Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Iridium (III) Självlysande Probe för detektion av malaria Protein Biomarker histidin Rich Protein-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Detta arbete beskriver syntesen av en icke-emitterande, cyclometalated Ir (III) -komplexet, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), som framkallar en snabb, långlivat fosforescerande signal när koordinerad till en histidine- innehållande protein immobiliserat på ytan av en magnetisk partikel. Syntes av IR1, i höga utbyten, är komplett O / N och involverar klyvning av moder cyclometalated Ir (III) klor-överbryggade dimeren i två ekvivalenter av den solvatiserade komplexet. För att bekräfta specificiteten har flera aminosyror sonde för samordningsverksamhet när de läggs till den syntetiserade sonden, och endast histidin framkallade en signal svar. Använda BNT-II, en grenad peptid imitatör av malaria biomarkör Histidin rika protein II (pfHRP-II), var iridium sonden validerats som ett verktyg för HRP-II-detektering. Släcka effekter noterades i BNT-II / IR1 titrering vid jämförelse med L-histidin / IR1, men dessa var skrivas steriskt hinder och triPlet tillstånd släckning. Biolayer interferometri användes för att bestämma realtids kinetiken för interaktionen av IR1 med BNT-II. När systemet var optimerad, var detektionsgränsen av rcHRP-II med hjälp av sonden visade sig vara 12,8 nM i lösning. När detta protein immobiliserades på ytan av en 50 ^ m magnetisk agaros partikel, var detektionsgränsen 14,5 nM. Den robusta signalsvar av detta oorganiska sond, liksom dess flexibilitet i användningen i lösning eller immobiliserade på en yta, kan lämpa sig mot en mängd olika tillämpningar, från diagnostik till avbildning.

Introduction

Colorimetric och fluorescerande märkning är en viktig metod för att upptäcka och spårning av biokemiska molekyler och processer 1,2. De vanligaste fluorescerande markörer är lågmolekylära organiska färgämnen 3,4, men dessa molekyler har inte alltid ideala optiska egenskaper. Fluorescerande färgämnen är benägna att fotoblekning, ofta har små Stokes skift, och kan ha överlappande excitations- och emissionsspektra. Kolorimetrisk märkning uppnås ofta med hjälp av enzymatiska märkningar, som har en förstärkt signal användbar i immun kvantifiering 5,6. Dessa enzymer har också sina nackdelar, inklusive foto, reaktionsbetingelser, och korta substrat hållbarhet. Dessa egenskaper tenderar att kräva immun och proteinmärkningsmetoder göras under väl kontrollerade förhållanden med hjälp av dyra reagens.

Emitterande övergångsmetallkomplex har undersökts som ett alternativ märkning for biokemisk detektion. I synnerhet cyclometalated Ir (III) har studerats i samband med organiska lysdioder (OLED) 7-9 syre avkänning 10, Catalysis 11, och protein / cellfärgning 12-14. Hög foto och DQE gör denna klass av sonder en bra kandidat för biomolekyler upptäckt 15,16. Man har tidigare funnit att cyclometalated Ir (III) -komplex, av formen [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] ^, irreversibelt binda histidin och framkalla ett blågrönt signalsvar 12,17. Dessa komplex är icke-emissiv i solvento tillstånd, men när histidin förskjuter lösningsmedelsmolekylerna och binder till metallcentrumet, släpper de en intensiv fosforescerande signal efter långvågig UV-bestrålning. Denna signal uppträder endast efter ligand substitution, och är resultatet av ett triplettillstånd elektron kopplar till grundtillståndet genom aktivering av metalligand laddningsöverföring (3 MLCT) och ligand centrerad överföring (3 LC) vägar 8,15. Dessa komplex kan potentiellt användas som detektionsprober för histidin rika proteiner.

Histidin rika proteiner och deras regleringsnivåer är viktiga i många sjukdomar, inklusive levercirros, cancer och thrombic störningar. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) i synnerhet är en väl validerad biomarkör för parasitmalariainfektion. Detta protein är 67 kDa och innehåller 34% histidin, främst inom karakteristiska AHHAHHAAD upprepa motiv 19. Dessa histidin upprepningar kan binda fria metalljoner 19 och hem komplex 20 i värd blod. pfHRP-II är vanligen påvisas i inställningarna resurssnåla använder immunokromatografiska snabba diagnostiska test (RDTs), men dessa tester är ofta felaktiga på grund av provförhållanden, låg biomarkör koncentration, dålig tillverkningsnormer, och antikropps nedbrytning 21.

2 (H2O) 2] + (IR1) för att detektera BNT-II, en förgrenad peptid efterliknar av pfHRP-II utforskas 22. Kinetik för denna interaktion övervakades i realtid med användning av biolayer Interferometri tekniker. Analysen har också anpassats till en on-kula ELISA-typ format, där nanomolära detektionsgräns uppnåddes. Denna analys har fördelar jämfört med traditionella ELISA, eftersom det kan utföras i enlighet med två h med antikroppsfria reagens, i stället för 4-5 timmar och biologiska reagens som erfordras med typiska ELISA.

Protocol

1. Syntes av Iridium (III) -komplexet

  1. Väg upp 53,6 mg (50 ^ mol) av [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 och lös i 5 ml metylenklorid. Tillsätt denna lösning till en 50 ml Erlenmeyer-kolv försedd med en omrörarstav.
  2. Väg upp 26,2 mg (100 ^ mol) av AgOTf och lös i 5 ml metanol.
  3. Lägg den upplösta AgOTf till [Ir (ppy) 2 -Cl] 2-lösning och rör om under 1 timme.
    Obs: ett gräddfärgat slam bör resultera.
  4. Efter 1 timme, filtrera slammet genom silikagel i en 25 x 95 mm dram ampull och avdunsta återstående lösningsmedel med användning av en rotationsindunstare (5-10 min).
  5. När det mesta av lösningsmedlet avlägsnas, kontrollera att en oljig gul återstod kvar i flaskan. Till denna återstod, tillsätt 1 ml metanol för att åter lösa produkten och lyofilisera 1-2 dagar för erhållande av det gula fasta produkten.
  6. Karakterisera Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + produkt (IR1) av H <sup> 1 NMR (i CDCI3), ESI och UV-Vis såsom beskrivits tidigare. 23

2. Interaktioner mellan IR1 med olika aminosyror

  1. Bered en 2 mM lösning av IR1 i metanol (molekylvikt 537,10 g / mol). Vortexa för att säkerställa fullständig upplösning av det fasta materialet.
  2. Bered 100 pM lösningar av följande aminosyror och biomolekyler i HEPES-buffrad saltlösning (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, lie, Lys, Ser, Try, Val.
  3. Pipettera 100 | il av varje aminosyra till en svart 96-brunnars platta. Tillsätt 100 pl HBS till plattan för att fungera som en blank.
  4. Lägg 2,5 pl av 2 mM IR1 lösning till varje prov och skaka plattan på en plattskakanordning under 10 min.
  5. Efter 10 minuter, förvärva emissionsspektra av proven med användning av en 96-brunnars plattavläsare (365 ex / 400-700 em).
    1. Placera plattan i instrumentet och öppna plattläsare programvara för att inrätta ett nytt experiment.
    2. Ställ in nya experiment att läsa en fluorescensavsökning med en excitationsvåglängd av 365 nm och en spaltbredd av 9 nm med optiken vid toppositionen.
    3. Läs utsläpp 300-700 nm med en steglängd av 5 nm.
    4. Exportera data för analys av data.
  6. Överför proverna till en klar 96-brunnar och image emissionen med användning av en UV-transilluminator.

3. Titrering av IR1 med BNT-II

  1. Bered en 1 mM stamlösning av BNT-II (molekylvikt 8233,6 g / mol) i HBS samt en 2 mM lösning av IR1 i metanol.
  2. Från stamlösningen, förbereda 1 ml 100 iM BNT-II i HBS. Vortex mikrocentrifugrör att säkerställa provet blandas.
  3. Seriellt späda 100 pM BNT-II genom halv i HBS till en slutkoncentration av 1,56 | iM BNT-II.
  4. Lägg 100 pl av varje spädning, i tre exemplar, med HBS tjänstgör som en blank, till brunnarna i en 96-brunnsplatta. Till varje prov, tillsätt 2,5 | il av 2 mM IR1.
  5. ShAKE plattan under 10 minuter på en plattskakanordning.
  6. Efter skakning, läs emissionsintensiteten vid 510 nm (excitation vid 365 nm) med användning av en 96-brunnsplattläsare.
    1. Placera plattan i instrumentet och öppna plattläsare programvara för att inrätta ett nytt experiment.
    2. Ställ in det nya försöket att läsa en fluorescens ändpunkt med en excitationsvåglängd av 365 nm och emissionsvåglängd av 510 nm. Ställ in spaltbredden för båda våglängderna till 9nm, med optiken på toppositionen.
    3. Läs plattan och exportera data för analys.
  7. Överför proverna till en klar 96-brunnar och bild titreringen med hjälp av en UV-transilluminator.

4. realtid Kinetic Analys av IR1 / BNT-II systemet med Biolayer Interferometry

  1. Lägg 200 pl av kinetisk buffert (KB; 1x fosfatbuffrad saltlösning med 0,02% Tween-20) till 8 brunnar i den första kolumnen i en svart 96-brunnar och för in plattan i plastsensorninnehavare. Överför försiktigt 8 Ni (II) NTA biosensorer till den första kolumnen i plasthållaren så att spetsarna är upphängda i brunnarna i buffert. Placera plasthållare i den vänstra sidan av interferometri instrumentet.
  2. Förbered en 2 ml av en 0,5 iM lösning av BNT-II i KB.
  3. Bered 500 ul av en 10 ^ M lösning av IR1 i KB, och serie späd med hälften ned till 0,156 iM i KB.
  4. Till en ny svart 96 brunnars platta, pipett 200 pl av KB till alla åtta brunnar i kolumn A och C.
  5. I samma platta, pipett 200 ul av 0,5 pM BNT-II-lösning till brunnarna i kolumn B.
  6. Pipett 200 ul av varje utspädning av IR1 i kolumn D, börjar med KB som ämnet väl D1. Tillsätt späd så att brunnarna ökar i IR1 koncentration ned kolonnen.
  7. Placera denna platta i instrumentet till höger om plattan innehållande pre-vätande sensorer.
  8. I biolayer interferometri programvara, skapa en grundläggande Kinetic experiment genom att definiera platta, analys och sensor tips.
    1. För att definiera plattan, välj en kolumn på skärmen, högerklicka och välja lämplig definition av brunnarna. Välj "buffert" för kolumnerna A och C, "Load" för kolumn B och "Sample" för kolumn D.
    2. Definiera analysen i nästa flik genom att lägga till följande steg (Klicka på "Lägg till"): Ekvilibreringstid (Custom), 60 sek; Laddar, 120 sek; Baslinje, 60 sek; Association, 120 sek; och Dissociation, 300 sek. Välj Jämvikts steg och dubbelklicka på kolumn A. Upprepa för Loading (kolumn B), Baseline (kolumn C), Association (kolumn D) och Dissociation (kolumn C). Välj Ni (II) NTA sensorer.
    3. Flytta till nästa flik och kontrollera att sensorerna är i kolumn A på plastsensorhållaren.
    4. Bekräfta experimentet är korrekt skiss sätter ett filnamn, se till att "försening experiment" är markerad och tryck på "Go".
      NAnm: På grund av den automatiserade typen av instrument, så snart den kinetiska experimentet beskrivs stegen kommer att ske som programmerat.
  9. När väl den kinetiska körningen är färdig, bearbeta data i tillgänglig bearbetningsmjukvaran.
    1. Dubbelklicka på mappen med filnamnet av intresse i den nedre delen av panelen till vänster. Därefter dubbelklickar du på motsvarande mapp under "Kinetics" i den övre delen av panelen. Flytta till fliken Processing.
    2. Kontrollera subtraktion rutan till vänster för att öppna val givaren skärmen. Högerklicka på väl A4 och ändra typen väl till referensbrunnen.
    3. Markera kryssrutan bredvid Justera Y-axeln, och se till att den valda steget är Baseline. Ange tidsintervallet att vara den sista fem sekunder av baslinjen (ca 55-60 sek).
    4. Markera kryssrutan för Inter-steg korrigering och välj Justera till dissociation. Se till att Savitzky-Golay filtrering rutan är markerad och tryck på "Process data! ̶1;
    5. Flytta till fliken Analys. Försäkra dig om att "Association och Dissociation" är valet för åtgärder för att analysera och att modellen är 1: 1. Välj en lokal, Full passform och tryck "Fit kurvor!"
    6. Markera alla kurvor i tabellen och högerklicka för att ställa in alla kurvor till en färg. Därefter väljer du en global (Full) passform, grupperade efter färg och Rmax olänkade av sensor. Tryck på "Fit kurvor!" För att få globala kinetik uppgifter.

5. On-pärla upptäckt av BNT-II och rcHRP-II med IR1

  1. Bered en ml vardera av en 1 uM lösning av BNT-II och rcHRP-II i HBS med Tween (HBST; HBS med 0,025% Tween 20).
  2. Seriellt späda varje protein med hälften i HBST till en slutlig koncentration av 15,6 nM.
  3. Pipettera 100 | il av varje spädning, i tre exemplar, till en vit 96-brunnars platta, med utspädningar i ordning från lägsta till högsta koncentration nedför en kolonn.
  4. Pipettera 10 | il av 50 | j, m Ni (II) NTA magnetiska agarospartiklar i varje utspädning väl.
    1. Vortex mikrocentrifugrör innehåller de magnetiska partiklarna efter varje pipettering för att säkerställa att partiklarna stannar avbrytas.
  5. Placera plattan på en plattskakanordning för 15 min för att inkubera proverna med partiklarna.
  6. Efter denna inkuberingsperiod, placeras plattan på en 96-brunnars platta magnet och vänta 30 s för att partiklarna dra ut ur lösningen.
  7. Med hjälp av en multikanalpipett, dra av det ursprungliga provet och kassera som avfall. Avlägsna plattan från magneten.
  8. Lägg 200 pl av HBST till varje brunn med hjälp av flerkanalspipett. Pumpa bufferten upp och ned flera gånger för att tvätta de magnetiska partiklarna.
  9. Placera plattan tillbaka till magneten och vänta 30 sekunder för partiklarna att dra sig ur lösning.
  10. Använda multikanalpipett, dra bort 200 pl buffert och kassera som avfall. Avlägsna plattan från magneten.
  11. Upprepa steg 5,8 rakt igenomh 5.10 två gånger för att slutföra tre tvättningar av partiklarna.
  12. Tillsätt 100 ni HBST till varje brunn innehållande magnetiska partiklar följt av 2,5 | il av 2 mM IR1.
  13. Inkubera partiklarna med IR1 på en plattskakanordning under 1 h.
  14. Efter 1 timme, läs emissionsintensiteten vid 510 nm (excitation vid 365 nm) med användning av en 96-brunnsplattläsare.
    1. Placera plattan i instrumentet och öppna plattläsare programvara för att inrätta ett nytt experiment.
    2. Ställ in det nya försöket att läsa en fluorescens ändpunkt med en excitationsvåglängd av 365 nm och emissionsvåglängd av 510 nm. Ställ in spaltbredden för båda våglängderna till 9 nm, med optiken vid toppositionen.
    3. Läs plattan och exportera data för analys.
  15. Överför proverna till en klar 96-brunnar och bild titreringen med hjälp av en UV-transilluminator.

Representative Results

Såsom visas i fig 1, syntes av IR1 solvento-komplex involverade delning av kloriden bron i moder dimeren genom utfällning av kloriden i form av olösliga AgCl och association av vattenmolekyler till metallcentrumet. Bildandet av IR1 bekräftades av H 1 NMR och ESI. Dessutom har UV-synligt band som är karakteristiska för metalligand laddningsöverföring och π-π * övergångar tilldelats spektrumet, ytterligare validering av bildandet av IR1. Solvatiseras Denna komplexa uppvisar ingen emitterande karaktär när den exciteras vid 365 nm.


Figur 1
Figur 1:. Syntes och karakterisering av IR1 Klorid bro klyvning reaktion av Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) fenyl) diiridium (III) för att skapa aquo komplexet Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1). Vid tillsats av L-His till aquo komplex i vattenbaserad buffert, är luminescerande signalen påslagen.

När komplexet syntetiserades och karakteriserades, var selektiviteten aminosyran analyseras, såsom beskrivits tidigare med användning av en liknande iridium-analog 17. Figur 2A visar att endast histidin framkallade en svarssignal vid 510 nm, när den exciteras vid 365 nm.


Figur 2
Figur 2: Amino Acid selektivitet och Titrering av IR1 med histidin Rich peptider (A) Samverkan mellan 200 iM av olika aminosyror (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) med 50 | iM. IR1 i HBS. Spekt avsökningar togs 400-700 nm vid en excitationsvåglängd av 365 nm i en svart 96 brunnars platta. Signal i relativa fluorescensenheter (RFU) från alla aminosyror besides histidin (streckad svart kurva) var försumbar. (B) nanomolära koncentrationer av BNT-II (▪) och rcHRP-II (♦) titrerades med IR1 i HBS. De histidin rika peptider inkuberades med sond för 15 minuter i lösning innan avläsning av emissionen vid 510 nm efter excitering med 365 nm ljus. Detektionsgränsen beräknades som värdet på x när y = 3σ tom.

Detta "on-switch" av fosforescens av iridium sonden beror på singexciterade tillståndet (1 MLCT / 1 LC) av Ir (III) biokonjugatet genomgår intersystemkorsning till triplett exciterade tillståndet (3 MLCT), när histidin samordnas till metallcentrumet. Denna sond applicerades på BNT-II en peptid imitatör av malaria biomarkör Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pf HRP-II). I en titrering av BNT-II med IR1 ades en koncentrationsberoende signalsvar observer ( D i IR1 bindning till BNT-II immobiliserad på en Ni (II) NTA yta befanns vara 2,05 | iM (Figur 3).

Figur 4

Figur 3: Real-time Kinetic Analys av IR1 med BNT-II Biolayer interferometri för kinetisk analys av olika koncentrationer av IR1 bindning till BNT-II på ytan av en Ni (II) NTA glas sensor.. Efter jämviktning av sensorerna i KB (region A) är sensorerna laddade med 0,5 pM BNT-II (Region B). När peptiden lastas på sensorerna, är en baslinje etablerad (Region C) före mätning associering IR1 till BNT-II (Region D). Efteren period förenings sensorerna placeras tillbaka i KB att mäta dissociation (Region E). Hela kinetisk analys processen tar mindre än 30 minuter.

Vid övergång från en lösningsbaserad analys för att en magnetisk partikel plattform, hade den ökade komplexiteten av partikeln i systemet som skall beaktas. Det var känt från tidigare arbeten, att dessa partiklar binder effektivt malaria biomarkör pf HRP-II. 24 Svart fluorescerande plattor fungerade bra för analyslösningen beskriva ovan, men vita plattorna var bättre lämpade för on-partikeldetekterings plattform, som kan ses i figur 4A. I en vit platta, är det ljus som reflekteras tillbaka in i provet, vilket möjliggör bättre absorbans av IR1 bunden till ytan av partikeln. I den partikelanalys, var fast besluten att vara 14,5 nM (Figur 4B) detektionsgränsen av rcHRP-II. Detektionsgränsen för rcHRP-II i-lösningen och på-kula var statistiskt samma baserat på ett oparat t-test (p = 0,731).

Figur 5
Figur 5


Figur 4:. On-vulst Detektion av BNT-II och HRP-II (A) Skillnad mellan den signal som detekteras från IR1 bundet till BNT-II på ytan av 50 | j, m Ni (II) NTA magnetiska agarospartiklar i en svart 96- brunnars platta (heldragen linje) jämfört med en vit 96-brunnars platta (streckad linje). Partiklarna exciteras med 365 nm ljus, och emission mättes vid 510 nm. (B) Titrering av rcHRP-II immobiliserade på de magnetiska partiklarna och detekteras med användning av IR1. Detektionsgränsen beräknades som vaLue x när y = 3σ tom.

Figur 5

Figur 5: Schematisk bild av On-pärla Upptäckt av rcHRP-II med IR1 Allmänt system av HRP-II binder till ytan av Ni (II) NTA partiklar och märkt med IR1.. Partiklarna inkuberas med en histidin rik peptid för 15 minuter. Efter denna inkubationsperiod, partiklarna tvättades med HBST användning av en magnet, för att dra partiklarna ut ur lösningen. Slutligen är de peptidbundna partiklar inkuberades med IR1 under 1 h före avläsning av emission vid 510 nm efter excitering med 365 nm ljus.

Discussion

Som mikropartikelbaserade diagnostikverktyg kommit i förgrunden av modern diagnostisk teknik, är detektion av mål biomolekyler direkt på ytan av partikeln en stor fördel. Traditionella molekylära detektionsmetoder, såsom ELISA och PCR, är fördelaktigt, eftersom de kan uppnå mycket låg detektionsgräns 25. Dessa analyser kräver omfattande reagens och långa protokoll. Denna analys har utformats för att efterlikna ELISA-typ smörgås interaktioner utan tid och reagenskrav (Figur 5). Dessutom har kostnaden för IR1 prob per prov beräknas uppgå till cirka ett öre, medan kostnaden för antikroppar för en typisk ELISA är $ 0,20-0,30 per prov.

Eftersom de förfaranden som beskrivs ovan är beroende av en cyclometalated iridium sond för detektering av malaria biomarkör skulle denna sond inte vara känsliga för felmoder gemensamma för andra detektionsmetoder (dvs.. Fluorofor quenching och antikropp / enzymnedbrytning). Histidin är unik i dess metallbindande egenskaper. Den skisserade arbete tar fördel av detta fenomen genom att ersätta antikropparna i en typisk ELISA-sandwich med metallinnehållande komplex. Ni (II) NTA fångar rcHRP-II på ytan av partikeln och IR1 signalerar närvaron av proteinet. Det mest kritiska steget i analysen tillåter de magnetiska partiklarna att blandas med provet och sonden. I en 96-brunnsplatta ELISA biomolekylerna och reagens når jämvikt med den tvådimensionella ytan på botten av brunnen. Magnetiska partiklar har en tendens att sedimentera ut ur lösningen på grund av deras täta järnoxidkärna, vilket skulle minska de tillgängliga bindningsställen. Sålunda måste partiklarna blandas under analystiden för att säkerställa maximal bindning.

Vid utformningen av ett reagens för diagnostik sjukdom, måste man hålla i minnet form av patientprov samt fysiologiska koncentrationen av biomarkörer. Förmalaria, kan koncentrationen av pf HRP-II i en patients blod variera från låga pikomolära till högt nanomolära. Även om denna analys är kliniskt relevant för högre nivåer av infektion, måste förbättras för att upptäcka symptomfria patienter med låg pikomolar cirkulerande pf HRP-II detektionsgränsen. I de metoder som anges ovan, det "switch-on" signal som genereras av IR1 sker i närvaro av histidin. Medan malaria biomarkör är rik på histidin, andra serumproteiner, såsom humant serumalbumin och histidin glykoprotein, skulle framkalla en svarssignal med sonden. Detta skulle i sin tur leda till falska positiva diagnoser. Detta gör avskiljning av proteinet på ytan av partikeln en välgörande steg, i att proteinet av intresse kan snabbt extraheras från ett patientprov. Dessutom, utforma ett bifunktionellt sond, som kopplar en histidin rik peptid till en robust molekylära igenkänningselement (dvs.. Aptamer), Skulle kunna lägga ytterligare ett lager av specificitet för analysen. Peptiden skulle laddas med iridium innan koppling till aptameren. I en sådan konstruktion kan den stabila IR1 sonden fortfarande utnyttjas samtidigt som man uppnår målspecificitet med aptameren. Detta skulle göra det möjligt för applicering av sonden att detektera nativa HRP-II i en komplex matris (dvs. Plasma eller helblod) och minska ospecifika bindande verkan. I syfte att ytterligare förbättra signalen av snabba diagnostiska tester, kunde analysen införlivas i en elektrokemiluminiscent (ECL) system där pf HRP-II kan detekteras på RDTs som en elektrokemisk avläsning 26. Denna nästa generations iridium sonden skulle avsevärt förbättra vår on-kula ELISA-analys för detektion av sjukdoms biomarkörer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Iridium (III) Självlysande Probe för detektion av malaria Protein Biomarker histidin Rich Protein-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter