركي (KB؛ 1X الفوسفات مخزنة المالحة مع توين-20 0.02٪) إلى 8 آبار في العمود الأول من سوداء لوحة 96-جيدا وتضاف لوحة في أجهزة الاستشعار البلاستيكحامل. نقل بعناية 8 ني (II) أجهزة الاستشعار NTA إلى العمود الأول في حامل البلاستيك مثل أن النصائح التي علقت في آبار العازلة. وضع حامل البلاستيك في الجانب الأيسر من أداة التداخل.
  2. إعداد 2 مل من 0.5 ميكرومتر حل BNT-II في KB.
  3. إعداد 500 ميكرولتر من 10 ميكرومتر حل IR1 في KB، وتمييع متسلسل إلى النصف وصولا الى 0.156 ميكرومتر في KB.
  4. إلى أسود 96 لوحة جيدا جديدة، ماصة 200 ميكرولتر من KB إلى جميع الآبار 8 في العمود A و C.
  5. في نفس اللوحة، ماصة 200 ميكرولتر من الحل 0.5μM BNT-II إلى الآبار في العمود B.
  6. ماصة 200 ميكرولتر من كل تخفيف من IR1 في العمود D، بدءا KB كما الفراغ في D1 جيدا. إضافة التخفيفات بحيث تزيد من الآبار في تركيز IR1 أسفل العمود.
  7. وضع هذه اللوحة في الصك على يمين لوحة تحتوي على أجهزة استشعار ما قبل التبول.
  8. في البرنامج biolayer التداخل، وإنشاء kinet الأساسيجيم التجربة من خلال تحديد نصائح لوحة، والفحص، وأجهزة الاستشعار.
    1. لتعريف لوحة، حدد العمود على الشاشة، انقر على الحق، واختيار تعريف مناسب للآبار. حدد "مخزن" للأعمدة A و C، "تحميل" العمود B، و "عينة" لالعمود D.
    2. تعريف الفحص في علامة التبويب التالي من خلال إضافة الخطوات التالية (انقر على "أضف"): موازنة (مخصص)، و 60 ثانية؛ تحميل، 120 ثانية؛ خط الأساس، 60 ثانية؛ جمعية، 120 ثانية؛ والتفكك، 300 ثانية. حدد الخطوة موازنة وانقر نقرا مزدوجا على العمود A. كرر لتحميل (العمود B)، الأساس (العمود C)، وجمعية (العمود D)، والتفكك (العمود C). حدد أجهزة الاستشعار ني (II) NTA.
    3. الانتقال إلى علامة التبويب التالية وتأكد من أن أجهزة الاستشعار في العمود A على حامل استشعار البلاستيك.
    4. تأكيد ويرد التجربة بشكل صحيح، إدراج اسم الملف، تأكد من أن "التجربة تأخير" محددا، ثم اضغط على "الذهاب".
      NOTE: نظرا لطبيعة الآلية الصك، مرة واحدة ويرد التجربة الحركية، سيحدث الخطوات كما كان مخططا.
  9. مرة واحدة على المدى الحركي الكامل، معالجة البيانات في برامج معالجة المقدمة.
    1. انقر نقرا مزدوجا على مجلد مع اسم الملف من الاهتمام في الجزء السفلي من لوحة على اليسار. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد المقابلة تحت عنوان "حركية" في الجزء العلوي من لوحة. الانتقال إلى علامة التبويب التجهيز.
    2. ضع علامة في المربع الطرح على اليسار لفتح شاشة اختيار أجهزة الاستشعار. انقر بزر الماوس الأيمن على A4 جيدا وتغيير نوع جيد لالمرجعي حسنا.
    3. ضع علامة في المربع بجانب محاذاة محور Y، وضمان الخطوة المحددة هي الأساس. تحديد نطاق الوقت ليكون خمسة ثانية الأخير من خط الأساس (حوالي 55-60 ثانية).
    4. ضع علامة في المربع للانتر خطوة تصحيح وحدد محاذاة إلى التفكك. تأكد من أن مربع Savitzky-غولي تصفية يتم التحقق ثم اضغط على "عملية بيانات! ̶1؛
    5. الانتقال إلى علامة التبويب تحليل. تأكد من أن "جمعية والتفكك" هو اختيار لاتخاذ خطوات لتحليل وأن هذا النموذج هو 1: 1. حدد المحلي، وصالح كامل واضغط على "المنحنيات صالح!"
    6. تسليط الضوء على جميع المنحنيات في الجدول وانقر بزر الماوس الأيمن لتعيين كافة منحنيات إلى لون واحد. بعد ذلك، حدد (كامل) صالح العالمية، التي تم تجميعها حسب اللون وRmax غير المرتبطة كتبها الاستشعار. اضغط على "المنحنيات صالح!" للحصول على بيانات حركية العالمية.

5. على حبة الكشف عن BNT-II وrcHRP-II مع IR1

  1. إعداد 1 مل لكل منهما من 1 ميكرومتر حل BNT-II وrcHRP-II في HBS مع توين (HBST؛ HBS مع توين 20 0.025٪).
  2. متسلسل تمييع كل من البروتين بمقدار النصف في HBST إلى التركيز النهائي من 15.6 نانومتر.
  3. ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في ثلاث نسخ، إلى بيضاء لوحة 96-جيدا، مع التخفيفات في أمر من أدنى إلى أعلى تركيز أسفل العمود.
  4. ماصة 10 ميكرولتر من 50 ميكرومتر ني (II) NTA الجسيمات المغناطيسية الاغاروز في كل تخفيف جيدا.
    1. دوامة أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على جزيئات مغناطيسية بعد كل pipetting للضمان البقاء الجسيمات العالقة.
  5. وضع لوحة على لوحة شاكر لمدة 15 دقيقة لاحتضان العينات مع الجسيمات.
  6. بعد هذه الفترة الحضانة، ووضع لوحة على 96-جيدا لوحة المغناطيس والانتظار 30 ثانية للجسيمات لتنسحب من الحل.
  7. باستخدام ماصة الأقنية، وسحب قبالة العينة الأصلية وتجاهل كنفايات. إزالة لوحة من المغناطيس.
  8. إضافة 200 ميكرولتر من HBST إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. ضخ عازلة صعودا وهبوطا عدة مرات لغسل الجزيئات المغناطيسية.
  9. وضع لوحة العودة إلى المغناطيس والانتظار 30 ثانية للجسيمات لتنسحب من الحل.
  10. باستخدام ماصة الأقنية، وسحب قبالة 200 ميكرولتر من العازلة وتجاهل كنفايات. إزالة لوحة من المغناطيس.
  11. كرر الخطوات من 5.8 ماراح 5.10 مرتين لإكمال ثلاث غسلات للجسيمات.
  12. إضافة 100 ميكرولتر من HBST إلى كل الجسيمات المغناطيسية التي تحتوي جيدا تليها 2.5 ميكرولتر من 2 ملي IR1.
  13. احتضان الجسيمات مع IR1 على شاكر لوحة لمدة 1 ساعة.
  14. بعد 1 ساعة، وقراءة كثافة الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 365 نانومتر) باستخدام قارئ لوحة 96-جيدا.
    1. وضع لوحة في الصك وفتح برنامج قارئ لوحة لإنشاء تجربة جديدة.
    2. تعيين تجربة جديدة لقراءة نقطة النهاية مضان مع الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر الطول الموجي وانبعاث 510 نانومتر. تعيين عرض الشق لكل من الأطوال الموجية إلى 9 نانومتر، مع البصريات في المرتبة الأولى.
    3. قراءة لوحة وتصدير البيانات لتحليلها.
  15. نقل العينات إلى اضحة وحة 96 جيدا وصورة المعايرة باستخدام نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية.

Representative Results

كما هو مبين في الشكل رقم 1، والتوليف من IR1 solvento معقد تقسيم تشارك الجسر الكلوريد في ديمر الأم ترسيب كلوريد في شكل غير قابل للذوبان أجكل وتكوين الجمعيات من جزيئات الماء إلى مركز المعدن. وأكد تشكيل IR1 التي كتبها H 1 NMR وESI. بالإضافة إلى ذلك، تم تعيين نطاقات الأشعة فوق البنفسجية مرئية المميزة ليجند المعادن نقل المسؤول وπ-π التحولات * لطيف، كذلك التحقق من صحة تشكيل IR1. هذه الإذابة بالإكترونات المعارض معقدة أي حرف انبعاثاتها عندما متحمس في 365 نانومتر.


الشكل 1
الشكل 1: تحضير وتوصيف IR1 رد فعل جسر كلوريد تقسيم Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) فينيل) diiridium (III) لإنشاء مجمع aquo عير (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (IR1). عند إضافة L-بلده في مجمع aquo في المخزن المائي، يتم تشغيل إشارة الانارة جرا.

مرة واحدة تم تصنيعه معقدة وتميزت، تم تحليل الانتقائية الأحماض الأمينية، كما هو موضح سابقا باستخدام الايريديوم التناظرية مماثلة (17). ويبين الشكل 2A أن الحامض الاميني الوحيد إلى استجابة إشارة في 510 نانومتر، عندما متحمس في 365 نانومتر.


الرقم 2
الشكل 2: الأحماض الأمينية الانتقائية والمعايرة من IR1 مع الحامض الأميني ريتش الببتيدات (A) تفاعل 200 ميكرومتر من الأحماض الأمينية المختلفة (السيستئين، سر، ASP، حمض الغلوتاميك، الفنيل ألانين، ليس، الارجنتين، صور، التربتوفان، صاحب) مع 50 ميكرومتر. IR1 في HBS. اتخذت بالاشعة الطيفية 400-700 نانومتر في الطول الموجي الإثارة من 365 نانومتر في السوداء 96 لوحة جيدا. إشارة في وحدات مضان النسبي (RFU) من جميع الأحماض الأمينية بكان esides الحامض الاميني (متقطع أثر أسود) يكاد يذكر. ومعاير تركيزات (B) Nanomolar من BNT-II (▪) وrcHRP-II (♦) مع IR1 في HBS. وحضنت الببتيدات الغنية الحامض الاميني مع لجنة التحقيق لمدة 15 دقيقة في محلول قبل قراءة الانبعاثات في 510 نانومتر بعد الإثارة مع 365 ضوء نانومتر. تم احتساب الحد من الكشف حيث بلغت قيمة س عندما ص = 3σ فارغة.

هذا "التبديل على" من تفسفر لجنة التحقيق الايريديوم يحدث لأن الدولة متحمس القميص (1 MLCT / 1 LC) من عير (III) bioconjugate يخضع معبر intersystem إلى الثلاثي متحمس للدولة (3 MLCT)، عندما يتم تنسيق الحامض الاميني إلى مركز المعدن. تم تطبيق هذا التحقيق إلى BNT-II الببتيد تقليد من العلامات البيولوجية الملاريا المنجلية البروتين الحامض الأميني ريتش II (الجبهة الوطنية HRP-II). في المعايرة من BNT-II مع IR1، لوحظ وجود تركيز استجابة إشارة تعتمد ( D من IR1 ملزمة لBNT-II على سطح النيكل (II) NTA وجدت لتكون 2.05 ميكرومتر (الشكل 3).

الرقم 4

الرقم 3: في الوقت الحقيقي تحليل الحركية من IR1 مع BNT-II Biolayer التداخل للتحليل الحركي تركيزات مختلفة من IR1 ملزمة لBNT-II على سطح النيكل (II) NTA استشعار الزجاج. بعد توازنه أجهزة الاستشعار في KB (منطقة A)، يتم تحميل أجهزة الاستشعار مع 0.5 ميكرومتر BNT-II (المنطقة B). بمجرد أن يتم تحميل الببتيد على أجهزة الاستشعار، ويتم تأسيس خط الأساس (منطقة C) قبل قياس جمعية IR1 إلى BNT-II (منطقة D). بعدفترة تكوين الجمعيات، يتم وضع أجهزة استشعار العودة الى KB لقياس تفارق (منطقة E). عملية تحليل الحركية كلها تستغرق أقل من 30 دقيقة.

عند الانتقال من مقايسة على أساس حل لمنصة الجسيمات المغناطيسية، وكان تعقيد المضافة للجسيمات في النظام يجب أن تؤخذ في الاعتبار. كان معروفا من الأعمال السابقة، أن هذه الجزيئات تربط بكفاءة الجبهة الوطنية العلامات البيولوجية الملاريا HRP-II. عملت 24 لوحات الفلورية السوداء جيدا للمقايسة حل صفنا أعلاه، ولكن كانت لوحات بيضاء أكثر ملاءمة لمنصة الكشف عن الجسيمات، كما رأينا في الشكل 4A. في لوحة بيضاء، وينعكس الضوء مرة أخرى في العينة، وبالتالي السماح لامتصاص أفضل من قبل IR1 منضمة إلى سطح الجسيمات. في مقايسة على الجسيمات، والحد من الكشف عن rcHRP-II مصممة على أن تكون 14.5 نانومتر (الشكل 4B). كان الحد من الكشف عن rcHRP-II-في الحل وعلى حبة statistically نفسه على أساس المفردة اختبار (ت) (ع = 0.731).

الرقم 5
الرقم 5


الرقم 4: على حبة الكشف عن BNT-II وHRP-II (A) الفرق بين إشارة الكشف عن IR1 بد أن BNT-II على سطح 50 ميكرومتر ني الجسيمات الاغاروز (II) NTA المغناطيسي في الأسود 96- كذلك لوحة (خط الصلبة) مقابل البيضاء لوحة 96-جيدا (خط متقطع). تم متحمس الجسيمات مع 365 ضوء نانومتر، وتم قياس الانبعاثات في 510 نانومتر. (B) المعايرة من rcHRP-II ثبتوا على الجسيمات المغناطيسية والكشف عنها باستخدام IR1. تم احتساب الحد من الكشف باعتبارها زارة شؤون المحاربين القدامىLUE من س عندما ص = 3σ فارغة.

الرقم 5

الشكل 5: التمثيل التخطيطي للكشف على حبة من rcHRP-II مع IR1 مخطط عام لHRP-II ملزمة لسطح النيكل (II) NTA الجسيمات وصفت مع IR1. يتم تحضين الجسيمات مع الحامض الاميني الببتيد الغني لمدة 15 دقيقة. بعد هذه الفترة الحضانة، يتم غسلها جزيئات مع HBST باستخدام المغناطيس، من أجل سحب الجسيمات من الحل. وأخيرا، يتم تحضين الببتيد ملزمة الجسيمات مع IR1 لمدة 1 ساعة قبل قراءة الانبعاثات في 510 نانومتر بعد الإثارة مع 365 ضوء نانومتر.

Discussion

كأدوات القائم على microparticle التشخيص تأتي في طليعة التكنولوجيا التشخيصية الحديثة، والكشف عن الجزيئات الحيوية الهدف مباشرة على سطح الجسيمات هو ميزة كبيرة. طرق الكشف الجزيئي التقليدية، مثل ELISA وPCR، هي مفيدة، لأنها يمكن أن تحقق حدود منخفضة جدا من الكشف عن 25. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات تتطلب الكواشف واسعة والبروتوكولات طويلة. وقد صمم هذا الاختبار لتقليد ELISA من نوع التفاعلات شطيرة دون الوقت ومتطلبات كاشف (الشكل 5). بالإضافة إلى ذلك، تم تقدير تكلفة التحقيق IR1 لكل عينة لتكون حول فلسا واحدا، في حين أن تكلفة الأجسام المضادة لELISA نموذجي هو 0،20-0،30 دولار للعينة.

منذ الأساليب المذكورة أعلاه تعتمد على التحقيق إيريديوم cyclometalated للكشف عن العلامات البيولوجية الملاريا، فإن هذا التحقيق لا تكون عرضة للفشل وسائط مشتركة لطرق الكشف الأخرى (أي. quenchi fluorophoreنانوغرام وتدهور الأجسام المضادة / انزيم). الحامض الاميني هي فريدة من نوعها في المعادن ملزمة خصائصه. العمل الموضح يستفيد من هذه الظاهرة عن طريق استبدال الأجسام المضادة في شطيرة ELISA نموذجي مع المجمعات المعادن التي تحتوي على. ني (II) NTA يلتقط rcHRP-II على سطح الجسيم وIR1 يشير إلى وجود البروتين. الخطوة الأكثر أهمية في مقايسة هو السماح للجزيئات مغناطيسية لخلط مع العينة والتحقيق. في 96-جيدا لوحة ELISA، والجزيئات الحيوية والكواشف إلى حالة توازن مع سطح ثنائي الأبعاد من قاع البئر. الجسيمات المغناطيسية لديهم ميل إلى تسوية من حل بهم بسبب كثافة النواة أكسيد الحديد، والتي من شأنها أن تقلل من مواقع الربط المتاحة. وبالتالي، يجب أن تكون مختلطة الجسيمات خلال فترة الاختبار لضمان الربط القصوى.

عند تصميم كاشف لتشخيص المرض، لا بد من أن نأخذ في الاعتبار شكل عينة المرضى وكذلك التركيز الفسيولوجي من العلامات البيولوجية. إلىالملاريا، وتركيز الجبهة الوطنية HRP-II في دم المريض يمكن أن تختلف من بيكو مولي منخفضة لnanomolar عالية. في حين أن هذا الاختبار هو ذات الصلة سريريا لتحقيق مستويات أعلى من العدوى، والحد من الكشف يحتاج إلى تحسين من أجل الكشف عن المرضى الذين يعانون أعراض مع انخفاض بيكو مولي المتداولة الجبهة الوطنية HRP-II. في الأساليب المذكورة أعلاه، فإن "التبديل على" إشارة الناتجة عن IR1 يحدث في وجود الحامض الاميني. في حين أن العلامات البيولوجية ملاريا غنية في الحامض الاميني، بروتينات مصل أخرى، مثل ألبومين المصل البشري والحامض الاميني بروتين سكري غنية، من شأنه أن يثير استجابة إشارة مع التحقيق. سيكون هذا بدوره يؤدي إلى تشخيص إيجابية كاذبة. وهذا يجعل من القبض على البروتين على سطح الجسيمات خطوة مفيدة في هذا البروتين من الفائدة يمكن استخراجها بسرعة من عينة المرضى. بالإضافة إلى ذلك، تصميم المسبار bifunctional، أن الأزواج على الحامض الاميني الببتيد الغنية إلى عنصر الاعتراف الجزيئي القوي (أي. aptamer)، يمكن إضافة طبقة أخرى من خصوصية للفحص. ان الببتيد تكون محملة الايريديوم قبل اقتران إلى aptamer. في مثل هذا التصميم، ويمكن للIR1 التحقيق مستقرة لا تزال تستخدم في حين تحقيق خصوصية الهدف مع aptamer. هذا من شأنه أن يسمح للتطبيق لجنة التحقيق للكشف عن الأصلي HRP-II في مصفوفة معقدة (أي البلازما أو الدم الكامل) والحد من الآثار غير الملزمة محددة. من أجل زيادة تعزيز إشارة من الاختبارات التشخيصية السريعة، ويمكن إدراج الفحص في نظام electrochemiluminescent (ECL)، حيث يمكن الكشف عن الجبهة الوطنية HRP-II على أفرقة المديرين الإقليميين كما قراءات الكهروكيميائية 26. وهذا من شأنه المقبل التحقيق الجيل الايريديوم يعزز إلى حد كبير لدينا ELISA مقايسة على حبة للكشف عن المؤشرات الحيوية المرض.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
الايريديوم (III) الفلورسنت التحقيق للكشف عن البروتين ملاريا العلامات البيولوجية الحامض الأميني ريتش بروتين-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter