Summary
Метастатического распространения рака является основной причиной смертности от онкологических заболеваний. Мы предоставляем углубленный описание нашего выживания методологии хирургии для создания "пациента, как" ортотопическая сингенными модели мыши систему для изучения механизмов метастазирования в солидных опухолей органов.
Protocol
О себе Этика
Все исследования на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в Хантер-колледже из Городского университета Нью-Йорке.
Примечание: Восемь BALB / C мышей использовали в этом экспериментальной процедуры. Пять BALB / C мышам имплантировали 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши гепатоцеллюлярной карциномы клеток для получения первичных опухолей. Три линии BALB / C мышей, не имеющие имплантации использовали в качестве контролей. BNL 1ME A.7R.1 является мышиным гепатоцеллюлярной линию клеток карциномы, которые были получены путем химического превращения из мышиного без онкогенного линии гепатоцитов клетки BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС).
1. Предварительная операция
- Убедитесь, что у мышей, для всех операций выживания здоровы. Чтобы убедиться, что мыши являются здоровыми, проверьте признаки обезвоживания палаток кожи. Не используйте мышей каких-либо доказательств заболевания или Distress в этих экспериментах.
- Взвесьте мышей, чтобы они не имеют недостаточный вес. Убедитесь, что вес, по крайней мере 16-20 грамм.
- Подготовьте 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК ячейки для имплантации в мышь:
- Аспирируйте средств массовой информации из 10 мл 60% - 70% сливающийся культуры клеток блюдо BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клеток. Дважды промывали 5 мл PBS. Добавляют 2 мл трипсина на блюдо и инкубировать при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и 5% CO 2 в течение 5 мин.
- Впоследствии, пипеток 10 мкл трипсином клетки в ручном гемоцитометра для подсчета клеток под микроскопом при увеличении в 10 раз. Подсчитайте общее количество клеток в четырех угловых квадратах больших и умножают коэффициент разбавления на общее количество клеток. Затем разделить на число подсчитанных площадей и умножить на 10 6 для концентрации клеток (клеток на мл).
- Использование расчет, собрать 5 миллионов клеток на мышь в стерильной1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавьте 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Ресуспендируют BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК ячейки 5 × 10 6 в 100 мкл фосфатным буферным раствором (PBS). Храните эти клетки на льду до имплантации в хирургии.
- Выполнение работ, необходимых для подготовки к операции мышей, таких как анестезия индукции и волосы отсечения от стерильной оборудования и материалов, чтобы избежать загрязнения.
- Вызвать общей анестезии у мышей при вдыхании изофлуран использованием изофлуран испаритель вместе с кислородом при постоянной скорости концентрации потока 1 л в минуту (прим. 2,1%). Примечание: Система самостоятельными, и включает в себя точность испаритель, в снабжение кислородом и угольный фильтр, который связан с дыхательной цепи, необходимой для газа / обезболивающий продувкой.
- Убедитесь, что анестезия достаточными для предотвращения животное от прохождения боль во время операции. Выполните схождение щепотку и наблюдать животное за неисполнение responслуживания, чтобы подтвердить анестезии.
- В то время, переключить клапана линии, печать на коробке и открыты для носового конуса.
- Как только мышь под наркозом, нанесите небольшое количество глазной мази роговицы в качестве превентивной меры от высыхания и повреждений.
- Впоследствии, двигаться животное в области подготовки, с носовой конус правильно расположены и подключены (для обслуживания анестезии). Подготовьте место хирургического разреза для операции по депиляции в этот препарат области.
- Убедитесь, что площадь хирургии в месте, свободной от всех других активности.
- Убедитесь, что рабочая поверхность является прочным и надлежащим образом продезинфицировать, незагрязненные и удобна перед операцией. Поместите стерильную кусок льняной или хирургического лоток над ним.
- Убедитесь, что операционное поле доступно только лиц, осуществляющих операции. Убедитесь, что хирургическое Уборка номера и прокатилась с соответствующим очистителем и распыляется с соответствующим disinfectant.
- Убедитесь, что он также расположен далеко от дверей и окон, как воздушные потоки могут распространяться пыли, ведущую к загрязнению участка.
- Выполните операцию выживания с стерильных инструментов. Либо замочить инструментов в качестве дезинфицирующего средства в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя или автоклаве. Использование основных стерильные материалы, которые готовы к использованию.
- Отдельные инструменты в соответствии с функцией, чтобы помочь предотвратить загрязнение стерильных зонах.
- Бритье примерно на 1 дюйм вокруг места разреза (срединный разрез), чтобы получить доступ к печени животного. Удалить волосы от животного от места операции.
- После бритья, скраб области с мыльной дезинфицирующим (Бетадин скраб хирургическое) и мыть лишнюю дезинфицирующее покончить с стерильного раствора PBS. Выполните это несколько раз, со всем процессом скраб продолжительностью около 5 мин. Снять и выбросить в употреблении перчатки.
- Потом перейти к защитной одежды, такие, как Surgicаль платье, скраб сверху, и маска. Далее, санировать руки с правильного решения скраб, прежде чем положить хирургические перчатки. Примечание: Это необходимый шаг, чтобы предотвратить пролития и загрязнение хирургической сайт с потенциальными загрязнителями.
2. Хирургическое
- Обеспечить внешний источник тепла в тепле на протяжении всего периода анестезии. Животное может испытывать некоторые переохлаждение, потому что анестезия вызывает нарушения терморегуляции; Поэтому, поддержание температуры тела.
- Положите мышь на спине на протяжении операции.
- Закрепите передние конечности, задние конечности и хвост мыши к столу с кусочками хирургии хирургических лент.
- Сделайте прямой разрез сразу уступает xyphisternum.
- Используйте стерильную самоудерживающийся хирургического втягивающим подвергать печень.
- С шприц, имеющий 20G иглу, медленно и осторожно вводят 100 мкл PBS, содержащие 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1мыши HCC клеток в правой доле печени.
- После удаления иглы, применять стерильную ватный тампон по крайней мере 1 мин, чтобы остановить кровотечение любого потенциального из-за высокой васкуляризации печени.
- Закрыть подкожной ткани с рассасывающиеся нити с последующим замыканием кожи с использованием хирургических зажимов. Впоследствии, очистить рану еще раз с бетадином скраба. Примечание: Это обеспечит закрытие операционной раны.
- Подкожно дать 100 мкл физиологического раствора.
3. Послеоперационный
- Сразу же после операции, переводить мышь на чистую клетку с идентификационной карты после операции, чтобы уведомить смотрителей состоянии мыши. Обеспечить еду и воду. Примечание: В нашем опыте, мышь, которая только что перенес операцию будет развиваться лучше, если расположен наедине с мокрой пищи и воды в начальный период 24-ч после операции.
- Держите животное в тепле с лампой тепло, выделяющее тепло не превосходящие 38 ºC. Uсе термометр для измерения температуры, пока мышь не полностью выздоровел.
- Дом животное в клетке желательно с бумажной подстилки, чтобы обеспечить комфорт.
- После первоначального восстановления, мониторинга животного признаки дискомфорта, кровотечения, боли и страданий. Дайте бупренорфин (0,05 -0,1 мг / кг) для облегчения боли. Внимательно следить за активность, поведение и внешний вид, а также расход воды и пищи в течение приблизительно 2 ч. Если амбулаторно, переместите животное обратно в район для регулярного нормального жилья мышей и продолжать следить за 6-12 ч с интервалом 24 ч для пост-операции. Выполните проверку веса, если это необходимо.
- Однако, если животное испытывает проблемы выздоравливал, принять соответствующие меры Поддерживающий уход. Если мыши не в состоянии восстановить, гуманно усыпить мышей через СО 2 удушья и цервикальной дислокации. Следуйте утвержденных организационных принципов для эвтаназии.
- Послеоперационный проверьте клинических признаков ГЦК, которые, как правило, observabле, как значительное снижение оценка состояния тела. Примечание: В этот момент первичной опухоли, скорее всего, разработаны в печени и метастатические отложения скорее всего разработаны в легких.
- На данный момент, пожертвовать всем мышей (экспериментальные и управления), участвующих в эксперименте по гуманной эвтаназии. Подвергать мышей углерода асфиксией диоксидом: очень медленно выпускают углекислый газ в камеру в течение 5 мин -10. Это вызовет остановку дыхания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Печень Balb / с мышей имплантировали 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клеток. Клинические признаки развития ГЦК было наблюдать 63 дней после операции. Следовательно, мышей умерщвляли гуманным. Вскрытие проводили на мышах эвтаназии. Легкие и печень иссекают и осторожны валовой экспертиза была проведена, чтобы определить макроскопические опухоли. В одной мыши, поверхностное опухоли наблюдали на поверхности печени с некоторой прикрепления к стенке брюшной полости (фиг.1А). Во втором мыши, аномально вид печени не наблюдалось. Ненормальность очень сильно похож на поверхностных опухолей (рис 1B). Как и ожидалось, мыши в контрольной группе, без имплантации BNL 1ME A.7R.1 ГЦК клеток не разработаны и не опухоли, о чем свидетельствует печени (рис 1D) и легких (рис 1E) от управления мышью. Кроме того, легкие мышей от опухолей с выглядел несколько ненормальным, дисплейING участки некроза геморрагического (рис 1в). Основываясь на предыдущем опыте, эти легкие может питать метастатических отложений 3.
Рисунок 1. Валовая исследование опухоли и метастазов. BALB / C мышам имплантировали 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 опухолевых клеток и эвтаназии 63 дней. Представительства опухоли печени, наблюдаемые были сфотографированы и показано здесь. (A и B) и показать поверхностных опухолей печени. (С) легкие от опухолевых клеток, имплантированных мышам. (D) отображает печень управления мышью. (Е) указывает легкие управления мышь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схема методологии в "пациента, как" модели ортотопической сингенными мыши гепатоцеллюлярной карциномы метастазов. После того, как под наркозом, печень мыши имплантируется с 5 х 106 BNL 1ME A.7R.1 мыши гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) клеток. При клинических признаков ГЦК наблюдается, животное умерщвляют гуманного эвтаназии (подвергнутого удушья диоксида углерода, с последующим чрескожной внутрисердечной обескровливания и цервикальной дислокации). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье углубленное описание метода, учитывая, что недавно был сообщил Ogunwobi и коллегам успешного создания ортотопической сингенной мышиной модели HCC метастазов (рис 2) 3. Скорость отбора опухолей для этой процедуры, как правило, высока. Ранее мы наблюдали скорость намотки опухоли в 100% 3. Тем не менее, скорость намотки может быть переменной в зависимости от компетенции следователя. В недавнем эксперименте, выполненном в новом аспиранта проходят обучение, скорость намотки опухоль цене 40%. Хотя большинство экспериментов прекращаются на 4 - 6 недель из-за снижения в состоянии тела счетом, мы считаем, из опыта с подкожной имплантации тех же клеток в тех же мышей, что первичные опухоли могут быть установлены на 2 - 3 недели. Мы обычно ожидаем увидеть одно из опухоли узелок успешного эксперимента. И хотя мы ожидаем легких метастазы развиваются между 4 - 6 недель, это conceivсостоянии, что опухоль в печени может происходить гораздо раньше.
Хорошие хирургические методы и асептические условия необходимы для успеха этого метода хирургии выживания. Мыши, используемые для хирургии выживания должна быть здоровой. Взвешивание до и после операции является хорошей практикой. Средние предоперационном веса мышей использовали в систему или последний эксперимент был 18 граммов, а в экспериментальной конечной точки (63 дней после хирургической имплантации) их средний вес был всего 22 граммов. Прирост всего 4 граммов веса в течение этого периода времени, скорее всего, потому что там было некоторое снижение веса из-за системных заболеваний от опухоли. У нас было бы более объективная оценка этого бы мы измеряли вес мыши один или два раза в неделю в течение всего эксперимента. Это рекомендуется лучшую практику.
Как показано на рисунке 2, мыши должны быть адекватно наркозом перед операцией и на протяжении всего периода операции, чтобы избежать боли A й бедствия. Область должна быть свободной от всякого беспорядка, и доступ должен быть доступен только для тех, кто выполняет операции. Оба область хирургии, а также инструменты, используемые все должны быть стерильными.
Жизненно важным шагом для успеха имплантации является подготовка мыши ГЦК клеток BNL 1ME A.7R.1 быть имплантированы. Во время подготовки, важно, чтобы избежать загрязнения сбора клеток из культуры клеток сливной блюд. Эти шаги должны быть выполнены в капот культуре клеток в стерильных условиях. Подсчета клеток следует также сделать, чтобы обеспечить 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши HCC клетки были собраны в стерильных 1,5 мл микроцентрифужных трубки на мышь, которая ресуспендировали в 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Окрашивания трипановым синим и может быть дополнительно выполнена для подтверждения жизнеспособности клеток. Эти клетки не должны храниться на льду не более 2 ч до имплантации в печени мышей.
_content "> Имплантация раковых клеток должны быть обработаны с осторожностью из-за деликатного характера печени (рис 2). Во время инъекции раковых клеток, избегать слишком глубоко прокол, который может привести к игле, проходящей через весь печени . Важно, чтобы придать раковые клетки медленно и осторожно. С другой стороны, слишком мелкий прокол с иглой перед инъекцией скорее всего приведет к утечки раковых клеток вводили из в брюшную полость. Кроме того, после удаления иглы, всегда есть потенциал органа кровотечение из-за его высокой васкуляризации. Поэтому, применяя стерильный ватный тампон, по крайней мере 1 мин рекомендуется. Уход и внимание будет обеспечивать самый высокий показатель успеха имплантации. Животное должно также быть предусмотрено внешний источник тепла в течение всей процедуры, как переохлаждение является серьезной проблемой в результате чего нарушения терморегуляции во время анестезии. После хирургии, животное должно контролироваться налюбые признаки дискомфорта или боли в этот момент соответствующий уход должны быть введены. Если мышь не в состоянии, чтобы оправиться от операции, он должен быть гуманным эвтаназии.Поскольку рак метастазы является основной причиной смертности от рака, важно, чтобы очертить механизмы гематогенного распространения 2-4. Новые циркулирующих опухолевых клеток были созданы из этой ортотопической сингенной мышиной модели HCC метастазов 3. Кроме того, ЦОК, полученные из этой модели последовательно показывают увеличение посвящение опухоли и метастазов возможность 3. Циркулирующие опухолевые клетки, выделенные с помощью этого метода может оказаться очень важным, поскольку они помогают разгадать конкретные молекулярные факторы, маркеры и возможные терапевтические мишени из метастазов рака 2-4. Эта методика уже определила, что существует повышенный позитивную регуляцию фактора роста гепатоцитов (HGF) и его рецептора, C-Met в циркулирующих опухолевых клеток по сравнению спервичные опухолевые клетки ГЦК 3. Эти результаты построить на предыдущей работе, демонстрируя, что важным аспектом метастазирования опухоли является клеточный процесс эпителиального-мезенхимальных перехода 2-4,10. Дальнейшие характеризующий циркулирующих опухолевых клеток, используя этот новый модель будет углубить наше понимание сложных механизмов в тех факторов, которые способствуют процессу, таким образом, ведущую к развитию более эффективного управления HCC 1-3,10.
В настоящее время наиболее широко используются модели опухоли животное мыши ксенотрансплантата моделях опухолей, в котором опухолевые клетки человека имплантировали в иммунодефицитных мышей. Модели, описанной в этой статье имеет важные преимущества, потому что это сингенных и, следовательно, пригодны для изучения роли иммунной системы в метастазировании опухолей 3. Эта модель доказала свою высокую воспроизводимость выделения, культивирования и изучения жизнеспособных клеток, циркулирующих опухолевых 3. Это, следовательно, имеет tremenDOUS потенциал для оценки клинических приложений, таких как обследования, диагностики, прогнозирования, мониторинга и открытию новых терапевтических стратегий терапии. Ограничение методологии, описанной выше, что значительная часть BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клеток имплантировали мышам будет способен выжить и, таким образом только небольшая часть клеток будет жизнеспособным и умело введения опухоли на вторичные сайты. 3 Мы учитываем это ограничение по начальной имплантации 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клеток на мышь.
В заключение, это ортотопическая сингенными модель мыши метастатического рака органов твердого предоставляет хорошую платформу для выяснения биологических механизмов, лежащих в основе метастатического потенциала циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических больных 3. Это, в свою очередь, скорее всего, пролить новый взгляд на механизмы метастазирования рака, потому что рак метастазы в основном происходит с помощью гемаtogenous распространяться 11-13. Новые идеи, таким образом, полученные в механизмы метастазов рака будет иметь решающее значение в разработке новых полезных клинических применений 3,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz | (RS-5040) | Tip 0.20 x 0.12 mm |
| Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6501) | Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6503) | Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm |
| Jameson Caliper (Measures tumors) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 inch scale, chrome plated |
| Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp | Roboz | (RS-5852) | 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings |
| Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Scalpel handle | Roboz | (RS-9884) | Solid |
| Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Length 4.5 inches |
| Brown needle holder, for easy suture tying | Roboz | (RS-7960) | Convex jaw, fine serrations |
| Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier | Roboz | (RS-9262) | safe, secure alternative method of wound closure |
| Instrument tray and lid | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-clipper with detachable blade | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | For fast decontamination of micro-dissecting instruments. Instruments decontaminate within 15 sec. |
| Microinjection needles | VWR | BD305125 | 25G Needle |
References
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765 (2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
