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Medicine

肝細胞癌転移の「患者様」同所同系マウスモデル

doi: 10.3791/52858 Published: October 24, 2015

Summary

癌の転移拡散は、癌関連死の主要な原因です。私たちは、固形臓器腫瘍で転移のメカニズムを研究するための「患者様」同所同系マウスモデル系を確立するための私たちの生存の手術方法の詳細な説明を提供します。

Protocol

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倫理ステートメント
すべての動物実験は、ニューヨーク市立大学ハンターカレッジの施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。

注:8 BALB / cマウスは、この実験手順で使用しました。五BALB / cマウスは、原発腫瘍を産生する5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウス肝細胞癌細胞を移植しました。無移植で三BALB / cマウスを対照として使用しました。 BNL 1ME A.7R.1は、マウス非腫瘍形成性肝細胞株BNL CL.2から化学変換によって得られたマウスの肝細胞癌細胞株です。 BNL 1ME A.7R.1は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手しました。

1.手術前

  1. すべての生存の手術のためのマウスは健康であることを確認してください。マウスは健康であることを確実にするために、皮膚のテンティングによって脱水の兆候を検査します。疾患又はdのいずれかの証拠でマウスを使用しないでくださいこれらの実験でistress。
  2. 彼らは低体重ではないであることを確認するために、マウスを計量。重量は少なくとも16〜20グラムであることを確認してください。
  3. マウスあたりの移植のための5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を準備します。
    1. BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞の70%コンフルエント細胞培養皿 - 10ミリリットルの60%から培地を吸引。 5ミリリットルPBSで2回洗浄します。皿にトリプシンの2 mlを加え、5分間空気および5%CO 2の加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
    2. その後、ピペット10μlを10倍の倍率で顕微鏡下で細胞計数のためのマニュアル血球計数器に細胞をトリプシン処理。 4大隅の正方形で見つかったセルの合計数をカウントし、細胞の総数によって希釈係数を掛けます。そして、カウント正方形の数で割ると、細胞濃度(1ml当たり細胞)のために10 6を掛け。
    3. 計算を使用して、無菌マウスあたり5万個の細胞を収集1.5mlの微小管。 1.5mlの微小管にラベルを付けます。
  4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)100μl中5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を再懸濁します。手術で移植まで氷上でこれらの細胞を保管してください。
  5. このような麻酔導入と髪が汚染を避けるために、滅菌装置・材料から離れクリッピングなどの手術のためのマウスの準備のために必要な活動を行います。
  6. 毎分1リットル(約2.1%)の一定濃度の流量で酸素と一緒にイソフルラン気化器を使用して、イソフルランの吸入によってマウスに全身麻酔を誘導します。注:システムは、自立で、精密気化器、酸素供給及びガス/麻酔掃気のために必要な呼吸回路にリンクされているチャコールキャニスタを含んでいます。
  7. 麻酔は、手術中に痛みを受けてから動物を防ぐために十分であることを確認してください。つま先のピンチを実行し、非responために動物を観察siveness麻酔を確認しました。
  8. その時、ノーズコーンにバルブライン、シールボックスに、オープンを切り替えます。
  9. すぐにマウスを麻酔されると、乾燥やダメージから予防措置として角膜に眼軟膏の少量を適用します。
  10. その後、適切に(メンテナンス麻酔のために)配置され、接続されたノーズコーンと、準備領域に動物を移動します。この準備エリアで脱毛することにより手術のための外科的切開部位を準備します。
  11. 手術の面積は、他のすべての活動の自由位置にあることを確認してください。
  12. 作業面は、手術前に頑丈かつ適切に消毒、汚れていないとすっきりであることを確認してください。リネンまたはそれ以上の外科手術用トレイの滅菌ピースを置きます。
  13. 術野が手術を行う者のみに利用可能であることを確認してください。外科的な部屋は、適切なdisinfeで洗浄し、適切なクリーナーで掃引し、噴霧されていることを確認ctant。
  14. 空気の流れは、サイトの汚染につながる塵を広げることができるようにそれはまた、ドアや窓から離れて配置されていることを確認してください。
  15. 滅菌器具で生存手術を行います。どちらのメーカーの推奨またはオートクレーブに応じて消毒剤で楽器を浸します。使用するための準備ができている基本的な無菌の消耗品を使用してください。
  16. 無菌区域の汚染を防ぐために機能に応じて個別の楽器。
  17. 動物の肝臓にアクセスするために切開部位の周囲に約1インチ(正中切開)を剃ります。手術部位から離れた動物から毛を削除します。
  18. シェービング後、せっけん消毒剤(ベタジン外科的スクラブ)の領域をスクラブし、滅菌PBS溶液で余分な消毒剤を洗い流します。約5分を持続全体スクラブプロセスで、この数回を実行します。削除し、使用する手袋を廃棄しました。
  19. その後、このようなsurgicなどの防護服に変更アルガウン、スクラブトップ、およびフェイスマスク。次に、手術用手袋の上に置く前に、適切なスクラブ液で手を消毒します。注意:これは脱落し、潜在的な汚染物質と手術部位の汚染を防止するために必要なステップです。

2.手術

  1. 麻酔の全期間を通じて暖かさのための外部熱源を提供します。麻酔は、体温調節の乱れの原因となるため、動物は、いくつかの低体温症が発生する可能性があります。従って、体温を維持します。
  2. 手術を通して、その背中の上にマウスを置きます。
  3. サージカルテープの作品で手術テーブルにフォア手足、後肢およびマウスの尾を修正。
  4. xyphisternumにすぐに劣る直線切開を行います。
  5. 肝臓を露出させ、滅菌自己保持手術用開創器を使用してください。
  6. シリンジはゆっくりと慎重に、20G針を有する5×10 6 BNL 1ME A.7R.1を含む100μlのPBSを注入肝臓の右葉にマウスHCC細胞。
  7. 針を除去した後、原因肝臓の高い血管分布に任意の潜在的な出血を止めるために、少なくとも1分間滅菌綿棒を適用します。
  8. 外科用クリップを用いて皮膚の閉鎖に続いて吸収性縫合糸で皮下組織を閉じます。その後、ベータダインスクラブで再び傷をきれいにします。注意:これは、手術創の閉鎖を保証します。
  9. 皮下に生理食塩水を100μlを与えます。

3.手術後

  1. すぐに手術後、マウス条件の世話人を通知するために、手術後のIDカードできれいにケージにマウスを転送します。食料と水を提供します。注:最初の24時間の期間後に手術のためのウェットフードと水を単独で収容された場合は、当社の経験では、ちょうど手術を受けたマウスは最高の運賃になります。
  2. 38ºCを超えない熱を発生する熱ランプで動物を暖かく保ちます。 Uマウスが完全に回復するまで、温度を測定する温度計をSE。
  3. ハウスの快適性を確保するために、紙の寝具と好ましくはケージ内の動物。
  4. 最初の回復後、不快感、出血、痛みや苦痛の徴候のために動物を監視します。痛みを和らげるためにブプレノルフィン(0.05 -0.1ミリグラム/キログラム)を与えます。密接に約2時間の活動、行動、外観だけでなく、水や食料の消費量を監視します。歩行した場合、マウスを定期的に通常の住宅のためのバックエリアに動物を移動し、24時間後に手術のために6-12時間間隔で監視し続けます。必要に応じて重量チェックを実行します。
  5. しかし、動物が療養問題を抱えている場合、適切な支持療法の行動を取ります。マウスは回復できない場合は、人道的に、CO 2窒息と頸椎脱臼を経由して、マウスを安楽死させます。安楽死のために承認された機関のガイドラインに従ってください。
  6. 手術後、通常observabあるHCCの臨床的証拠をチェックしますルボディコンディションスコアの大幅な削減など。注:この時点では、原発腫瘍は、おそらく肝臓で開発しており、転移性預金は、おそらく肺に開発しました。
  7. この時点で、人道的な安楽死によって実験に関与し(実験及びコントロール)すべてのマウスを生け贄に捧げます。二酸化炭素窒息にマウスを件名:非常にゆっくりと5〜10分かけてチャンバー内に二酸化炭素を放出します。これは、呼吸停止の原因となります。

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Representative Results

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Balb / cマウスの肝臓は、5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を移植しました。 HCC開発の臨床的証拠は63日、手術後に観察しました。これにより、マウスを人道的に安楽死させました。剖検を安楽死させたマウスで行いました。肺と肝臓を切除し、慎重な肉眼的検査は肉眼で見える腫瘍を同定するために実施しました。 1マウスでは、表在性腫瘍は腹壁( 図1A)にはいくつかのファイルが添付された肝臓の表面に観察されました。 2番目のマウスでは、異常に見える肝臓を観察しました。異常が非常に強く表在性腫瘍( 図1B)のように見えます。予想されるようにコントロールマウスからの肝臓( 図1D)、肺( 図1E)によって証明されるように、BNL 1ME A.7R.1 HCC細胞の移植なしで対照群のマウスには、何の腫瘍を発症していません。また、腫瘍を有するマウスからの肺はやや異常に見えた、ディスプレイ出血性壊死のる領域( 図1C)。以前の経験に基づいて、これらの肺は、転移性預金3を抱くことがあります。

図1
腫瘍および転移の図1.総審査。Balb / cマウス5×10 6 BNL 1ME A.7R.1腫瘍細胞を移植し、63日後に安楽死させました。観察された代表的な肝腫瘍を撮影し、ここで示された。(A及びB)の両方の表在性肝腫瘍を示す。(C)は、腫瘍細胞を移植したマウス由来の肺(D)対照マウスの肝臓を表示する。(E)対照の肺を示しマウス。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


一旦麻酔肝細胞癌の転移の「患者様」同所同系マウスモデルの方法論の図2の回路図は 、マウスの肝臓を、5 X 106 BNL 1ME A.7R.1マウス肝細胞癌(HCC)細胞を移植されています。 HCCの臨床的証拠が観察された場合、動物は(経皮的心臓内瀉血と頸椎脱臼に続いて二酸化炭素窒息にかけ、)人道的な安楽死によって犠牲にされています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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この記事では、この方法の詳細な説明は、( 図2)ことが最近OgunwobiとHCC転移の同所性同系マウスモデルの確立に成功の同僚によって報告された与えられている3。この手順のために、腫瘍の取り込み率は、一般的に高いです。我々は以前の100%3の腫瘍取り込み率を観察しました。しかし、テイク率は研究者の能力に応じて可変とすることができます。トレーニングの下に新しい大学院生によって行われた最近の実験では、腫瘍取り込み率は40%と低かったです。ほとんどの実験は4で終了しているが - 3週間 - ボディコンディションスコアの低下に起因する6週間、私たちは、原発腫瘍が2によって確立することができる同一のマウスに同じ細胞の皮下移植の経験から考えています。私たちは通常、成功した実験から1つの腫瘍結節を見ることを期待します。我々は肺転移が4との間に発展することを期待が、そして - 6週間、それはcon​​ceivです肝臓内の腫瘍がかなり早い時期に起こり得ることができます。

良い外科技術と無菌状態は、この生存手術方法の成功に不可欠です。生存手術のために使用したマウスは健康でなければなりません。前と術後を計量することをお勧めします。で使用したマウスの手術前の重み平均または最新の実験は18グラム、実験終了時点で(63日後外科的移植)であったそれらの平均重量はわずか22グラムでした。腫瘍から全身疾患による体重増加は劣化があったので、その期間中の体重のわずか4グラムの利得が可能性があります。我々は実験を通じて週に1回または2回、マウスの体重を測定していた我々は、こののより客観的な評価を持っていただろう。これは、ベストプラクティスをお勧めします。

図2にまとめたように、マウスが十分に痛みaを避けるために、手術前と手術の期間を通して麻酔する必要があります ND苦痛。領域はすべて乱雑の自由であるべきであり、アクセスは手術を行うものに利用可能であるべきです。手術のエリアだけでなく、使用される機器の両方がすべて無菌であるべきです。

移植の成功のための重要なステップは、移植されるようにBNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞の製造です。製剤中に、コンフルエントな細胞培養皿からの細胞の収集の汚染を避けるために重要です。これらの手順は、無菌条件下で細胞培養フード内で行われるべきです。細胞数はまた、5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を100μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に再懸濁されたマウスあたりの滅菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブに回収されていることを確認するために行われるべきです。トリパンブルー染色はまた、必要に応じて、細胞の生存能力を確認するために行うことができます。これらの細胞は、マウスの肝臓に移植する前に、もはや2時間以上氷上に維持されるべきではありません。

_content ">がん細胞の移植が原因で肝臓のデリケートな性質( 図2)に注意して取り扱ってください。癌細胞の注入中に、肝臓全体を通過する針をもたらす可能性が深すぎる穿刺を避けます。それは、一方で、注射前に針で浅すぎる穿刺の可能性が高い腹腔内に出て注入された癌細胞の流出の原因となります。また、針を除去した後、ゆっくりと慎重に癌細胞を注入することが不可欠ですブリードアウト臓器の電位が、その高い血管分布に常に存在する。そのため、少なくとも1分間滅菌綿棒を適用することを推奨します。ケアと注意が移植の成功率が最も高い保証されます。動物も提供されるべきです低体温などの手続きを通じて外部熱源が麻酔中体温調節の乱れを引き起こす主要な関心事である。手術後、動物はのために監視する必要があります不快感や痛みの兆候は、その時点で適切なケアを投与すべきです。マウスが手術から回復することができない場合は、人道的に安楽死させるべきです。

癌転移は、がんからの死亡の主な原因であるとして、それは血行性播種2-4のメカニズムを描写することが重要です。新規循環腫瘍細胞は、肝細胞癌の転移3のこの同所同系マウスモデルから確立されました。また、このモデルから派生したCTCは、一貫して増加し、腫瘍の開始と転移能力3を示しています 。この方法を用いて単離した循環腫瘍細胞は、それらが特定の分子要因、マーカーおよび癌転移2-4の可能な治療標的を解明するのに役立つように、非常に重要になるかもしれません。この方法は、すでにと比較して、循環腫瘍細胞における肝細胞増殖因子(HGF)およびその受容体のc-Metのアップレギュレーションが増加していることを識別しましたHCC 3の原発性腫瘍細胞。これらの結果は、腫瘍転移の重要な側面は、上皮間葉移行2-4,10の細胞プロセスであることが実証された以前の研究に基づいて構築。この新規モデルを用いたさらなる特徴循環腫瘍細胞は、このように、HCC 1-3,10のより効果的な管理の開発に至る過程を促進する因子の複雑なメカニズムの理解を深めます。

現在、最も広く使用される動物腫瘍モデルは、ヒト腫瘍細胞は、免疫不全マウスに移植されたマウス異種移植腫瘍モデルです。それは同系であり、したがって、腫瘍転移3における免疫系の役割を研究するのに適しているため、この記事で説明したモデルは、重要な利点を有します。このモデルは、単離培養し、生存可能な循環腫瘍細胞3を研究するための高度に再現可能であることが証明されました。それは、従って、tremenましたスクリーニング、診断、予後判定、治療モニタリング及び新規治療戦略の発見などの臨床応用を評価するためのdous電位。上記の方法論の限界は、マウスに移植BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞のかなりの部分を存続が不可能となり、したがって、細胞のわずかな部分がで腫瘍の導入で実行可能と熟達になるということですセカンダリサイト3。我々は、マウス当たり5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞の初期の注入によって、この制限を占めています。

結論として、転移性固形臓器癌のこの同所同系マウスモデルは、癌患者3の血中の循環腫瘍細胞の転移能力の基礎となる生物学的メカニズムを解明するための優れたプラットフォームを提供します。癌転移がHEMAを経由して主に発生するので、これが今度はおそらく癌転移のメカニズムに新たな洞察を流しますtogenousは11-13を広げます 。このように癌転移のメカニズムに得られた新規の洞察は、新規の有益な臨床アプリケーション3,14,15の発展に重要になります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Tweezer  Roboz (RS-5040) Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip Roboz (RS-5111) 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6501) Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6503) Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors) Roboz (RS-6466) 80 mm/3 inch scale, chrome plated 
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp Roboz (RS-5852) 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures Roboz (RS-9861-36)
Scalpel handle  Roboz (RS-9884) Solid
Littauer Stitch Sissors Roboz (RS-7074) Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying Roboz (RS-7960) Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier Roboz (RS-9262) safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid Roboz RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade Roboz (RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer Roboz Ds-400, Ds-401, DS-501 For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec. 
Microinjection needles VWR BD305125 25G Needle

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References

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Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).More

Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).

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