Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

אירידיום (III) פלורסנט בדיקה לאיתור של חלבון המלריה ביומרקר היסטידין העשיר החלבון-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

עבודה זו מתארת ​​את הסינתזה של אי emissive, cyclometalated עיר (III) מורכב, עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), אשר מעורר אות מהירה, חיים ארוכים זרחנית כאשר מתואם לhistidine- מכיל חלבון משותק על פני השטח של חלקיקים מגנטיים. סינתזה של Ir1, בתשואות גבוהות, היא O מלא / N וכרוך פיצול של ההורה cyclometalated עיר (III) דימר-כלורו גישור לשני שווה של מתחם solvated. כדי לאשר סגוליות, כמה חומצות אמינו נבדקו לפעילות תיאום כאשר הוסיפו לבדיקה המסונתזת, והיסטידין רק עורר תגובת אות. באמצעות BNT-השני, לחקות פפטיד קנים של הסמן הביולוגי המלריה חלבון היסטידין העשיר השני (pfHRP-II), הבדיקה אירידיום קבלה תוקף ככלי לזיהוי HRP-השני. השפעות מרווה נרשמו בטיטרציה BNT-II / Ir1 בהשוואה לL-היסטידין / Ir1, אבל אלה יוחסו למכשול ותלת הסטריplet מרווה מדינה. Biolayer אינטרפרומטריה שימשה כדי לקבוע קינטיקה של אינטראקציה של Ir1 עם BNT-השני בזמן אמת. ברגע שהמערכת הייתה מותאמת, המגבלה של זיהוי של rcHRP-השני באמצעות הבדיקה נמצאה כי 12.8 ננומטר בפתרון. כאשר חלבון זה היה משותק על פני השטח של חלקיקים מגנטיים agarose 50 מיקרומטר, המגבלה של זיהוי הייתה 14.5 ננומטר. התגובה החזקה של אות בדיקה אורגנית זה, כמו גם גמישותה של שימוש בפתרון או משותק על פני השטח, יכולה להשאיל את עצמו לכיוון מגוון רחב של יישומים, משימוש אבחון להדמיה.

Introduction

תיוג colorimetric וניאון הוא שיטה חשובה לזיהוי והמעקב של מולקולות ביוכימיים ותהליכי 1,2. סמני הניאון הנפוצים ביותר הם צבעי משקל מולקולרי נמוכים אורגניים 3,4, אבל לא תמיד יש מולקולות אלה תכונות אופטיות אידיאלית. צבעי ניאון נוטים photobleaching, לעתים קרובות יש משמרות סטוקס קטנות, וייתכן שיש לי עירור חופף וספקטרום פליטה. תיוג colorimetric מושגת לעתים קרובות על ידי השימוש בתוויות האנזימטית, שיש לי אות מוגברת שימושית ב5,6 כימות immunoassay. אנזימים אלה יש גם החסרונות שלהם, כוללים רגישות, תנאי תגובה, וחיי מדף קצר מצע. מאפיינים אלה נוטים לדרוש immunoassays ושיטות תיוג חלבון צריך להיעשות בתנאים מבוקרים היטב באמצעות ריאגנטים יקרים.

מתחמי מעבר מתכת emissive נחקרו כגישה תיוג חלופית FOr זיהוי ביוכימיים. בפרט, cyclometalated עיר (III) נחקר בהקשר של דיודות אורגניות פולט אור (OLEDs) 7-9 חמצן חישת 10, קטליזה 11, וחלבון / תא מכתים 12-14. בצילום גבוה ויעילות קוונטית לעשות סוג כזה של בדיקות מועמד טוב לזיהוי biomolecule 15,16. נמצא בעבר כי cyclometalated עיר (III) מתחמים, של הצורה [עיר (C ^ N) 2 (solv) 2] +, באופן בלתי הפיך להיקשר היסטידין ולעורר תגובת אות כחולה-ירוקה 12,17. מתחמים אלה שאינם emissive במדינת solvento, אבל כאשר היסטידין מחליף את מולקולות ממס ונקשר למרכז המתכת, הם משחררים אות זרחנית עזה לאחר קרינת UV גל ארוך. אות זו מתרחשת רק לאחר החלפת יגנד, והוא התוצאה של אלקטרון מדינת שלישייה המרגיע למדינת הקרקע באמצעות ההפעלה של העברת מטען ליגנד מתכת (3 מ"ל CT) והעברה ליגנד מרוכז (3 LC) מסלולי 8,15. מתחמים אלה עלולים לשמש כבדיקות לגילוי חלבוני היסטידין עשיר.

חלבוני היסטידין עשיר ורמות הרגולציה שלהם הם חשובים במחלות רבות, לרבות שחמת כבד, סרטן, והפרעות thrombic. 18 חלבון Plasmodium falciparum היסטידין העשיר השני (pfHRP-II) בפרט הוא סמן ביולוגי תוקף היטב לזיהום טפיל מלריה. חלבון זה הוא 67 kDa ומכיל 34% היסטידין, בעיקר במוטיבי AHHAHHAAD חוזר מאפיין 19. חוזר היסטידין אלה יכולים להיקשר יונים חופשי מתכת 19 וheme קומפלקסי 20 בדם מארח. pfHRP-השני מזוהה בדרך כלל בהגדרות נמוך משאב באמצעות בדיקות immunochromatographic מהירות אבחון (RDTs), אבל בדיקות אלה הן לעתים קרובות לא מדויקות בשל תנאי מדגם, ריכוז סמן ביולוגי נמוך, תקני ייצור עניים, והשפלה נוגדן 21.

"Jove_content"> בדיקות זרחניות מבוסס מתכת כגון עיר cyclometalated (III) מתחמים שתוארו לעיל הם אפשרויות אטרקטיביות לגילוי pfHRP-השני בשל כריכתם סלקטיבית של היסטידין ומאפייני סטאבילה ופליטה היעילה שלהם. במאמר זה, השימוש ב[ עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) כדי לזהות BNT-השני, לחקות פפטיד קנים של pfHRP-II הוא חקר 22. קינטיקה של אינטראקציה זו הייתה במעקב בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אינטרפרומטריה biolayer. Assay גם מותאם לפורמט ELISA-סוג על-חרוז, שבו גבולות של ננו-מולר של זיהוי הושגו. assay זה מחזיק יתרונות על פני ELISAs המסורתי כי זה יכול להתבצע בתחת 2 שעות עם חומרים כימיים ללא נוגדנים, במקום שעות 4-5 וריאגנטים ביולוגיים הנדרשים עם ELISAs הטיפוסי.

Protocol

1. סינתזה של אירידיום מורכב (III)

  1. לשקול את 53.6 מ"ג (50 μmol) של [עיר (PPy) 2 -Cl] 2 ולפזר ב 5 מיליליטר של מתילן כלוריד. להוסיף את הפתרון הזה לבקבוק 50 מיליליטר Erlenmeyer מצויד בבר ומערבבים.
  2. לשקול את 26.2 מ"ג (100 μmol) של AgOTf ולפזר ב 5 מיליליטר של מתנול.
  3. הוסף את AgOTf המומס ל[ עיר (PPy) 2 -Cl] 2 פתרון ומערבבים במשך שעה 1.
    הערה: תרחיף בצבע קרם אמור לגרום.
  4. אחרי שעה 1, לסנן את התרחיף דרך סיליקה ג'ל לתוך בקבוקון DRAM 25 x 95 מ"מ ולהתנדף ממס שנותר באמצעות מאייד סיבובי (5-10 דקות).
  5. ברגע שרוב הממס הוסר, לבדוק ששאריות צהובות שמנוניות נשארה בבקבוקון. לשאריות זה, להוסיף 1 מיליליטר של מתנול מחדש לפזר את המוצר וLyophilize 1-2 ימים להניב המוצר המוצק הצהוב.
  6. מאפיין את עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 + המוצר (Ir1) על ידי H <sup> 1 NMR (בCDCl 3), ESI ו- UV-Vis כפי שתואר לעיל. 23

2. אינטראקציות של Ir1 עם חומצות אמינו שונות

  1. הכן פתרון 2 מ"מ של Ir1 במתנול (MW 537.10 g / mol). מערבולת כדי להבטיח פירוק המוצק מלא.
  2. הכן של חומצות אמינו ומולקולות הביולוגיות הבאות בHEPES 100 מיקרומטר פתרונות שנאגרו מלוח (HBS, 100 מ"מ HEPES, 137 מ"מ NaCl, pH 7.4) עלא, ASP, Cys,, איל, יס, סר, נסה, ואל.
  3. פיפטה של ​​כל חומצת אמינו 100 μl לתוך צלחת 96-גם שחורה. להוסיף של HBS 100 μl לצלחת לשמש כריק.
  4. להוסיף 2.5 μl של פתרון 2 מ"מ Ir1 לכל דגימה ולנער את הצלחת על שייקר צלחת במשך 10 דקות.
  5. לאחר 10 דקות, לרכוש את ספקטרום הפליטה של ​​הדגימות באמצעות קורא 96-גם צלחת (365 לשעבר / 400-700).
    1. מניחים את הצלחת במכשיר ולפתוח את תוכנת צלחת הקורא להגדיר ניסוי חדש.
    2. הגדר את Exp החדשeriment לקרוא סריקת הקרינה עם אורך גל עירור של 365 ננומטר ורוחב חריץ של 9 ננומטר עם אופטיקה במיקום העליון.
    3. קראו את הפליטה 300-700 ננומטר עם גודל צעד של 5 ננומטר.
    4. לייצא את הנתונים לניתוח נתונים.
  6. העברת הדגימות לצלחת 96-היטב ברורה ותמונת הפליטה באמצעות transilluminator UV.

3. כותרות של Ir1 עם BNT-II

  1. הכן פתרון 1 מ"מ מניות של BNT-II (MW 8,233.6 g / mol) בהרוורד, כמו גם פתרון 2 מ"מ של Ir1 במתנול.
  2. מפתרון המניות, להכין 1 מיליליטר של 100 מיקרומטר BNT-השני בהרוורד. מערבולת צינור microcentrifuge כדי להבטיח המדגם הוא מעורב.
  3. סדרתי לדלל 100 מיקרומטר BNT-השני בחצי בHBS לריכוז סופי של 1.56 מיקרומטר BNT-השני.
  4. להוסיף לכל דילול 100 μl, בשלושה עותקים, עם HBS משמש כריק, לבארות של צלחת גם 96. לכל דגימה, להוסיף 2.5 μl של 2 מ"מ Ir1.
  5. Shמתקין את הצלחת למשך 10 דקות על שייקר צלחת.
  6. אחרי שלחץ, לקרוא את עוצמת הפליטה ב 510 ננומטר (עירור ב 365 ננומטר) באמצעות קורא צלחת 96-היטב.
    1. מניחים את הצלחת במכשיר ולפתוח את תוכנת צלחת הקורא להגדיר ניסוי חדש.
    2. הגדר את הניסוי החדש לקרוא נקודת סיום הקרינה עם אורך גל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​510 ננומטר. הגדר את רוחב החריץ עבור שני אורכי הגל ל9nm, עם אופטיקה במיקום העליון.
    3. קראו את הצלחת ולייצא את הנתונים לניתוח.
  7. העברת הדגימות לצלחת 96-היטב ברורה ותמונת טיטרציה באמצעות transilluminator UV.

4. בזמן אמת קינטי ניתוח של מערכת Ir1 / BNT-II שימוש Biolayer Interferometry

  1. הוסף 200 μl של חיץ הקינטית (KB; פוספט 1x שנאגרו מלוח עם 0.02% Tween-20) עד 8 בארות בעמודה הראשונה של צלחת 96-היטב שחורה ולהכניס את הצלחת לתוך חיישן הפלסטיקבעל. להעביר בזהירות 8 (II) חיישני נת"ע Ni לעמודה הראשונה בבעל הפלסטיק כך שהטיפים מושעים בבארות של מאגר. מניחים את בעל הפלסטיק בצד השמאל של מכשיר אינטרפרומטריה.
  2. הכן 2 מיליליטר של פתרון 0.5 מיקרומטר של BNT-השני בKB.
  3. הכן 500 μl של פתרון 10 מיקרומטר של Ir1 בKB, וסדרתי לדלל בחצי עד 0.156 מיקרומטר בKB.
  4. לצלחת חדשה 96 שחורים גם, פיפטה 200 μl של KB לכל 8 הבארות בעמודה A ו- C.
  5. באותה הצלחת, 200 μl פיפטה של ​​פתרון 0.5μM BNT-השני לבארות בעמודה B.
  6. פיפטה 200 μl של כל דילול של Ir1 לעמודת D, החל KB כריק בD1 גם. הוסף את דילולים כך שהבארות להגדיל בריכוז Ir1 את הטור.
  7. מניחים צלחת זה במכשיר בצד הימין של הצלחת המכילה חיישנים מראש הרטבה.
  8. בתוכנת אינטרפרומטריה biolayer, להגדיר kinet בסיסיIC ניסוי על ידי הגדרת הטיפים צלחת, assay, וחיישן.
    1. כדי להגדיר את הצלחת, בחר עמודה על המסך, לחץ לחיצה ימנית, ולבחור את ההגדרה המתאימה לבארות. בחר "הצפת" לעמודות ו- C, "טען" לעמודת B, ו- "לדוגמא" לטור ד
    2. הגדר את assay בכרטיסייה הבאה על ידי הוספת השלבים הבאים (לחץ על "הוסף"): איזון (מותאמת אישית), 60 שניות; טוען, 120 שניות; Baseline, 60 שניות; איגוד, 120 שניות; ודיסוציאציה, 300 שניות. בחר את צעד האיזון ולחץ לחיצה כפולה על חזור על עמודת A. לטעינה (העמודה B), Baseline (העמודה C), האגודה (העמודה D), ודיסוציאציה (עמודת C). בחר את חיישני Ni (II) נת"ע.
    3. לעבור ללשונית הבאה ולאשר כי החיישנים נמצאים בעמודה על בעל חיישן פלסטיק.
    4. לאשר את הניסוי מתואר בצורה נכונה, להכניס את שם הקובץ, להבטיח כי "ניסוי עיכוב" מסומן, ו" עבור. "עיתונות
      NOTE: בשל האופי האוטומטי של המכשיר, לאחר שהניסוי הקינטית מתואר, הצעדים יתרחשו כמתוכן.
  9. ברגע שהקינטית הריצה תושלם, לעבד את הנתונים בתוכנת העיבוד סיפקה.
    1. לחץ לחיצה כפולה על התיקייה עם הקובץ של עניין בחלק התחתון של הלוח בצד השמאל. לאחר מכן, לחץ לחיצה כפולה על התיקייה המתאימה תחת "קינטיקס" בחלק העליון של הלוח. לעבור ללשונית העיבוד.
    2. סמן את תיבת החיסור בצד השמאל כדי לפתוח את מסך בחירת חיישן. לחץ לחיצה הימנית על גם A4 ולשנות את הסוג גם להפניה ובכן.
    3. סמן את התיבה לצד יישור ציר Y, ​​ולהבטיח את הצעד שנבחר הוא Baseline. ציין את טווח הזמן להיות חמש שניות האחרונות של הבסיס (כ 55-60 שניות).
    4. סמן את התיבה לתיקון Inter-צעד ובחר יישור לדיסוציאציה. ודא שתיבת Savitzky-Golay הסינון נבדק ותהליך העיתונות "נתונים! ̶1;
    5. לעבור ללשונית ניתוח. ודא כי "האגודה ודיסוציאציה" היא הבחירה לצעדים כדי לנתח ושהדגם הוא 1: 1. בחר בכושר מקומי, מלא ולחץ "Curves Fit!"
    6. סמן את כל הקימורים בטבלה ולחץ על זכות להגדיר את כל הקימורים לצבע אחד. בשלב הבא, בחר גלובלי בכושר (מלא), מקובצים לפי צבע וRmax לא צמוד על ידי חיישן. לחץ על "Curves Fit!" לקבל נתונים קינטיקה הגלובלית.

5. ביום-חרוז איתור של BNT-השני וrcHRP-II עם Ir1

  1. הכן 1 מיליליטר כל אחד מפתרון 1 מיקרומטר של BNT-השני וrcHRP-השני בהרוורד עם Tween (HBST; HBS עם 0.025% Tween 20).
  2. סדרתי לדלל כל חלבון בחצי בHBST לריכוז סופי של 15.6 ננומטר.
  3. פיפטה של ​​דילול כל 100 μl, בשלושה עותקים, לצלחת 96-היטב לבנה, עם דילולים בהזמנה מנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר של עמודה.
  4. פיפטה 10 μl של 50 מיקרומטר Ni (II) חלקיקים מגנטיים נת"ע agarose לכל דילול גם.
    1. מערבולת צינור microcentrifuge המכיל חלקיקים המגנטיים לאחר כל pipetting כדי להבטיח את החלקיקים להישאר מושעים.
  5. מניחים את הצלחת על שייקר צלחת במשך 15 דקות כדי לדגור דגימות עם החלקיקים.
  6. לאחר תקופת דגירה זה, למקם את הצלחת על מגנט צלחת 96-היטב ולהמתין 30 שניות לחלקיקים לצאת מפתרון.
  7. בעזרת פיפטה רבה, למשוך את המדגם המקורי ולהשליך לפח אשפה. הסר את הצלחת מהמגנט.
  8. הוסף 200 μl של HBST זה גם בעזרת פיפטה הרבה. לשאוב את החיץ מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשטוף את החלקיקים המגנטיים.
  9. מניחים את הצלחת בחזרה אל המגנט ולהמתין 30 שניות לחלקיקים לצאת מפתרון.
  10. באמצעות פיפטה הרבה, למשוך את 200 μl של חיץ ולהשליך לפח אשפה. הסר את הצלחת מהמגנט.
  11. חזור על שלבים 5.8 througפעמים h 5.10 שני להשלים שלוש כביסות של החלקיקים.
  12. הוסף לHBST 100 μl לכל חלקיקים מגנטיים המכילים גם אחרי 2.5 μl של 2 מ"מ Ir1.
  13. דגירה החלקיקים עם Ir1 על שייקר צלחת במשך שעה 1.
  14. אחרי שעה 1, לקרוא את עוצמת הפליטה ב 510 ננומטר (עירור ב 365 ננומטר) באמצעות קורא צלחת 96-היטב.
    1. מניחים את הצלחת במכשיר ולפתוח את תוכנת צלחת הקורא להגדיר ניסוי חדש.
    2. הגדר את הניסוי החדש לקרוא נקודת סיום הקרינה עם אורך גל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​510 ננומטר. הגדר את רוחב החריץ עבור שני אורכי הגל עד 9 ננומטר, עם אופטיקה במיקום העליון.
    3. קראו את הצלחת ולייצא את הנתונים לניתוח.
  15. העברת הדגימות לצלחת 96-היטב ברורה ותמונת טיטרציה באמצעות transilluminator UV.

Representative Results

כפי שניתן לראות באיור 1, הסינתזה של קומפלקס solvento הפיצול המעורב Ir1 של גשר כלוריד בדימר ההורה על ידי משקעים של כלוריד בצורה של AgCl מסיס ועמותה של מולקולות מים למרכז המתכת. ההיווצרות של Ir1 אושרה על ידי H 1 NMR וESI. בנוסף, להקות UV לעין אופייניות להעברת מטען ליגנד המתכת וπ π-מעברים * חולקו לקשת, אימות היווצרות Ir1 נוספת. זה solvated מוצגים מורכבים לא אופי emissive כאשר נרגש ב365 ננומטר.


איור 1
איור 1:. סינתזה ואפיון של Ir1 תגובת פיצול גשר כלוריד של Dichlorotetrakis (2 (2-pyridinyl) פניל) diiridium (III) ליצירה מורכבת aquo עיר (PPy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1). עם התוספת של L-למתחם aquo במאגר המימי, אות ניאון מופעל.

ברגע שמורכב היה מסונתז ומאופיין, הסלקטיביות חומצת אמינו נותחה, כפי שתוארה לעיל באמצעות אנלוגי אירידיום דומה 17. איור 2A מראה כי היסטידין רק עורר תגובת אות ב 510 ננומטר, כאשר נרגש ב365 ננומטר.


איור 2
איור 2: חומצת אמינו הסלקטיביות וכותרות של Ir1 עם פפטידים עשירים היסטידין () אינטראקציה של 200 מיקרומטר של חומצות אמינו שונות (Cys, סר, ASP, Glu, Phe, יס, Arg, Tyr, TRP,) עם 50 מיקרומטר. Ir1 בHBS. סריקות רפאים נלקחו מ400-700 ננומטר בגל עירור של 365 ננומטר בצלחת גם שחורה 96. אות ביחידות הקרינה היחסית (RFU) מכל חומצות אמינו בהיסטידין esides (זכר שחור מקווקו) היה זניח. הריכוזים (B) של ננו-מולר של BNT-II (▪) וrcHRP-II (♦) היו טיטרציה עם Ir1 בHBS. פפטידים העשירים היסטידין הודגרו עם החללית במשך 15 דקות בתמיסה לפני קריאת הפליטה ב 510 ננומטר לאחר עירור עם 365 ננומטר אור. גבול של זיהוי חושב כערך של x כאשר y = ריק 3σ.

זה "מתג על-" של הזרחני של חללית אירידיום מתרחש משום שמדינת הגופייה הנרגשת (MLCT / LC 1 1) לעיר (III) bioconjugate עוברת מעבר intersystem למדינה מתרגשת השלישייה (3 MLCT), כאשר היסטידין מתואם למרכז המתכת. בדיקה זו הייתה מוחלת על BNT-השני פפטיד חקיין של הסמן הביולוגי המלריה חלבון Plasmodium falciparum היסטידין העשיר השני (PF HRP-השני). בטיטרציה של BNT-II עם Ir1, תגובת אות תלויה ריכוז נצפתה ( D של Ir1 מחייב BNT-השני משותק על פני השטח ניקל (II) נת"ע נמצא 2.05 מיקרומטר (איור 3).

איור 4

איור 3: בזמן אמת קינטי ניתוח של Ir1 עם אינטרפרומטריה BNT-השני Biolayer לניתוח הקינטית של ריכוזים שונים של Ir1 מחייבים BNT-II על פני השטח של ניקל חיישן זכוכית (II) נת"ע.. לאחר equilibrating החיישנים בKB (מחוז), החיישנים נטענים עם 0.5 מיקרומטר BNT-II (אזור ב '). ברגע שפפטיד נטען על החיישנים, בסיס הוקם (C מחוז) לפני מדידת איגוד Ir1 לBNT-II (אזור ד '). לאחרתקופה של עמותה, החיישנים ממוקמים בחזרה לKB למדוד דיסוציאציה (E אזור). תהליך הניתוח הקינטית כל לוקח פחות מ -30 דקות.

כאשר מעבר מ assay מבוסס פתרון לפלטפורמת חלקיקים מגנטי, מורכבות הנוספות של החלקיקים במערכת היו צריכות להילקח בחשבון. זה היה ידוע מהעבודה קודמת, שהחלקיקים אלה ביעילות מחייבים את PF הסמן הביולוגי המלריה HRP-השני. 24 צלחות ניאון שחורות עבדו היטב עבור assay הפתרון לתאר לעיל, אך צלחות הלבנות היו מתאימות יותר לפלטפורמת הגילוי על-חלקיקים, כפי שניתן לראות ב איור 4 א. בצלחת לבנה, האור משתקף בחזרה למדגם, ובכך מאפשר לספיגה טובה יותר על ידי Ir1 קשורה אל פני השטח של החלקיקים. בassay על-חלקיקים, המגבלה של זיהוי של rcHRP-השני הייתה נחושה להיות 14.5 ננומטר (איור 4). המגבלה של זיהוי לrcHRP-השני ב- פתרון ועל-חרוז היתה statistically אותו מבוסס על מבחן t מזווג (p = .731).

איור 5
איור 5


איור 4:. הבדל בחרוז איתור של BNT-השני וHRP-II () בין האות המזוהות מIr1 חייב BNT-II על פני השטח של 50 מיקרומטר ניקל חלקיקי agarose (II) נת"ע מגנטי בשחור 96 גם צלחת (קו מוצק) לעומת צלחת לבנה 96-היטב (קו מקווקו). החלקיקים התלהבו עם 365 ננומטר אור, והפליטה נמדדה ב 510 ננומטר. כותרות (B) של rcHRP-השני משותקים על החלקיקים המגנטיים וזוהו באמצעות Ir1. גבול של זיהוי חושב כvalue של x כאשר y = ריק 3σ.

איור 5

איור 5: ייצוג סכמטי של איתור בחרוז של rcHRP-II עם Ir1 תכנית כללית של HRP-השני מחייבת את פני השטח של ניקל (II) נת"ע חלקיקים ומסומנים עם Ir1.. החלקיקים מודגרת עם פפטיד העשיר היסטידין במשך 15 דקות. לאחר תקופת דגירה זה, החלקיקים נשטפים עם HBST באמצעות מגנט, כדי למשוך את החלקיקים מהפתרון. לבסוף, חלקיקי פפטיד מחויבים מודגרת עם Ir1 עבור שעה 1 לפני קריאת הפליטה ב 510 ננומטר לאחר עירור עם 365 ננומטר אור.

Discussion

ככלי אבחון מבוסס microparticle הגיעו לחזית טכנולוגית אבחון המודרנית, זיהוי של מולקולות ביולוגיות יעד ישירות על פני השטח של החלקיקים הוא יתרון גדול. שיטות מסורתיות מולקולריות זיהוי, כגון ELISA וPCR, הן יתרון, בכך שהם יכולים להשיג גבולות נמוכים מאוד של זיהוי 25. עם זאת, מבחני אלה דורשים חומרים כימיים נרחבים ופרוטוקולים ארוכים. assay זה נועד לחקות אינטראקציות כריך ELISA-סוג ללא הזמן ודרישות מגיב (איור 5). בנוסף, עלות הבדיקה Ir1 לדגימה הייתה מוערכת להיות סביב אגורה, ואילו העלות של נוגדנים לELISA טיפוסי היא .20-.30 $ למדגם.

מאז השיטות שתוארו לעיל מסתמכות על בדיקה אירידיום cyclometalated לגילוי של הסמן ביולוגי המלריה, בדיקה זו לא תהיה רגישה למצבי כישלון משותפים לשיטות זיהוי אחרות (כלומר. Quenchi fluorophoreng והשפלה נוגדן / אנזים). היסטידין הוא ייחודי בתכונות מחייבות המתכת שלה. העבודה המתוארת מנצלת תופעה זו על ידי החלפת הנוגדנים בכריך ELISA טיפוסי עם מתחמים המכילים מתכת. Ni (II) נת"ע לוכד rcHRP-II על פני השטח של החלקיקים וIr1 מסמן את הנוכחות של החלבון. השלב הקריטי ביותר בassay מאפשר חלקיקים המגנטיים לערבב עם המדגם והבדיקה. בצלחת ELISA 96-היטב, מולקולות ביולוגיות וחומרים כימיים להגיע לשיווי משקל עם המשטח דו ממדים של תחתית הבאר. יש חלקיקים מגנטיים הנטייה להתיישב מחוץ לפתרון בשל הליבה שלהם הצפופה תחמוצת ברזל, שתפחית את אתרי קישור הזמינים. כך, החלקיקים חייבים להיות מעורבים בזמן assay כדי להבטיח מקסימאלי מחייב.

בעת תכנון מגיב לאבחון מחלה, יש לזכור צורה של מדגם מטופל, כמו גם את הריכוז הפיזיולוגי של הסמן הביולוגי. למלריה, הריכוז של PF HRP-השני בדם של חולה יכול להשתנות מpicomolar הנמוך עד גבוה של ננו-מולר. בעוד assay זה רלוונטי מבחינה קלינית לרמות גבוהות יותר של זיהום, המגבלה של זיהוי צריכה להיות משופרת על מנת לזהות חולים ללא תסמינים עם picomolar הנמוך במחזור PF HRP-השני. בשיטות שתוארו לעיל, "לעבור על" אות שנוצרה על ידי Ir1 מתרחשת בנוכחות של היסטידין. בעוד הסמן הביולוגי המלריה הוא עשיר בהיסטידין, חלבונים בסרום אחרים, כגון אלבומין בסרום אדם וגליקופרוטאין העשיר היסטידין, היו לעורר תגובת אות עם החללית. זה היה בתורו יוביל לאבחון חיובי שגוי. זה הופך את לכידתו של החלבון על פני השטח של חלקיקי צעד מועיל, שבחלבון של עניין ניתן לחלץ במהירות ממדגם מטופל. בנוסף, עיצוב חללית bifunctional, שזוגות פפטיד העשיר היסטידין לאלמנט הכרה מולקולרית חזק (כלומר. Aptamer), יכול להוסיף שכבה נוספת של סגוליות לassay. הפפטיד יהיה עמוס אירידיום לפני הצימוד לaptamer. בעיצוב כזה, הבדיקה Ir1 היציבה עדיין יכולה להיות מנוצלת תוך השגת היעד ספציפי עם aptamer. זה היה מאפשר ליישום של החללית כדי לזהות HRP-השני ילידים במטריצה ​​מורכבת (כלומר. פלזמה או כל דם) ולהפחית את תופעות מחייבות שאינם ספציפיות. על מנת לשפר את האות של בדיקות אבחון מהירות יותר, assay יכול להיות משולב בתוך מערכת electrochemiluminescent (ECL), שבו ניתן לאתר PF HRP-השני בRDTs כקריאת נתונים אלקטרוכימיים 26. הבדיקה אירידיום הדור הבאה זה יהיה מאוד לשפר assay ELISA שלנו על-חרוז לגילוי של סמנים ביולוגיים למחלות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
אירידיום (III) פלורסנט בדיקה לאיתור של חלבון המלריה ביומרקר היסטידין העשיר החלבון-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter