Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Иридиум (III), люминесцентные зонд для обнаружения малярийных белка биомаркеров гистидин богатые белком-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Эта работа иллюстрирует синтез без эмиссионного, cyclometalated Ir (III), комплекс, Ir (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), который вызывает быстрое, долгоживущий сигнал фосфоресцирующие, когда согласованы с histidine- белок, содержащий иммобилизованные на поверхности магнитной частицы. Синтез IR1, с высокими выходами, полна O / N и включает расщепление материнской cyclometalated Ir (III), хлор мостиком димеров в двух эквивалентов сольватированной комплекса. Чтобы подтвердить специфичность, несколько аминокислот были исследованы для координации активности при добавлении к синтезированной пробы, и только гистидин вызвало отклик сигнала. Использование BNT-II, разветвленную пептид подражанием малярийного биомаркеров гистидин богатые белком II (pfHRP-II), иридий зонд был утвержден в качестве инструмента для обнаружения HRP-II. Тушение эффекты были отмечены в титрования БНТ-II / Ir1 по сравнению с L-гистидин / Ir1, но они были отнесены к стерических препятствий и триплет государственной тушение. Бислоя интерферометрии был использован для определения в реальном времени кинетику взаимодействия с IR1 BNT-II. После того как система была оптимизирована, предел обнаружения rcHRP-II с использованием зонда было установлено, что 12,8 нМ в растворе. При этом белок был иммобилизован на поверхности магнитного агарозном частицы 50 мкм, предел обнаружения составлял 14,5 нМ. Надежный ответный сигнал этого датчика неорганической, а также его гибкость использования в растворе или иммобилизовать на поверхности, может поддается к различным приложениям, от диагностики к визуализации.

Introduction

Колориметрический и флуоресцентные маркировки является важным методом для обнаружения и отслеживания биохимических молекул и процессов 1,2. Наиболее распространенными флуоресцентные маркеры низкомолекулярные органические красители 3,4, но эти молекулы не всегда идеальные оптические свойства. Флуоресцентные красители склонны к фотообесцвечиванию, часто имеют небольшие сдвиги Стокса, и может иметь перекрытие возбуждения и излучения. Колориметрический маркировки часто достигается путем использования ферментативных меток, которые имеют усиленный сигнал в полезную иммуноанализа количественного 5,6. Эти ферменты также имеют свои недостатки, в том числе светочувствительность, условий реакции и короткие подложки срока годности. Эти свойства, как правило, требует иммунологических и методы маркировки белков должно быть сделано в соответствии с хорошо контролируемых условиях с использованием дорогостоящих реагентов.

Эмиссионные переходных металлов комплексы были исследованы в качестве альтернативного подхода маркировки FOг биохимический обнаружения. В частности, cyclometalated Ir (III), был изучен в контексте органических светоизлучающих диодов (OLED) 7-9 кислорода зондирования 10, катализа 11, и белок / клетка окрашивания 12-14. Высокая светостойкость и квантовая эффективность делают этот класс зондов хорошим кандидатом для обнаружения биомолекул 15,16. Было установлено, что ранее cyclometalated Ir (III) комплексов, в виде [Ir (С ^ Н) 2 (Solv) 2] +, необратимо связываются гистидин и вызывают сине-зеленые отклик сигнала 12,17. Эти комплексы не являются эмиссионные в состоянии solvento, но когда гистидин вытесняет молекулы растворителя и связывается с металлическим центром, они выпускают интенсивное фосфоресцирующие сигнал после длинных волн УФ-облучения. Этот сигнал происходит только после замещения лигандов, и является результатом триплетным электрона отдыха в состоянии через активацию металла лиганда переноса заряда (3 млКТ) и лиганда центру перевод (3 LC) путей 8,15. Эти комплексы могут быть потенциально использованы в качестве зондов для обнаружения для гистидина богатой белками.

Богатую гистидином белки и их уровни регуляции важны во многих заболеваний, в том числе цирроз печени, рака и заболеваний тромбомикроангиопатия. 18 Plasmodium тропической гистидин богатые белком II (pfHRP-II), в частности, представляет собой хорошо подтверждена биомаркера для малярийного паразита инфекции. Этот белок 67 кДа и содержит 34% гистидин, в основном в пределах, характерных AHHAHHAAD повторять мотивы 19. Эти повторы гистидиновых может связывать ионы металлов бесплатно 19 и гема комплексы 20 в принимающей крови. pfHRP-II обычно обнаруживается в условиях ограниченных ресурсов с помощью Иммунохроматографические диагностических экспресс-тестов (БДТ), но эти тесты часто неточны из-за показательных условиях, низкой концентрации биомаркеров, бедных производственных стандартов, и деградации 21 антител.

2 (H 2 O) 2] + (Ir1) для обнаружения BNT-II, разветвленную пептид подражанием pfHRP-II исследуется 22. Кинетика этого взаимодействия были отслеживать в режиме реального времени с использованием методов интерферометрии бислоя. Анализ также адаптированы к по-шарик формате ELISA-типа, где были достигнуты наномолярные пределы обнаружения. Этот анализ имеет преимущества по сравнению с традиционными ИФА, поскольку она может быть выполнена в соответствии с 2 ч антител свободной реагентов, вместо 4-5 ч и биологических реагентов, необходимых с типичными ИФА.

Protocol

1. Синтез Iridium (III), комплекс

  1. Взвесить 53,6 мг (50 мкмоль) [Ir (Ppy) 2] 2 -Cl и растворяют в 5 мл метиленхлорида. Этот раствор в колбе Эрленмейера 50 мл, снабженную мешалкой.
  2. Взвесить 26,2 мг (100 мкмоль) AgOTf и растворяют в 5 мл метанола.
  3. Добавить растворенный в AgOTf [Ir (Ppy) 2 -Cl] 2 раствор и перемешивают в течение 1 часа.
    Примечание: кремовый суспензия должна привести.
  4. После 1 часа, фильтруют суспензию через силикагель в 25 х 95 мм драхмовую ампулу и выпаривают оставшийся растворитель с помощью роторного испарителя (5-10 мин).
  5. После большую часть растворителя удаляют, проверить, что желтый остаток жирной остается во флаконе. К этому остатку, добавить 1 мл метанола, чтобы повторно растворить продукт и лиофилизации 1-2 дней с получением желтого твердого продукта.
  6. Охарактеризуйте Ir (Ppy) 2 (H 2 O) 2 + продукт (Ir1) Н <SUP> 1 ЯМР (в CDCl 3), масс и UV-VIS, как описано выше. 23

2. Взаимодействие Ir1 с различными аминокислотами

  1. Приготовьте 2 мМ раствора в метаноле IR1 (MW 537,10 г / моль). Вихревой чтобы обеспечить полное растворение твердого вещества.
  2. Подготовьте 100 мкМ растворы следующих аминокислот и биомолекул в буферный раствор HEPES (HBS, 100 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, рН 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, попытайтесь, Вал.
  3. Пипетировать 100 мкл каждой аминокислоты в черном 96-луночного планшета. Добавить 100 мкл HBS к пластине, чтобы служить в качестве заготовки.
  4. Добавить 2,5 мкл 2 мМ раствора IR1 к каждому образцу и встряхнуть пластину на шейкере в течение 10 мин.
  5. Через 10 мин, приобретают спектры излучения образцов с использованием планшет-ридер 96-а (365 ЕХ / 400-700 EM).
    1. Поместите пластину в приборе и откройте программное обеспечение ридер создать новый эксперимент.
    2. Установите новый ехрeriment читать сканирование флуоресценции с длиной волны возбуждения 365 нм и шириной щели 9 нм с оптикой в ​​верхнем положении.
    3. Прочитать излучение 300-700 нм с шагом 5 нм.
    4. Экспорт данных для анализа данных.
  6. Передача образцов для четкого 96-луночного планшета и изображение излучение с помощью УФ-просвечивания.

