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Chemistry

मलेरिया प्रोटीन biomarker Histidine युक्त प्रोटीन-द्वितीय की जांच के लिए इरिडियम (तृतीय) Luminescent जांच

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

यह काम एक गैर छोड़नेवाला के संश्लेषण की रूपरेखा, cyclometalated आईआर (तृतीय) परिसर, आईआर (PPy) 2 (एच 2 ओ) 2 एक histidine- करने के लिए समन्वित जब एक तेजी से, लंबे समय रहते स्फुरदीप्त संकेत प्राप्त की जाती है, जो (+ Ir1), एक चुंबकीय कण की सतह पर स्थिर प्रोटीन युक्त। Ir1 के संश्लेषण, उच्च पैदावार में, / एन पूरा हे और solvated परिसर के दो समकक्ष में आईआर (तृतीय) क्लोरो-पाट डिमर cyclometalated माता पिता के बंटवारे शामिल है। विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, संश्लेषित जांच करने के लिए कहा है जब कई अमीनो एसिड समन्वय गतिविधि के लिए जांच कर रहे थे, और केवल हिस्टडीन एक संकेत प्रतिक्रिया हासिल। BNT-द्वितीय, मलेरिया बायोमार्कर Histidine युक्त प्रोटीन द्वितीय (pfHRP II) की एक branched पेप्टाइड नकल का प्रयोग, इरीडियम जांच एचआरपी-द्वितीय का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में मान्य किया गया था। एल Histidine / Ir1 की तुलना में जब शमन प्रभाव BNT-द्वितीय / Ir1 अनुमापन में उल्लेख किया गया है, लेकिन इन steric बाधा और त्रि के लिए जिम्मेदार ठहराया गयाराज्य शमन plet। Biolayer इंटरफेरोमेट्री BNT-द्वितीय के साथ Ir1 की बातचीत की वास्तविक समय कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रणाली अनुकूलित किया गया था एक बार, जांच का उपयोग rcHRP-द्वितीय का पता लगाने की सीमा समाधान में 12.8 एनएम हो पाया था। इस प्रोटीन एक 50 माइक्रोन चुंबकीय agarose के कण की सतह पर स्थिर रहा था, पता लगाने की सीमा 14.5 एनएम था। मजबूत संकेत इस अकार्बनिक जांच की प्रतिक्रिया है, साथ ही समाधान में प्रयोग के अपने लचीलापन या एक सतह पर स्थिर, नैदानिक ​​उपयोग से इमेजिंग के लिए आवेदनों की एक किस्म की ओर ही उधार कर सकते हैं।

Introduction

वर्णमिति और फ्लोरोसेंट लेबलिंग जैव रासायनिक अणुओं का पता लगाने और ट्रैकिंग के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है और 1,2 संसाधित करता है। सबसे आम फ्लोरोसेंट मार्करों कम आणविक भार कार्बनिक रंजक 3,4 रहे हैं, लेकिन इन अणुओं हमेशा आदर्श ऑप्टिकल गुण नहीं है। फ्लोरोसेंट रंजक अक्सर छोटे स्टोक्स पारियों है, और अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा हो सकता है, photobleaching से ग्रस्त हैं। वर्णमिति लेबलिंग अक्सर Immunoassay मात्रा का ठहराव 5,6 में उपयोगी एक प्रवर्धित संकेत है जो एंजाइमी लेबल, के उपयोग से हासिल की है। ये एंजाइम भी photosensitivity, स्थितियों की प्रतिक्रिया है, और कम सब्सट्रेट शेल्फ जीवन सहित अपनी कमियां हैं। इन गुणों महंगा अभिकर्मकों का उपयोग कर अच्छी तरह से नियंत्रित शर्तों के तहत किया जा करने के लिए immunoassays और प्रोटीन लेबलिंग विधियों की आवश्यकता होती हैं।

छोड़नेवाला संक्रमण धातु परिसरों एक वैकल्पिक लेबलिंग दृष्टिकोण के लिए के रूप पता लगाया गया हैजैव रासायनिक पता लगाने आर। विशेष रूप से, (तृतीय), 7-9 ऑक्सीजन 10 संवेदन कार्बनिक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (OLEDs) के संदर्भ में अध्ययन 11 कटैलिसीस, और प्रोटीन / सेल 12-14 धुंधला कर दिया गया है आईआर cyclometalated। उच्च photostability और क्वांटम दक्षता जांच के इस वर्ग बायोमोलिक्यूल पता लगाने 15,16 के लिए एक अच्छे उम्मीदवार बनाने के। यह पहले से फार्म की, (iii) परिसरों आईआर cyclometalated पाया गया कि [आईआर (सी ^ एन) 2 (Solv) 2], अचल हिस्टडीन बाँध और एक नीली-हरी झंडी प्रतिक्रिया 12,17 प्रकाश में लाना। इन परिसरों solvento राज्य में गैर-छोड़नेवाला हैं, लेकिन हिस्टडीन विलायक अणुओं से हटाता है और धातु केंद्र को बांधता है, वे लंबी लहर पराबैंगनी विकिरण के बाद एक गहन स्फुरदीप्त संकेत जारी है। यह संकेत केवल ligand के प्रतिस्थापन के बाद होता है, और धातु ligand के चार्ज हस्तांतरण के सक्रियण के माध्यम से जमीन राज्य के लिए आराम एक triplet राज्य इलेक्ट्रॉन के परिणाम (3 एमएल हैसीटी) और ligand केन्द्रित हस्तांतरण (3 नियंत्रण रेखा) 8,15 रास्ते। इन परिसरों संभावित हिस्टिडीन युक्त प्रोटीन के लिए पता लगाने के जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

हिस्टडीन युक्त प्रोटीन और उनके विनियमन के स्तर को लीवर सिरोसिस, कैंसर, और thrombic विकारों सहित कई रोगों में महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से 18 प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम Histidine युक्त प्रोटीन द्वितीय (pfHRP II) मलेरिया परजीवी के संक्रमण के लिए एक अच्छी तरह से मान्य बायोमार्कर है। इस प्रोटीन ज्यादातर विशेषता AHHAHHAAD दोहरा रूपांकनों 19 के भीतर, 67 केडीए है और 34% हिस्टिडीन होता है। ये हिस्टडीन दोहराता मुक्त धातु आयनों 19 बाध्य कर सकते हैं और हीम मेजबान खून में 20 परिसरों। pfHRP-द्वितीय सामान्यतः immunochromatographic तेजी नैदानिक ​​परीक्षण (RDTs) का उपयोग कम संसाधन सेटिंग में पाया जाता है, लेकिन इन परीक्षणों के कारण नमूना स्थिति, कम बायोमार्कर एकाग्रता, गरीब विनिर्माण मानकों, और एंटीबॉडी गिरावट 21 को अक्सर गलत कर रहे हैं।

2 (एच 2 ओ) 2] (+ Ir1) BNT-द्वितीय, 22 का पता लगाया है pfHRP-द्वितीय की एक branched पेप्टाइड नकल पता लगाने के लिए। इस बातचीत के कैनेटीक्स biolayer इंटरफेरोमेट्री तकनीक का उपयोग कर वास्तविक समय में निगरानी की गई। परख भी पता लगाने की nanomolar सीमा प्राप्त किया गया है, जहां एक ऑन-मनका एलिसा प्रकार प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया गया। यह बजाय 4-5 घंटा और ठेठ ELISAs के साथ आवश्यक जैविक अभिकर्मकों की, एंटीबॉडी से मुक्त अभिकर्मकों के साथ 2 घंटे के तहत में किया जा सकता है क्योंकि यह परख परंपरागत ELISAs से अधिक लाभ रखती है।

Protocol

1. इरिडियम का संश्लेषण (तृतीय) परिसर

  1. [2 -Cl आईआर (PPy)] 2 के 53.6 मिलीग्राम (50 μmol) वजन और क्लोराइड के 5 मिलीलीटर में भंग। एक हलचल पट्टी के साथ सुसज्जित एक 50 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए इस समाधान जोड़ें।
  2. AgOTf के 26.2 मिलीग्राम (100 μmol) वजन और मेथनॉल के 5 मिलीलीटर में भंग।
  3. भंग करने के लिए AgOTf [आईआर (PPy) 2 -Cl] 2 समाधान जोड़ें और 1 घंटे के लिए हलचल।
    नोट: एक क्रीम रंग घोल परिणाम चाहिए।
  4. 1 घंटे बाद, एक 25 X 95 मिमी घूंट शीशी में सिलिका जेल के माध्यम से घोल फिल्टर और एक रोटरी बाष्पीकरण (5-10 मिनट) का उपयोग करते हुए शेष विलायक बंद लुप्त हो जाना।
  5. विलायक के सबसे निकाले जाने के बाद, एक तेल का पीला अवशेषों शीशी में रहता है कि जाँच करें। इस अवशेषों करने के लिए, उत्पाद फिर से भंग करने और पीले रंग की ठोस उत्पाद उपज के लिए 1-2 दिनों lyophilize मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. <एच द्वारा आईआर (PPy) 2 (एच 2 ओ) 2 + उत्पाद (Ir1) विशेषताएँसमर्थन> 1 एनएमआर, ईएसआई और यूवी विज़ (CDCl 3) पहले से वर्णित के रूप में। 23

विभिन्न अमीनो एसिड के साथ Ir1 2. सहभागिता

  1. मेथनॉल में Ir1 के 2 मिमी समाधान (मेगावाट 537.10 छ / मोल) तैयार करें। भंवर ठोस का पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए।
  2. HEPES में निम्नलिखित अमीनो एसिड और biomolecules के 100 माइक्रोन समाधान उनकी, इले, लिस, सर्विसेज, वैल का प्रयास करें खारा (HBS, 100 मिमी HEPES, 137 मिमी NaCl, पीएच 7.4) अला, एएसपी, Cys, बफर तैयार करें।
  3. एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अमीनो एसिड के 100 μl पिपेट। एक खाली के रूप में सेवा करने के लिए थाली को जोड़ने के 100 μl जोड़ें।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए 2 मिमी Ir1 समाधान के 2.5 μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर थाली हिला।
  5. 10 मिनट के बाद, एक 96 अच्छी तरह से थाली पाठक (365 पूर्व / 400-700 उन्हें) का उपयोग कर नमूने के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण।
    1. साधन में थाली प्लेस और एक नया प्रयोग स्थापित करने के लिए प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर खुला।
    2. नई ऍक्स्प सेटeriment 365 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और शीर्ष स्थिति में प्रकाशिकी के साथ 9 एनएम के एक भट्ठा चौड़ाई के साथ एक प्रतिदीप्ति स्कैन पढ़ने के लिए।
    3. 5 एनएम के एक कदम के आकार के साथ 300-700 एनएम से उत्सर्जन पढ़ें।
    4. डेटा विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करें।
  6. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से थाली और छवि के लिए एक यूवी transilluminator का उपयोग कर उत्सर्जन नमूने स्थानांतरण।

BNT-द्वितीय के साथ Ir1 3. अनुमापन

  1. HBS में BNT-द्वितीय (मेगावाट 8233.6 जी / मोल) के एक 1 मिमी शेयर समाधान के रूप में अच्छी तरह से मेथनॉल में Ir1 की एक 2 मिमी समाधान तैयार है।
  2. शेयर समाधान से, जोड़ने में 100 माइक्रोन BNT-द्वितीय के 1 मिलीलीटर तैयार करते हैं। नमूना मिश्रित है सुनिश्चित करने के लिए microcentrifuge ट्यूब भंवर।
  3. Serially 1.56 माइक्रोन BNT-द्वितीय के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ने में आधे से 100 माइक्रोन BNT-द्वितीय पतला।
  4. HBS एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए, एक खाली के रूप में सेवारत के साथ, तीन प्रतियों में, प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl जोड़ें। प्रत्येक नमूने के लिए, 2 मिमी Ir1 के 2.5 μl जोड़ें।
  5. श्रीएक थाली प्रकार के बरतन पर 10 मिनट के लिए थाली ake।
  6. मिलाने के बाद, एक 96 अच्छी तरह से थाली रीडर का उपयोग कर 510 एनएम (365 एनएम पर उत्तेजना) में उत्सर्जन तीव्रता पढ़ें।
    1. साधन में थाली प्लेस और एक नया प्रयोग स्थापित करने के लिए प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर खुला।
    2. 510 एनएम के 365 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक प्रतिदीप्ति समापन बिंदु को पढ़ने के लिए नया प्रयोग निर्धारित करें। शीर्ष स्थिति में प्रकाशिकी के साथ, 9nm करने के लिए दोनों तरंग दैर्ध्य के लिए भट्ठा चौड़ाई सेट करें।
    3. थाली पढ़ें और विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात।
  7. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से थाली और छवि के लिए एक यूवी transilluminator का उपयोग कर अनुमापन नमूने स्थानांतरण।

Biolayer इंटरफेरोमेट्री का प्रयोग Ir1 / BNT-द्वितीय प्रणाली 4. वास्तविक समय काइनेटिक एनालिसिस

  1. गतिज बफर के 200 μl जोड़ें, एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के पहले कॉलम में 8 कुओं को (केबी 1x फॉस्फेट 0.02% बीच-20 के साथ खारा बफर) और प्लास्टिक सेंसर में थाली डालनेधारक। ध्यान सुझावों बफर के कुओं में निलंबित कर रहे हैं कि इस तरह के प्लास्टिक धारक में प्रथम स्तंभ 8 नी (द्वितीय) NTA के biosensors के हस्तांतरण। इंटरफेरोमेट्री साधन के बाईं ओर में प्लास्टिक धारक रखें।
  2. KB में BNT-द्वितीय की एक 0.5 माइक्रोन समाधान के 2 मिलीलीटर तैयार करें।
  3. KB में Ir1 के 10 माइक्रोन समाधान के 500 μl तैयार करें, और क्रमानुसार KB में 0.156 माइक्रोन से नीचे आधे से पतला।
  4. एक नए काले 96 अच्छी तरह से थाली, पिपेट स्तंभ ए और सी में सभी 8 कुओं को केबी के 200 μl करने के लिए
  5. एक ही थाली में, स्तंभ बी में वेल्स को 0.5μM BNT-द्वितीय समाधान की पिपेट 200 μl
  6. पिपेट अच्छी तरह से डी 1 में रिक्त केबी के साथ शुरू स्तंभ डी में Ir1 में से प्रत्येक के कमजोर पड़ने के 200 μl। कुओं स्तंभ नीचे Ir1 एकाग्रता में वृद्धि इतना है कि इस dilutions जोड़ें।
  7. पूर्व गीला सेंसर युक्त थाली के अधिकार के लिए साधन में इस प्लेट रखें।
  8. Biolayer इंटरफेरोमेट्री सॉफ्टवेयर में, एक बुनियादी kinet की स्थापनाथाली, परख, और सेंसर सुझावों को परिभाषित द्वारा आईसी प्रयोग।
    1. थाली को परिभाषित करने के लिए, स्क्रीन पर एक स्तंभ का चयन सही क्लिक करें, और कुओं के लिए उपयुक्त परिभाषा का चयन करें। स्तंभ डी के लिए स्तंभ B के लिए कॉलम ए और सी के लिए 'बफर "," लोड ", और" नमूना "का चयन करें
    2. ("जोड़ें" पर क्लिक करें) निम्न चरणों जोड़कर अगले टैब में परख परिभाषित करें: संतुलन (कस्टम), 60 सेकंड; लोड हो रहा है 120 सेकंड; बेसलाइन, 60 सेकंड; एसोसिएशन, 120 सेकंड; और पृथक्करण, 300 सेकंड। संतुलन कदम का चयन करें और (स्तंभ बी), बेसलाइन (स्तंभ सी), एसोसिएशन (स्तंभ डी), और पृथक्करण (स्तंभ सी) लोड करने के लिए स्तंभ ए दोहराने पर डबल क्लिक करें। नी (द्वितीय) NTA के सेंसर का चयन करें।
    3. अगले टैब पर ले जाएं और सेंसरों प्लास्टिक सेंसर धारक पर स्तंभ A में हैं पुष्टि।
    4. एक फ़ाइल नाम डालें, प्रयोग सही ढंग से रेखांकित किया है की पुष्टि "देरी प्रयोग" जाँच की है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, और प्रेस "जाओ।"
      एनOTE: गतिज प्रयोग उल्लिखित है एक बार क्रमादेशित साधन के स्वचालित प्रकृति के कारण,, कदम घटित होगा।
  9. गतिज रन पूरा हो गया है एक बार, बशर्ते संसाधन सॉफ्टवेयर में डेटा की प्रक्रिया।
    1. बाईं तरफ के पैनल के नीचे के हिस्से में ब्याज की फ़ाइल नाम के साथ फ़ोल्डर पर डबल क्लिक करें। फिर, पैनल के शीर्ष भाग में "काइनेटिक्स 'के तहत इसी फ़ोल्डर डबल क्लिक करें। प्रसंस्करण टैब पर ले जाएं।
    2. सेंसर चयन स्क्रीन खोलने के लिए छोड़ दिया पर घटाव बॉक्स को चेक करें। सही अच्छी तरह से ए 4 पर क्लिक करें और संदर्भ खैर अच्छी तरह से करने प्रकार बदल जाते हैं।
    3. वाई अक्ष संरेखित करने के लिए अगले बॉक्स को चेक करें, और चयनित कदम बेसलाइन है सुनिश्चित करते हैं। आधारभूत के अंतिम पाँच सेकंड (लगभग 55-60 सेकंड) होने के लिए समय सीमा निर्दिष्ट।
    4. इंटर-कदम सुधार के लिए बॉक्स को चेक करें और पृथक्करण के लिए पंक्ति का चयन करें। Savitzky-Golay छनन बॉक्स की जाँच की और प्रेस "प्रक्रिया डेटा है कि सुनिश्चित! ̶1;
    5. विश्लेषण टैब पर ले जाएं। "संघ और पृथक्करण" का विश्लेषण करने के लिए कदम के लिए और मॉडल 1 है कि चयन सुनिश्चित करें कि: 1। एक स्थानीय, पूर्ण रूप से फिट का चयन करें और प्रेस "फ़िट घटता!"
    6. तालिका में सभी घटता हाइलाइट करें और सही एक रंग करने के लिए सभी घटता सेट करने के लिए क्लिक करें। अगला, रंग और Rmax संवेदक द्वारा अनलिंक द्वारा वर्गीकृत किया है एक ग्लोबल (यूके) से फिट है, का चयन करें। प्रेस "फ़िट घटता!" वैश्विक कैनेटीक्स डेटा प्राप्त करने के लिए।

5. ऑन मनका Ir1 साथ BNT-द्वितीय का पता लगाने और rcHRP-द्वितीय

  1. 1 मिलीलीटर बीच के साथ जोड़ने में BNT-द्वितीय और rcHRP-द्वितीय की एक 1 माइक्रोन समाधान के प्रत्येक तैयार (HBST; जोड़ने 0.025% बीच 20) के साथ।
  2. Serially 15.6 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए HBST में आधे से प्रत्येक प्रोटीन पतला।
  3. पिपेट सर्वोच्च एकाग्रता नीचे एक स्तंभ के लिए सबसे कम से क्रम में dilutions के साथ एक सफेद 96 अच्छी तरह से थाली में तीन प्रतियों में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl,।
  4. पिपेट 50 माइक्रोन नी के 10 μl (द्वितीयअच्छी तरह से प्रत्येक कमजोर पड़ने में) NTA के चुंबकीय agarose के कणों।
    1. निलंबित कणों रहना सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक pipetting के बाद चुंबकीय कणों से युक्त microcentrifuge ट्यूब भंवर।
  5. 15 मिनट के कणों के साथ नमूने सेते के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर थाली रखें।
  6. इस ऊष्मायन अवधि के बाद, एक 96 अच्छी तरह से थाली चुंबक पर थाली प्लेस और कणों के समाधान से बाहर खींचने के लिए 30 सेकंड प्रतीक्षा करें।
  7. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, मूल नमूना बंद खींचने के लिए और अपशिष्ट के रूप में त्यागें। चुंबक से थाली निकालें।
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए HBST के 200 μl जोड़ें। चुंबकीय कणों को धोने के लिए ऊपर और नीचे कई बार बफर पम्प।
  9. वापस चुंबक पर थाली प्लेस और कणों के समाधान से बाहर खींचने के लिए 30 सेकंड प्रतीक्षा करें।
  10. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, बफर के 200 μl बंद खींचने के लिए और अपशिष्ट के रूप में त्यागें। चुंबक से थाली निकालें।
  11. दोहराएँ 5.8 throug के कदमोंएच 5.10 दो बार कणों की तीन धोने पूरा करने के लिए।
  12. 2 मिमी Ir1 के 2.5 μl द्वारा पीछा प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त चुंबकीय कणों को HBST के 100 μl जोड़ें।
  13. 1 घंटे के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर Ir1 साथ कणों को सेते हैं।
  14. 1 घंटे बाद, एक 96 अच्छी तरह से थाली रीडर का उपयोग कर 510 एनएम (365 एनएम पर उत्तेजना) में उत्सर्जन तीव्रता पढ़ें।
    1. साधन में थाली प्लेस और एक नया प्रयोग स्थापित करने के लिए प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर खुला।
    2. 510 एनएम के 365 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक प्रतिदीप्ति समापन बिंदु को पढ़ने के लिए नया प्रयोग निर्धारित करें। शीर्ष स्थिति में प्रकाशिकी के साथ, 9 एनएम के लिए दोनों तरंग दैर्ध्य के लिए भट्ठा चौड़ाई सेट करें।
    3. थाली पढ़ें और विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात।
  15. एक स्पष्ट 96 अच्छी तरह से थाली और छवि के लिए एक यूवी transilluminator का उपयोग कर अनुमापन नमूने स्थानांतरण।

Representative Results

चित्रा 1, धातु केंद्र के लिए अघुलनशील AgCl के रूप में क्लोराइड की तेज़ी से माता-पिता डिमर में क्लोराइड पुल के Ir1 solvento जटिल शामिल बंटवारे के संश्लेषण और पानी के अणुओं की एसोसिएशन में दिखाया गया है। Ir1 के गठन एच 1 एनएमआर और ईएसआई द्वारा पुष्टि की गई। 365 एनएम पर उत्साहित साथ ही, जब धातु ligand के चार्ज हस्तांतरण की विशेषता यूवी दृश्य बैंड और π-π * संक्रमण आगे Ir1 के गठन को मान्य, स्पेक्ट्रम को सौंपा गया। इस परिसर में प्रदर्शन कोई छोड़नेवाला चरित्र solvated।


चित्र 1
चित्रा 1:। के Ir1 Dichlorotetrakis (2 (2-pyridinyl) फिनाइल) की क्लोराइड पुल बंटवारे प्रतिक्रिया संश्लेषण और लक्षण वर्णन diiridium (तृतीय) aquo जटिल आईआर बनाने के लिए (PPy) 2 (एच 2 ओ) 2 (+ Ir1)। के अलावा पर एल उनकी जलीय बफर में aquo जटिल करने के लिए, luminescent के संकेत पर बंद है।

जटिल संश्लेषित और विशेषता थी एक बार पहले एक समान Iridium एनालॉग 17 का उपयोग कर के रूप में वर्णित, अमीनो एसिड चयनात्मकता, विश्लेषण किया गया था। 2A चित्रा 365 एनएम पर उत्साहित जब केवल हिस्टडीन, 510 एनएम पर एक संकेत प्रतिक्रिया हासिल है कि पता चलता है।


चित्र 2
चित्रा 2: एमिनो एसिड चयनात्मकता और Histidine रिच पेप्टाइड्स के साथ Ir1 की अनुमापन (ए) 50 माइक्रोन के साथ विभिन्न अमीनो एसिड (Cys, सेवाओं, एएसपी, ग्लू, पीएचई, लिस, Arg, Tyr, टीआरपी, उनकी) के 200 माइक्रोन की बातचीत। HBS में Ir1। स्पेक्ट्रल स्कैन एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली में 365 एनएम के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में 400-700 एनएम से लिया गया था। सभी एमिनो एसिड बी से रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों में सिग्नल (RFU)esides हिस्टडीन (धराशायी काला ट्रेस) नगण्य था। BNT-द्वितीय (▪) और rcHRP-द्वितीय (♦) (बी) nanomolar सांद्रता जोड़ने में Ir1 साथ titrated गया। हिस्टडीन अमीर पेप्टाइड्स 365 एनएम प्रकाश के साथ उत्तेजना के बाद 510 एनएम पर उत्सर्जन पढ़ने से पहले समाधान में 15 मिनट के लिए जांच के साथ incubated रहे थे। पता लगाने की सीमा Y 3σ रिक्त = जब एक्स के मूल्य के रूप में गणना की गई।

हिस्टडीन समन्वित है जब आईआर के स्वेटर उत्साहित राज्य (1 MLCT / 1 नियंत्रण रेखा) (iii) bioconjugate त्रिक उत्साहित राज्य (3 MLCT), के लिए intersystem क्रासिंग से होकर गुजरती है, क्योंकि इरिडियम जांच के स्फुरदीप्ति के इस "पर स्विच" होता है धातु के केंद्र के लिए। यह जांच BNT-द्वितीय को प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम Histidine युक्त प्रोटीन द्वितीय (एचआरपी-द्वितीय पीएफ) मलेरिया बायोमार्कर की नकल एक पेप्टाइड लागू किया गया था। Ir1 साथ BNT-द्वितीय की एक अनुमापन में, एक एकाग्रता निर्भर संकेत प्रतिक्रिया मनाया गया ( डी एक नी (द्वितीय) NTA के सतह पर स्थिर 2.05 माइक्रोन (चित्रा 3) हो पाया था।

चित्रा 4

चित्रा 3:। एक नी (द्वितीय) NTA के कांच सेंसर की सतह पर BNT-द्वितीय के लिए बाध्य Ir1 के विभिन्न सांद्रता की गतिज विश्लेषण के लिए BNT-द्वितीय Biolayer इंटरफेरोमेट्री साथ Ir1 की वास्तविक समय काइनेटिक एनालिसिस। केबी (क्षेत्र) में सेंसर equilibrating के बाद, सेंसर 0.5 माइक्रोन BNT-द्वितीय (क्षेत्र ख) के साथ लोड कर रहे हैं। पेप्टाइड सेंसर पर लोड किया जाता है एक बार, एक आधारभूत पूर्व BNT-द्वितीय (रीजन डी) के लिए Ir1 की एसोसिएशन को मापने के लिए (क्षेत्र सी) की स्थापना की है। के बादएसोसिएशन की अवधि, सेंसर हदबंदी (क्षेत्र ई) को मापने के लिए केबी में वापस रखा जाता है। पूरे गतिज विश्लेषण की प्रक्रिया कम से कम 30 मिनट लगते हैं।

एक चुंबकीय कण मंच करने के लिए एक समाधान आधारित परख से परिवर्तित करता है, सिस्टम में कण का जोड़ा जटिलता को ध्यान में रखा जाना था। के रूप में देखा यह, ऊपर का वर्णन 24 काले फ्लोरोसेंट प्लेटों समाधान परख के लिए अच्छी तरह से काम किया। इन कणों को कुशलता से मलेरिया बायोमार्कर पीएफ एचआरपी-द्वितीय कि बाँध, पिछले काम से जाना जाता है, लेकिन सफेद प्लेट पर-कण का पता लगाने मंच के लिए बेहतर अनुकूल थे चित्रा -4 ए। एक सफेद प्लेट में, प्रकाश इस प्रकार के कण की सतह के लिए बाध्य Ir1 से बेहतर absorbance के लिए अनुमति देता है, वापस नमूना में दिखाई देता है। पर-कण परख में, rcHRP-द्वितीय का पता लगाने की सीमा 14.5 एनएम (चित्रा 4 बी) होने के लिए निर्धारित किया गया था। rcHRP-II के लिए पता लगाने की सीमा समाधान में और पर-मनका statis थेएक unpaired टी परीक्षण (पी = .731) के आधार पर एक ही tically।

चित्रा 5
चित्रा 5


चित्रा 4:। एक काले रंग में 50 माइक्रोन नी की सतह पर BNT-द्वितीय के लिए बाध्य Ir1 से पता चला संकेत के बीच चल-मनका BNT-द्वितीय और एचआरपी-द्वितीय की जांच (ए) के अंतर (द्वितीय) NTA के चुंबकीय agarose के कणों 96- अच्छी तरह से एक सफेद 96 अच्छी तरह से थाली (धराशायी लाइन) बनाम प्लेट (ठोस लाइन)। कणों 365 एनएम प्रकाश के साथ उत्साहित थे, और उत्सर्जन 510 एनएम पर मापा गया था। RcHRP-द्वितीय (बी) अनुमापन चुंबकीय कणों पर स्थिर और Ir1 उपयोग करते हुए पाया। पता लगाने की सीमा VA के रूप में गणना की गईएक्स के lue Y 3σ रिक्त = जब।

चित्रा 5

चित्रा 5: Ir1 साथ rcHRP-द्वितीय की आन-मनका पता लगाने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व नी (द्वितीय) NTA के कणों और Ir1 के साथ लेबल की सतह के लिए बाध्य एचआरपी-द्वितीय की सामान्य योजना।। कणों 15 मिनट के लिए एक हिस्टडीन अमीर पेप्टाइड के साथ incubated हैं। इस ऊष्मायन अवधि के बाद, कणों HBST समाधान के बाहर कणों खींचने के क्रम में, एक चुंबक का उपयोग के साथ धो रहे हैं। अंत में, पेप्टाइड बाध्य कणों से पहले 365 एनएम प्रकाश के साथ उत्तेजना के बाद 510 एनएम पर उत्सर्जन पढ़ने के लिए 1 घंटे के लिए Ir1 साथ incubated हैं।

Discussion

Microparticle आधारित नैदानिक ​​उपकरण आधुनिक निदान तकनीक के आगे के लिए आते हैं, सीधे कण की सतह पर लक्ष्य के biomolecules का पता लगाने के लिए एक बड़ा फायदा है। ऐसे एलिसा और पीसीआर के रूप में पारंपरिक आणविक तरीकों का पता लगाने में है कि वे पता लगाने के 25 में से बहुत कम सीमा प्राप्त कर सकते हैं, फायदेमंद हैं। हालांकि, इन assays व्यापक अभिकर्मकों और लंबा प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यह परख समय और अभिकर्मक आवश्यकताओं (चित्रा 5) के बिना एलिसा प्रकार सैंडविच बातचीत की नकल करने के लिए डिजाइन किया गया था। एक ठेठ एलिसा के लिए एंटीबॉडी की लागत नमूना प्रति $ 0.20-0.30 है जबकि इसके अतिरिक्त, नमूना प्रति Ir1 जांच की लागत, एक पैसा के आसपास होने का अनुमान था।

ऊपर वर्णित विधि मलेरिया बायोमार्कर का पता लगाने के लिए एक cyclometalated इरिडियम जांच पर भरोसा करते हैं के बाद से, इस जांच को अन्य तरीकों का पता लगाने के लिए आम विफलता मोड (यानी। फ्लोरोफोरे quenchi के लिए अतिसंवेदनशील नहीं होगाएनजी और एंटीबॉडी / एंजाइम गिरावट)। Histidine इसकी धातु बाइंडिंग गुण आप में अनूठा है। उल्लिखित काम धातु युक्त परिसरों के साथ एक ठेठ एलिसा सैंडविच में एंटीबॉडी की जगह द्वारा इस घटना का फायदा उठाते हैं। नी (द्वितीय) NTA के कण की सतह पर rcHRP-द्वितीय कब्जा है और Ir1 प्रोटीन की उपस्थिति का संकेत है। परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम चुंबकीय कणों नमूना है और जांच के साथ मिश्रण करने की अनुमति है। एक 96 अच्छी तरह से थाली एलिसा में, biomolecules और अभिकर्मकों अच्छी तरह से नीचे की दो-आयामी सतह के साथ संतुलन तक पहुँचने। चुंबकीय कणों की वजह से उपलब्ध बाध्यकारी साइटों को कम करेगा जो उनके घने लोहे के आक्साइड कोर, का हल के बाहर समझौता करने की प्रवृत्ति है। इस प्रकार, कणों अधिक से अधिक बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए परख समय के दौरान मिश्रित किया जाना चाहिए।

रोग निदान के लिए एक अभिकर्मक डिजाइनिंग, एक मन में रोगी के नमूने के रूप के रूप में अच्छी तरह से बायोमार्कर की शारीरिक एकाग्रता रखना चाहिए। के लिएमलेरिया, एक रोगी के रक्त में पीएफ एचआरपी-द्वितीय की एकाग्रता उच्च nanomolar को कम picomolar से भिन्न हो सकती हैं। इस परख संक्रमण के उच्च स्तर के लिए नैदानिक ​​प्रासंगिक है, पता लगाने की सीमा कम picomolar एचआरपी-द्वितीय पीएफ परिसंचारी साथ स्पर्शोन्मुख रोगियों का पता लगाने के क्रम में सुधार की जरूरत है। ऊपर उल्लिखित तरीकों, में "स्विच" पर Ir1 द्वारा उत्पन्न संकेत हिस्टडीन की उपस्थिति में होता है। मलेरिया बायोमार्कर हिस्टिडीन में समृद्ध है, वहीं इस तरह के मानव सीरम albumin और हिस्टडीन अमीर ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में अन्य सीरम प्रोटीन, जांच के साथ एक संकेत प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना होगा। यह बदले में झूठी सकारात्मक निदान के लिए नेतृत्व करेंगे। यह एक लाभकारी कदम है, उस में ब्याज की प्रोटीन तेजी से एक मरीज के नमूने से निकाला जा सकता है कण की सतह पर प्रोटीन का कब्जा बना देता है। इसके अतिरिक्त, एक bifunctional जांच, डिजाइन एक मजबूत आणविक मान्यता तत्व करने के लिए जोड़ों के लिए एक हिस्टडीन अमीर पेप्टाइड (अर्थात। Aptamer कि), परख करने के लिए विशिष्टता की एक और परत जोड़ सकते हैं। पेप्टाइड aptamer करने के लिए युग्मन से पहले इरीडियम के साथ लोड किया जाएगा। Aptamer के साथ लक्ष्य विशिष्टता प्राप्त करने, जबकि इस तरह के एक डिजाइन में, स्थिर Ir1 जांच अभी भी उपयोग किया जा सकता है। यह एक जटिल मैट्रिक्स (अर्थात। प्लाज्मा या पूरे रक्त) में देशी एचआरपी-द्वितीय का पता लगाने और गैर विशिष्ट बंधन प्रभाव को कम करने के लिए जांच के आवेदन के लिए अनुमति होगी। आगे तेजी नैदानिक ​​परीक्षण के संकेत को बढ़ाने के क्रम में, परख पीएफ एचआरपी-मैं-मैं एक विद्युत readout के 26 के रूप में RDTs पर पता लगाया जा सकता है, जहां एक electrochemiluminescent (ईसीएल) प्रणाली है, में शामिल किया जा सकता है। यह अगली पीढ़ी इरिडियम जांच बहुत रोग बायोमार्कर का पता लगाने के लिए हमारे पर मनका एलिसा परख में वृद्धि होगी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

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References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
मलेरिया प्रोटीन biomarker Histidine युक्त प्रोटीन-द्वितीय की जांच के लिए इरिडियम (तृतीय) Luminescent जांच
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Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

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