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Chemistry

Iridium (III) luminiscentes Sonda para la detección de la proteína malaria biomarcador histidina Rich Protein-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Este trabajo describe la síntesis de un no-emisión, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), lo que provoca una señal fosforescente rápida, de larga vida cuando se coordina a una histidina que contiene proteína inmovilizada en la superficie de una partícula magnética. Síntesis de Ir1, con altos rendimientos, es completa O / N e implica la separación de los padres cyclometalated Ir (III) dímero cloro-puente en dos equivalentes del complejo solvatada. Para confirmar la especificidad, varios aminoácidos se probaron para la actividad de coordinación cuando se añade a la sonda sintetizada, y sólo histidina provocó una respuesta de la señal. Usando BNT-II, un mimético de péptido ramificado de la malaria biomarcador Histidina Rich Protein II (pfHRP-II), la sonda de iridio se validó como una herramienta para la detección de HRP-II. Se observaron efectos de enfriamiento en la titulación BNT-II / Ir1 cuando se compara con L-histidina / Ir1, pero estos se atribuyeron al impedimento estérico y triplet temple estado. Biocapa interferometría se utilizó para determinar la cinética en tiempo real de la interacción de Ir1 con BNT-II. Una vez que el sistema se ha optimizado, se encontró que el límite de detección de rcHRP-II usando la sonda a ser 12,8 nM en solución. Cuando esta proteína se inmoviliza sobre la superficie de una partícula de agarosa magnético 50 m, el límite de detección fue de 14,5 nM. La respuesta robusta de la señal de esta sonda inorgánico, así como su flexibilidad de uso en solución o inmovilizado en una superficie, puede prestarse hacia una variedad de aplicaciones, desde el uso de diagnóstico para formación de imágenes.

Introduction

Colorimétricos y etiquetado fluorescente es un método importante para la detección y el seguimiento de las moléculas bioquímicas y procesa 1,2. Los marcadores fluorescentes más comunes son colorantes orgánicos de bajo peso molecular 3,4, pero estas moléculas no siempre tienen propiedades ópticas ideales. Los tintes fluorescentes son propensos a photobleaching, a menudo tienen pequeños desplazamientos de Stokes, y puede tener la superposición de espectros de excitación y emisión. Etiquetado colorimétrica se realiza generalmente mediante el uso de marcadores enzimáticos, que tienen una señal amplificada útil en 5,6 cuantificación inmunoensayo. Estas enzimas también tienen sus inconvenientes, incluyendo fotosensibilidad, condiciones de reacción, y la vida útil sustrato corto. Estas propiedades tienden a requerir inmunoensayos y métodos de marcaje de proteínas que hacerse bajo condiciones bien controladas utilizando reactivos costosos.

Complejos de metales de transición emisivos se han explorado como un enfoque alternativo etiquetado for detección bioquímica. En particular, cyclometalated Ir (III) ha sido estudiado en el contexto de diodos emisores de luz orgánicos (OLED) 7-9 oxígeno de detección 10, 11 catálisis, y tinción de proteínas / célula 12-14. Alta fotoestabilidad y la eficiencia cuántica hacen esta clase de sondas de un buen candidato para la detección de biomolécula 15,16. Se encontró previamente que cyclometalated Ir (III), de la forma [Ir (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, irreversiblemente unen histidina y provocar una respuesta de la señal azul-verde 12,17. Estos complejos son no-emisiva en el estado solvento, pero cuando histidina desplaza las moléculas de disolvente y se une al centro de metal, liberan una señal fosforescente intensa después de la irradiación UV de onda larga. Esta señal sólo se produce después de la sustitución del ligando, y es el resultado de un estado triplete de electrones se relaja al estado fundamental a través de la activación de la transferencia de carga de ligando de metal (3 MLCT) y la transferencia centrada ligando (3 LC) Rutas 8,15. Estos complejos potencialmente pueden ser utilizados como sondas de detección para las proteínas ricas en histidina.

Proteínas ricas en histidina y sus niveles de regulación son importantes en muchas enfermedades, incluyendo la cirrosis hepática, cáncer y trastornos trombótico. 18 Plasmodium falciparum histidina Rich Protein II (pfHRP-II), en particular, es un biomarcador bien validado para la infección del parásito de la malaria. Esta proteína es de 67 kDa y contiene 34% de histidina, sobre todo dentro de AHHAHHAAD repetir motivos característicos 19. Estas repeticiones de histidina pueden unir iones metálicos libres 19 y 20 complejos de hemo en la sangre de acogida. pfHRP-II se detecta comúnmente en entornos de bajos recursos mediante las pruebas de diagnóstico rápido inmunocromatográficas (PDR), pero estas pruebas son a menudo inexactas debido a las condiciones de la muestra, la baja concentración de biomarcadores, normas de fabricación de pobres, y la degradación de anticuerpos 21.

2 (H2O) 2] + (Ir1) para detectar BNT-II, un mimético péptido ramificado de pfHRP-II se explora 22. Cinética de esta interacción fueron monitorizados en tiempo real usando técnicas de interferometría biocapa. El ensayo también fue adaptado a un formato de ELISA de tipo on-talón, donde se lograron límites nanomolares de detección. Este ensayo tiene ventajas sobre los ELISA tradicionales, ya que se puede realizar en menos de 2 horas con reactivos de anticuerpo libre, en lugar del 4-5 hr y reactivos biológicos requeridos con ELISAs típicos.

Protocol

1. Síntesis de Iridium (III) Complex

  1. Pesar 53,6 mg (50 mmol) de [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 y disolver en 5 ml de cloruro de metileno. Añadir esta solución a un matraz Erlenmeyer de 50 ml equipado con una barra agitadora.
  2. Pesar 26,2 mg (100 mol) de AgOTf y disolver en 5 ml de metanol.
  3. Añadir la AgOTf disuelto a la [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 solución y se agita durante 1 hr.
    Nota: Un color crema lechada debe resultar.
  4. Después de 1 hora, filtrar la suspensión a través de gel de sílice en un vial dram 25 x 95 mm y se evapora el disolvente restante usando un evaporador rotatorio (5-10 min).
  5. Una vez que la mayor parte del disolvente se elimina, compruebe que un residuo aceitoso amarillo permanece en el vial. A este residuo, añadir 1 ml de metanol para volver a disolver el producto y se liofiliza 1-2 días para dar el producto sólido de color amarillo.
  6. Caracterizar el Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + producto (Ir1) por H <sup> 1 RMN (en CDCl3), ESI y UV-Vis como se ha descrito previamente. 23

2. Interacciones de Ir1 con Varios Aminoácidos

  1. Preparar una solución 2 mM de Ir1 en metanol (MW 537.10 g / mol). Vortex para asegurar la disolución completa del sólido.
  2. Preparar 100 M soluciones de los siguientes aminoácidos y biomoléculas en solución salina tamponada con HEPES (HEPES HBS, 100, NaCl 137 mM, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Probar, Val.
  3. Pipetear 100 l de cada aminoácido en una placa de 96 pocillos negro. Añadir 100 l de HBS a la placa para servir como un espacio en blanco.
  4. Añadir 2,5 l de la solución 2 mM Ir1 a cada muestra y agitar la placa en un agitador de placas durante 10 min.
  5. Después de 10 min, adquirir los espectros de emisión de las muestras usando un lector de placa de 96 pocillos (365 EX / em 400-700).
    1. Colocar la placa en el instrumento y abrir el software lector de placas de establecer un nuevo experimento.
    2. Establezca la nueva experiment para leer un barrido de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 365 nm y una anchura de la rendija de 9 nm con la óptica en la posición superior.
    3. Lea la emisión de 300 a 700 nm con un tamaño de paso de 5 nm.
    4. Exportar los datos para el análisis de datos.
  6. Transferir las muestras a una placa de 96 pocillos clara y la imagen de la emisión mediante un transiluminador UV.

3. Titulación de Ir1 con BNT-II

  1. Preparar una solución madre 1 mM de BNT-II (MW 8233.6 g / mol) en HBS, así como una solución 2 mM de Ir1 en metanol.
  2. A partir de la solución madre, preparar 1 ml de 100 mM BNT-II en HBS. Vortex el tubo de microcentrífuga para asegurar que la muestra se mezcla.
  3. En serie diluir el 100 mM BNT-II por medio en HBS a una concentración final de 1,56 M BNT-II.
  4. Añadir 100 l de cada dilución, por triplicado, con HBS que sirve como un espacio en blanco, a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Para cada muestra, añadir 2,5 l de 2 mM Ir1.
  5. Shake la placa durante 10 minutos en un agitador de placas.
  6. Después de agitar, leer la intensidad de emisión a 510 nm (excitación a 365 nm) utilizando un lector de placas de 96 pocillos.
    1. Colocar la placa en el instrumento y abrir el software lector de placas de establecer un nuevo experimento.
    2. Ajuste el nuevo experimento para leer un punto final de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 365 nm de longitud de onda y la emisión de 510 nm. Ajuste el ancho de la ranura para ambas longitudes de onda a 9nm, con la óptica en la posición superior.
    3. Leer la placa y exportar los datos para su análisis.
  7. Transferir las muestras a una placa de 96 pocillos clara y la imagen de la titulación utilizando un transiluminador UV.

4. tiempo real Kinetic Análisis del Sistema Ir1 / BNT-II Uso de biocapa Interferometría

  1. Añadir 200 l de tampón cinético (KB; 1x solución salina tamponada con fosfato con 0,02% de Tween-20) a 8 pozos en la primera columna de una placa de 96 pocillos negro e insertar la placa en el sensor de plásticotitular. Transferir cuidadosamente 8 Ni (II) biosensores NTA a la primera columna en el soporte de plástico de tal manera que las puntas se suspenden en los pocillos de tampón. Colocar el soporte de plástico en el lado izquierdo del instrumento interferometría.
  2. Preparar unas 2 ml de una solución de BNT-II 0,5 M en KB.
  3. Preparar 500 l de una solución 10 mM de Ir1 en KB, y diluir en serie a la mitad hasta 0.156 M en KB.
  4. Para una nueva placa de negro 96, pipeta 200 l de KB a los 8 pozos en la columna A y C.
  5. En la misma placa, pipeta 200 l de la solución 0.5μM BNT-II a los pozos en la columna B.
  6. Pipetear 200 l de cada dilución de Ir1 en la columna D, a partir de KB como blanco en D1 bien. Añadir las diluciones de manera que los pocillos aumento en la concentración Ir1 abajo de la columna.
  7. Coloque esta placa en el instrumento de la derecha de la placa que contiene los sensores pre-humectantes.
  8. En el software de interferometría biocapa, configure una Kinet básicaic experimento mediante la definición de los consejos de placa, de ensayo, y sensores.
    1. Para definir la placa, seleccione una columna en la pantalla, haga clic derecho y elegir la definición adecuada de los pozos. Seleccione "Buffer" para las columnas A y C, "carga" para la columna B, y "muestra" para la columna D.
    2. Definir el ensayo en la siguiente pestaña añadiendo los siguientes pasos (Haga clic en "Add"): Equilibrio (Custom), 60 seg; Cargando, 120 seg; Línea de base, 60 seg; Asociación, 120 seg; y la disociación, 300 seg. Seleccione el paso equilibrado y haga doble clic en la columna A. Repita para Carga (columna B), Línea de base (columna C), Asociación (columna D), y la disociación (columna C). Seleccione los sensores de Ni (II) NTA.
    3. Mover a la siguiente pestaña y confirme que los sensores están en la columna A en el soporte del sensor de plástico.
    4. Confirme el experimento se describe correctamente, introduzca un nombre de archivo, asegúrese de que "experimento demora" está marcada, y pulse "Ir".
      Nota: Debido a la naturaleza automatizada del instrumento, una vez que se describe el experimento cinético, los pasos se producirá según lo programado.
  9. Una vez que el plazo cinética es completa, procesar los datos en el software de procesamiento proporcionada.
    1. Haga doble clic en la carpeta con el nombre del archivo de interés en la parte inferior del panel de la izquierda. A continuación, haga doble clic en la carpeta correspondiente en "Cinética" en la parte superior del panel. Mover a la pestaña de procesamiento.
    2. Marque la casilla Sustracción de la izquierda para abrir la pantalla de selección del sensor. Haga clic derecho sobre bien A4 y cambiar el tipo de bien en referencia Bien.
    3. Marque la casilla junto a Alinear eje Y, y asegurar el paso seleccionado es de línea de base. Especifique el intervalo de tiempo a ser el último de cinco segundos de la línea de base (aproximadamente 55 a 60 segundos).
    4. Marque la casilla para el Inter a paso de corrección y seleccione Alinear con la disociación. Asegúrese de que el cuadro de Savitzky-Golay Filtrado está marcada y pulse Proceso "Datos! ̶1;
    5. Mover a la pestaña Análisis. Asegúrese de que "de asociación y disociación" es la selección de medidas para analizar y que el modelo es de 1: 1. Seleccione un ajuste completo Local y presione "Curvas Fit!"
    6. Resalte todas las curvas de la tabla y haga clic derecho para ajustar todas las curvas de un solo color. A continuación, seleccione un ajuste (Completo) Global, agrupados por color y Rmax Unlinked por sensor. Pulse "Curvas Fit!" Para obtener datos de cinética globales.

5. On-talón Detección de BNT-II y rcHRP-II con IR1

  1. Preparar 1 ml cada uno de una solución 1 M de BNT-II y rcHRP-II en HBS con Tween (HBST; HBS con 0,025% de Tween 20).
  2. Diluir en serie cada proteína por medio de HBST a una concentración final de 15,6 nM.
  3. Pipetear 100 l de cada dilución, por triplicado, en una placa de 96 pocillos blanco, con las diluciones en orden de menor a mayor concentración de una columna.
  4. Pipeta 10 l de 50 micras de Ni (IINTA agarosa) partículas magnéticas en cada dilución así.
    1. Vortex el tubo de microcentrífuga que contiene las partículas magnéticas después de cada pipeta para asegurar que las partículas permanecen suspendidas.
  5. Colocar la placa en un agitador de placas durante 15 min a incubar las muestras con las partículas.
  6. Después de este período de incubación, colocar la placa en un 96 pocillos imán de placa y esperar 30 segundos para que las partículas se sacan de la solución.
  7. Con una pipeta multicanal, salga de la muestra original y desechar como residuos. Retirar la placa de imán.
  8. Añadir 200 l de HBST a cada pocillo usando la pipeta multicanal. Bombear el tampón de arriba y abajo varias veces para lavar las partículas magnéticas.
  9. Coloque la placa de nuevo en el imán y espere 30 segundos para que las partículas se sacan de la solución.
  10. Usando la pipeta multicanal, salga de los 200 l de tampón y desechar como residuos. Retirar la placa de imán.
  11. Repita los pasos 5,8 through 5.10 dos veces para completar tres lavados de las partículas.
  12. Añadir 100 l de HBST a cada pocillo que contiene partículas magnéticas seguida de 2,5 l de 2 mM Ir1.
  13. Se incuban las partículas con Ir1 en un agitador de placas durante 1 hora.
  14. Después de 1 hora, lee la intensidad de emisión a 510 nm (excitación a 365 nm) utilizando un lector de placas de 96 pocillos.
    1. Colocar la placa en el instrumento y abrir el software lector de placas de establecer un nuevo experimento.
    2. Ajuste el nuevo experimento para leer un punto final de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 365 nm de longitud de onda y la emisión de 510 nm. Ajuste el ancho de la ranura para ambas longitudes de onda a 9 nm, con la óptica en la posición superior.
    3. Leer la placa y exportar los datos para su análisis.
  15. Transferir las muestras a una placa de 96 pocillos clara y la imagen de la titulación utilizando un transiluminador UV.

Representative Results

Como se muestra en la Figura 1, la síntesis de la Ir1 solvento-complejo división involucrados del puente de cloruro en el dímero padre por precipitación del cloruro en forma de AgCl insoluble y la asociación de las moléculas de agua al centro metálico. La formación de Ir1 fue confirmada por RMN H 1 y ESI. Además, se asignaron bandas características de transferencia de carga de metal ligando UV-visible y π-π * transiciones al espectro, que valida aún más la formación de Ir1. Este solvata exposiciones complejas ningún personaje de emisión cuando se excita a 365 nm.


Figura 1
Figura 1:. Síntesis y caracterización de Ir1 reacción de disociación puente Cloruro de Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) diiridium (III) para crear el complejo aquo Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1). Tras la adición de L-His al complejo acuo en tampón acuoso, señal luminiscente se enciende.

Una vez que el complejo fue sintetizado y caracterizado, se analizó la selectividad de aminoácidos, como se describe previamente usando un análogo de iridio similares 17. La Figura 2A muestra que sólo histidina provocó una respuesta de la señal a 510 nm, cuando se excita a 365 nm.


Figura 2
Figura 2: aminoácido Selectividad y Titulación de Ir1 con histidina ricos péptidos (A) Interacción de 200 mM de varios aminoácidos (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) con 50 mM. Ir1 en HBS. Exploraciones espectrales fueron tomadas 400-700 nm a una longitud de onda de excitación de 365 nm en un plato negro de 96 pocillos. De señal en unidades de fluorescencia relativa (RFU) de todos los aminoácidos bdemás de histidina (trazo negro discontinua) fue insignificante. Concentraciones (B) nanomolares de BNT-II (▪) y rcHRP-II (♦) se titularon con Ir1 en HBS. Los péptidos ricos en histidina se incubaron con la sonda durante 15 min en solución antes de la lectura de la emisión a 510 nm después de la excitación con 365 nm de luz. Límite de detección se calculó como el valor de x cuando y = 3σ en blanco.

Este "interruptor" de la fosforescencia de la sonda de iridio se debe a que el estado excitado singlete (1 MLCT / 1 LC) del Ir (III) bioconjugado sufre cruce entre el estado excitado triplete (3 MLCT), cuando se coordina histidina al centro metálico. Esta sonda se aplicó a BNT-II un péptido mimético de la malaria Plasmodium falciparum biomarcador Histidina Rich Protein II (pf HRP-II). En una valoración de BNT-II con IR1, se observó una respuesta de la señal dependiente de la concentración ( D de Ir1 unión a BNT-II inmovilizado sobre una superficie Ni (II) NTA se encontró que era 2,05 M (Figura 3).

Figura 4

Figura 3: en tiempo real Kinetic Análisis de Ir1 con BNT-II biocapa interferometría para el análisis cinético de diversas concentraciones de Ir1 de unión a BNT-II en la superficie de un sensor de cristal (II) NTA Ni.. Después de equilibrar los sensores en KB (Región A), los sensores están cargados con 0,5 M BNT-II (Región B). Una vez que el péptido se carga en los sensores, una línea de base se establece (Región C) antes de medir la asociación de Ir1 a la BNT-II (Región D). Despuésun período de asociación, los sensores se colocan de nuevo en KB para medir la disociación (Región E). Todo el proceso de análisis cinético tarda menos de 30 minutos.

Cuando la transición de un ensayo basado en solución a una plataforma de partículas magnéticas, la complejidad añadida de la partícula en el sistema tenía que ser tomada en cuenta. Se sabía de trabajos anteriores, que estas partículas se unen de manera eficiente la pf biomarcador malaria HRP-II. 24 placas fluorescentes Negro funcionaba bien para el ensayo de solución de describir anteriormente, pero las placas blancas eran más adecuados para la plataforma de detección en partículas, como se ve en la Figura 4A. En una placa blanca, la luz se refleja de nuevo en la muestra, permitiendo así una mejor absorbancia por el Ir1 unido a la superficie de la partícula. En el ensayo de partículas, el límite de detección de rcHRP-II se determinó que era 14,5 nM (Figura 4B). El límite de detección para rcHRP-II en solución y en grano eran statisticamente la misma en base a una prueba t no pareada (p = 0,731).

Figura 5
Figura 5


Figura 4:. On-talón Detección de BNT-II y HRP-II (A) de diferencia entre la señal detectada desde Ir1 unido a BNT-II en la superficie de 50 micras de Ni partículas de agarosa (II) NTA magnéticos en un negro de 96 así placa (línea continua) frente a una placa de 96 pocillos blanco (línea discontinua). Las partículas estaban entusiasmados con 365 nm de luz, y la emisión se midió a 510 nm. (B) La titulación de rcHRP-II inmovilizado sobre las partículas magnéticas y se detectó usando Ir1. Límite de detección se calculó como la VAlue de x cuando y = 3σ blanco.

Figura 5

Figura 5: Representación esquemática de la detección on-gota de rcHRP-II con Ir1 Esquema general de HRP-II de unión a la superficie de Ni (II) NTA partículas y etiquetado con Ir1.. Las partículas se incuban con un péptido rico en histidina por 15 min. Después de este período de incubación, las partículas se lavan con HBST usando un imán, con el fin de tirar de las partículas de la solución. Por último, las partículas de péptido unido se incuban con IR1 durante 1 hora antes de la lectura de la emisión a 510 nm después de la excitación con 365 nm de luz.

Discussion

Como herramientas de diagnóstico basadas en micropartículas vienen a la vanguardia de la tecnología de diagnóstico moderno, la detección de biomoléculas diana directamente sobre la superficie de la partícula es una gran ventaja. Métodos de detección molecular tradicionales, tales como ELISA y PCR, son ventajosas, en que puedan alcanzar límites muy bajos de detección 25. Sin embargo, estos ensayos requieren extensas reactivos y protocolos largos. Este ensayo fue diseñado para imitar las interacciones de tipo sándwich ELISA sin los requisitos de reactivos (Figura 5) y tiempo. Adicionalmente, el costo de la sonda Ir1 por muestra se estimó en alrededor de un centavo, mientras que el coste de anticuerpos para un ELISA típico es $ 0,20-0,30 por muestra.

Dado que los métodos descritos anteriormente se basan en una sonda de iridio cyclometalated para la detección del biomarcador malaria, esta sonda no sería susceptible a los modos de fallo comunes a otros métodos de detección (es decir. Quenchi fluoróforong y la degradación de anticuerpo / enzima). La histidina es único en sus propiedades de unión a metal. El trabajo descrito se aprovecha de este fenómeno mediante la sustitución de los anticuerpos en un típico ELISA tipo sándwich con complejos de metal que contiene. Ni (II) NTA captura rcHRP-II en la superficie de la partícula y Ir1 señala la presencia de la proteína. El paso más crítico en el ensayo está permitiendo que las partículas magnéticas se mezclen con la muestra y la sonda. En una placa de 96 pocillos ELISA, las biomoléculas y reactivos alcanzan el equilibrio con la superficie bidimensional de la parte inferior del pozo. Las partículas magnéticas tienen la tendencia a sedimentarse fuera de la solución debido a su núcleo de hierro-óxido densa, lo que reduciría los sitios de unión disponibles. Por lo tanto, las partículas deben ser mezclados durante el tiempo de ensayo para asegurar la unión máxima.

En el diseño de un reactivo para el diagnóstico de enfermedades, hay que tener en cuenta la forma de muestra del paciente, así como la concentración fisiológica del biomarcador. Pormalaria, la concentración de PF HRP-II en la sangre de un paciente puede variar de baja a alta picomolar nanomolar. Mientras que este ensayo es clínicamente relevante para los niveles más altos de infección, necesita el límite de detección para ser mejorado con el fin de detectar pacientes asintomáticos con bajo picomolar circulante pf HRP-II. En los métodos descritos anteriormente, el "encendido" señal generada por Ir1 se produce en presencia de histidina. Mientras que el biomarcador malaria es rica en histidina, otras proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano y glicoproteína rica en histidina, se provocan una respuesta de la señal con la sonda. Esto a su vez conducir a diagnósticos falsos positivos. Esto hace que la captura de la proteína en la superficie de la partícula un paso beneficioso, en que la proteína de interés se puede extraer rápidamente de una muestra de paciente. Además, el diseño de una sonda bifuncional, que las parejas de un péptido rico en histidina a un elemento de reconocimiento molecular robusta (es decir. Aptámero), Podría añadir otra capa de especificidad para el ensayo. El péptido sería cargado con iridio antes del acoplamiento a la aptámero. En tal diseño, la sonda Ir1 estable todavía se puede utilizar mientras que el logro especificidad de la diana con el aptámero. Esto permitiría la aplicación de la sonda para detectar nativo HRP-II en una matriz compleja (es decir. Plasma o sangre entera) y reducir los efectos de unión no específicos. Con el fin de mejorar aún más la señal de pruebas de diagnóstico rápido, el ensayo podría ser incorporado en un sistema electroquimioluminiscente (ECL), donde pf HRP-II se puede detectar en el PDR como una lectura electroquímica 26. Esta sonda iridio próxima generación mejoraría en gran medida nuestro ensayo en grano ELISA para la detección de biomarcadores de la enfermedad.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Iridium (III) luminiscentes Sonda para la detección de la proteína malaria biomarcador histidina Rich Protein-II
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Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

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