3. Титрование Ir1 с BNT-II

  1. Подготовка 1 мМ исходный раствор BNT-II (MW 8233,6 г / моль) в HBS, а также 2 мМ раствора в метаноле IR1.
  2. Из маточного раствора, готовят 1 мл 100 мкМ BNT-II в HBS. Вихря микроцентрифужную трубку, чтобы обеспечить образец смешивают.
  3. Серийно разбавить 100 мкм BNT-II на половину в HBS до конечной концентрации 1,56 мкМ BNT-II.
  4. Добавить 100 мкл каждого разбавления в трех экземплярах, с HBS служащей в качестве заготовки, в лунки 96-луночного планшета. Для каждого образца, добавить 2,5 мкл 2 мМ IR1.
  5. Ш.аке пластины в течение 10 мин на планшетном шейкере.
  6. После встряхивания чтения интенсивность излучения при 510 нм (возбуждение при 365 нм) с использованием 96-луночного планшет-ридера.
    1. Поместите пластину в приборе и откройте программное обеспечение ридер создать новый эксперимент.
    2. Установите новый эксперимент для чтения флуоресценции конечную точку с длиной волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 510 нм. Установите ширину щели для обеих длин волн в 9nm, с оптикой в ​​верхнем положении.
    3. Читайте тарелку и экспортировать данные для анализа.
  7. Передача образцов для четкого 96-луночного планшета и изображение титрование с помощью УФ-просвечивания.

4. В режиме реального времени Кинетический анализ системы Ir1 / БНТ-II Использование бислоя интерферометрии

  1. Добавить 200 мкл буфера кинетической (КБ; 1x забуференный фосфатом физиологический раствор с 0,02% Tween-20) 8 скважин в первом столбце черного 96-луночного планшета и вставить пластину в датчик пластиковойДержатель. Тщательно передачи 8 Ni (II) NTA биосенсоров к первому столбцу в держатель пластиковой таким образом, что концы подвешены в лунки буфером. Место пластиковый держатель в левой части интерферометрии инструмента.
  2. Подготовьте 2 мл 0,5 мкМ раствора BNT-II в КБ.
  3. Подготовьте 500 мкл 10 мкМ раствора Ir1 в КБ, и серийно разбавить наполовину до 0,156 мкМ в КБ.
  4. К новому черный 96-луночный планшет, пипетки 200 мкл КБ для всех 8 скважин в колонке А и С.
  5. В том же планшете, пипеток 200 мкл 0,5 мкМ раствора BNT-II в лунки в столбце B.
  6. Внесите 200 мкл каждого разведения Ir1 в колонке D, начиная с КБ, как пробел в лунку D1. Добавьте разведениях, так что скважины увеличение концентрации IR1 вниз колонны.
  7. Поместите эту пластину в приборе с правой стороны пластины, содержащей датчики предварительного увлажнения.
  8. В программном обеспечении бислоя интерферометрии, созданы базовые KinetIC эксперимент, определив советы плита, анализ, и датчиков.
    1. Чтобы определить пластину, выберите столбец на экране, щелкните правой кнопкой мыши и выберите соответствующее определение для скважин. Выберите "Буфер" для колонок А и С, "Load" для колонки B, и «образец» для столбца D.
    2. Определите анализа в следующей вкладке, добавив следующие шаги (Нажмите кнопку "Добавить"): Уравновешивание (Custom), 60 с; Загрузка, 120 сек; Базовый, 60 сек; Ассоциация, 120 сек; и диссоциация, 300 сек. Выберите шаг равновесия и дважды щелкните на колонке А. Повторите для загрузки (столбец B), базовый (столбец С), Ассоциация (колонка D) и диссоциации (колонка C). Выберите датчиков Ni (II), NTA.
    3. Переход к следующей вкладке, и подтверждают, что датчики находятся в колонке А на держателе из пластика датчика.
    4. Подтвердите эксперимент правильно изложил, вставить имя, убедитесь, что "задержка эксперимент" проверяется, и нажмите "Перейти".
      NПРИМЕЧАНИЕ: В связи с автоматизированной характере документа, когда кинетическая эксперимент изложил, шаги будут происходить, как запрограммировано.
  9. После того, как кинетическая выполнения завершена, обрабатывать данные в прилагаемом программном обеспечении для обработки.
    1. Дважды щелкните на папке с именем интереса в нижней части панели слева. Затем дважды щелкните соответствующую папку в разделе "Кинетика" в верхней части панели. Переход к закладке Обработка.
    2. Установите флажок вычитание слева, чтобы открыть экран выбора датчика. Щелкните правой кнопкой мыши на хорошо А4 и изменить тип также ссылочного Well.
    3. Установите флажок рядом с Совместите оси Y, и убедитесь, что выбранный шаг Базовый. Укажите временной диапазон, чтобы быть последние пять сек базовой (примерно 55-60 секунд).
    4. Установите флажок для Интер-ступенчатой ​​коррекции и выберите Выровнять по диссоциации. Убедитесь, что окно Савицкого-Голея Фильтрация проверяется и нажмите "Обработка данных! ̶1;
    5. Переход к вкладке Analysis. Убедитесь, что "Ассоциация и диссоциация" является отбор шагов для анализа и модели 1: 1. Выберите Local, Полный форме и нажмите "Fit Curves"!
    6. Выделите все кривые в таблице и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы установить все кривые одного цвета. Далее, выберите Глобальный (полное) посадку, сгруппированные по цвету и Rmax Unlinked датчиком. Нажмите "Fit Curves!", Чтобы получить данные глобальные кинетики.

5. На-шарик обнаружения BNT-II и rcHRP-II с Ir1

  1. Подготовка 1 мл каждого из 1 мкМ раствора BNT-II и rcHRP-II в HBS с твин (HBST; HBS 0,025% Tween 20).
  2. Серийно разбавить каждого белка наполовину HBST до конечной концентрации 15,6 нМ.
  3. Внесите 100 мкл каждого разведения, в трех экземплярах, в белом 96-луночного планшета, с разведений в порядке от низшего к высшему концентрации вниз колонны.
  4. Внесите 10 мкл 50 мкм Ni (IIНТА) магнитные частицы агарозы в каждом разведении хорошо.
    1. Вихря микроцентрифужную трубки, содержащей магнитные частицы после каждого пипетки, чтобы гарантировать, что частицы остаются приостановлены.
  5. Поместите пластину на шейкере в течение 15 мин для инкубации образцов с частицами.
  6. После этого периода инкубации, поместите пластину на тарелке магнита 96-а и ждать 30 сек для частицы, чтобы вытащить из раствора.
  7. Используя многоканальную пипетку, снять оригинальный образец и отбросить как отходы. Снимите пластину с магнитом.
  8. Добавить 200 мкл HBST в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Насос буфер вверх и вниз несколько раз, чтобы вымыть магнитных частиц.
  9. Поместите пластину обратно на магните и ждать 30 сек для частицы, чтобы вытащить из раствора.
  10. Использование многоканальной пипетки, снять 200 мкл буфера и отбросить как отходы. Снимите пластину с магнитом.
  11. Повторите шаги 5.8 через вч 5.10 два раза, чтобы завершить три стирок частиц.
  12. Добавить 100 мкл HBST в каждую лунку содержащих магнитных частиц с последующим 2,5 мкл 2 мМ Ir1.
  13. Инкубируйте частицы с IR1 на шейкере в течение 1 часа.
  14. После 1 часа, прочитать интенсивность излучения при 510 нм (возбуждение при 365 нм) с использованием 96-луночного планшет-ридера.
    1. Поместите пластину в приборе и откройте программное обеспечение ридер создать новый эксперимент.
    2. Установите новый эксперимент для чтения флуоресценции конечную точку с длиной волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 510 нм. Установка ширины щели для обеих длин волн 9 нм, с оптикой в ​​верхнем положении.
    3. Читайте тарелку и экспортировать данные для анализа.
  15. Передача образцов для четкого 96-луночного планшета и изображение титрование с помощью УФ-просвечивания.

Representative Results

Как показано на рисунке 1, синтез IR1 solvento-комплекса, занятого расщепления хлорида моста в материнской димера путем осаждения хлорида в виде нерастворимого AgCl и ассоциации молекул воды с металлическим центром. Формирование Ir1 было подтверждено H 1 ЯМР и ESI. Кроме того, полосы УФ-видимой характерные металла лиганда переноса заряда и π-π * переходы были назначены спектра, далее проверки формирование Ir1. Это сольватированы комплекса не проявляет эмиссионную характер при возбуждении при 365 нм.


Фигура 1
Рисунок 1:. Синтез и характеристика Ir1 хлорид мост реакции расщепления Dichlorotetrakis (2- (2-пиридинил) фенил) diiridium (III), чтобы создать aquo комплекс Ir (PPY) 2 (H2O) 2 + (Ir1). При добавлении L-His к aquo комплекса в водном буфере, люминесцентные сигнал включен.

После того, как комплекс синтезированы и охарактеризованы, селективность аминокислоты анализировали, как описано выше, с использованием аналогичной иридий аналог 17. показывает, что только гистидин вызвало реакцию сигнала на длине волны 510 нм, при возбуждении при 365 нм.


Рисунок 2
Рисунок 2: Аминокислота Избирательность и титрование Ir1 с гистидина Rich пептидов () Взаимодействие 200 мкМ различных аминокислот (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) с 50 мкМ. Ir1 в HBS. Спектральные сканирует были взяты из 400-700 нм при длине волны возбуждения 365 нм в черный 96-луночный планшет. Сигнал в относительных единицах флуоресценции (РФС) из всех аминокислот бesides гистидин (пунктирная черная линия) была незначительной. Концентрации (Б) наномолярных БПТ-II (▪) и rcHRP-II (♦) титруют Ir1 в HBS. Гистидиновые богатые пептиды инкубируют с зондом в течение 15 мин в растворе перед чтением излучение на длине волны 510 нм при возбуждении 365 нм светом. Предел обнаружения была рассчитывается как величина х, когда у = 3σ пустым.

Это "на выключатель" фосфоресценции иридия зонда происходит потому, что синглет возбужденное состояние (1 MLCT / 1 ЖК) ИК (III), Bioconjugate подвергается интеркомбинационной триплетному возбужденном состоянии (3 MLCT), когда координируется гистидин с металлическим центром. Этот зонд был применен к BNT-II пептид имитировать малярийного плазмодия тропической биомаркеров гистидин богатые белком II (PF HRP-II). В титрования BNT-II с Ir1, наблюдалось зависит ответный сигнал концентрация ( Уб из Ir1 привязки к BNT-II, иммобилизованным на поверхности Ni (II), NTA было установлено, что 2,05 мкм (Рисунок 3).

Рисунок 4

Рисунок 3: в реальном времени Кинетический анализ Ir1 с БНТ-II бислоя интерферометрии для кинетического анализа различных концентраций Ir1 связывающихся с BNT-II на поверхности Ni (II), NTA датчика стекла.. После уравновешивания датчики в КБ (область), датчики загружаются с 0,5 мкМ BNT-II (область B). После того, как пептид загружен на датчики, базовый устанавливается (регион C) перед измерением ассоциацию Ir1 к BNT-II (область D). ПослеПериод объединения, датчики помещаются обратно в КБ для измерения диссоциации (область Е). Весь процесс кинетический анализ занимает менее 30 минут.

При переходе от анализа на основе раствора к платформе магнитных частиц, добавляется сложность частицы в системе должно быть принято во внимание. Было известно из предыдущей работы, что эти частицы эффективно связываются с малярией биомаркеров PF HRP-II. 24 черно флуоресцентные пластины хорошо работает для анализа раствора описано выше, но белые тарелки были лучше подходит для обнаружения платформы на-частицы, как показано на 4А. В белой пластины, свет отражается обратно в образце, что позволяет лучше поглощения по IR1, связанного с поверхностью частицы. В анализе на-частицы, предел обнаружения rcHRP-II была определена в 14,5 нМ (4В). Предел обнаружения для rcHRP-II в растворе и, по-бусинки были Statisски же на основе непарного т-теста (р = 0,731).

Рисунок 5
Рисунок 5


Рисунок 4:. On-шарик обнаружения BNT-II и HRP-II (А) разность между сигналом детектированного из IR1, связанного с BNT-II на поверхности 50 мкм Ni (II) НТА магнитные частицы агарозы в черном 96- луночный планшет (сплошная линия) в сравнении с белой 96-луночного планшета (пунктирная линия). Частицы были возбуждены с длиной волны 365 нм свет, и излучение измеряют при 510 нм. (Б) Титрование rcHRP-II, иммобилизованного на магнитных частиц и обнаружить с помощью IR1. Предел обнаружения вычисляют как ваLUE х, когда у = 3σ пустым.

Рисунок 5

Рисунок 5: Схематическое представление на-шарик обнаружения rcHRP-II с Ir1 Общая схема HRP-II связываться с поверхностью Ni (II) NTA частиц и надписью с Ir1.. Частицы инкубировали с гистидина богатой пептида в течение 15 мин. После этого периода инкубации, частицы промывают HBST с помощью магнита, для того, чтобы тянуть частиц из раствора. Наконец, пептида, связанного частицы инкубируют с IR1 в течение 1 часа перед чтением излучение на длине волны 510 нм после возбуждения с длиной волны 365 нм светом.

Discussion

Как микрочастиц на основе диагностических инструментов на первый план выходят современной диагностической технологии, обнаружение целевых биомолекул непосредственно на поверхности частицы основным преимуществом. Традиционные методы молекулярной обнаружения, такие как ELISA и ПЦР, являются предпочтительными, так как они могут достичь очень низкие пределы обнаружения 25. Тем не менее, эти анализы требуют обширных реагенты и длительные протоколы. Этот анализ был разработан, чтобы имитировать ИФА типа сэндвич взаимодействия без времени и требованиям реагентов (рисунок 5). Кроме того, стоимость зонда IR1 на образец, по оценкам, около пенни, а стоимость антител для типичного ELISA составляет $ 0,20-0,30 за образец.

Поскольку методы, описанные выше, рассчитывать на cyclometalated иридия зонда для выявления малярийного биомаркеров, этот зонд не будет подвержен отказов, общих для других методов обнаружения (т.е. флуорофора. Quenchiнг и деградация антитела / фермента). Гистидин является уникальным в его связывания свойств металла. Рассказал о работе использует этот феномен путем замены антитела в типичном ELISA бутерброд с металлическими содержащий комплексов. Ni (II) НТА захватывает rcHRP-II на поверхности частицы и Ir1 сигнализирует о присутствии белка. Наиболее важным шагом в анализе является позволяя магнитные частицы смешать с образцом и зондом. В 96-луночный планшет ELISA, биомолекулы и реагенты достижения равновесия с двумерной поверхностью дна скважины. Магнитные частицы имеют тенденцию выпадает из раствора из-за их плотного ядра оксида железа, который бы снизить доступные сайты связывания. Таким образом, частицы должны быть смешаны во время анализа для обеспечения максимального связывания.

При проектировании реагент для диагностики заболеваний, следует иметь в виду форму образца пациента, а также физиологическую концентрацию биомаркеров. Длямалярия, концентрация ОФ HRP-II в крови пациента может варьироваться от низкой до высокой пикомолярных нМ. В то время как этот анализ является клинически значимым для более высоких уровней инфекции, предел обнаружения должна быть улучшена для того, чтобы обнаружить бессимптомных пациентов с низким пикомолярных оборотных PF HRP-II. В способах, описанных выше, "включение" сигнал, генерируемый Ir1 происходит в присутствии гистидина. В то время как малярийный биомаркера богата гистидина, другие белки сыворотки, такие как альбумин сыворотки человека и гистидина богатой гликопротеина, будет вызывать ответ сигнала с датчика. Это, в свою очередь привести к ложным положительным диагнозом. Это делает захват белка на поверхности частицы полезным шагом в том, что интерес белок может быть быстро извлечены из образца пациента. Кроме того, проектирование бифункциональную зонд, что пары гистидина богатый пептид надежной элемента молекулярного распознавания (т.е.. Аптамер), Можно добавить еще один слой специфичностью анализа. Пептид будет загружен иридий перед соединением с аптамеров. При такой конструкции, устойчивым Ir1 зонд все еще может быть использован при достижении целевой специфичностью с аптамеров. Это позволит применением зонда для выявления родной HRP-II в комплексной матрицы (т.е.. Плазмы или цельной крови) и снизить неспецифическое связывание эффектов. Для того чтобы дополнительно улучшить сигнал экспресс-тестов, анализ может быть включен в электрохемилюминесцентных (ECL) системы, где PF HRP-II могут быть обнаружены на RDTs как электрохимической считывания 26. Это следующее поколение иридий зонд будет значительно улучшить нашу на-шарик ELISA анализа для обнаружения биомаркеров заболеваний.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Иридиум (III), люминесцентные зонд для обнаружения малярийных белка биомаркеров гистидин богатые белком-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter