A "paziente-Like" ortotopico Singenico modello murino della carcinoma epatocellulare Metastasi

Summary

La diffusione metastatica del cancro è la principale causa di decessi correlati al cancro. Forniamo una descrizione approfondita della nostra metodologia chirurgia sopravvivenza per stabilire un modello di sistema ortotopico singenici mouse "paziente-tipo" per lo studio dei meccanismi di metastatizzazione dei tumori di organi solidi.

Protocol

Etica Dichiarazione
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) di Hunter College della City University di New York.

Nota: Otto topi BALB / c sono stati usati in questa procedura sperimentale. Cinque topi BALB / c sono stati impiantati con 5 ^x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 topo cellule di carcinoma epatocellulare per produrre i tumori primari. Tre topi BALB / c senza implantologia sono stati utilizzati come controlli. BNL 1ME A.7R.1 è una linea di cellule murine carcinoma epatocellulare che è stato derivato per trasformazione chimica dal murino non tumorigeniche linea cellulare di epatociti BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 è stato ottenuto dalla American Type Culture Collection (ATCC).

1. Pre-chirurgia

1. Assicurarsi che i topi per tutti gli interventi chirurgici di sopravvivenza sono in buona salute. Per assicurare che i topi sono sani, ispezionare segni di disidratazione tenting della pelle. Non usare i topi con qualsiasi evidenza di malattia o distress in questi esperimenti.
2. Pesare topi per garantire che non siano sottopeso. Assicurarsi che il peso è di almeno 16-20 grammi.
3. Preparare 5 × ¹⁰ 6 BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC per l'impianto per il mouse:
   1. Aspirare i media da 10 ml 60% - piatto di coltura di cellule confluenti il ​​70% delle cellule di carcinoma epatico di topo A.7R.1 BNL 1ME. Lavare due volte con 5 ml di PBS. Aggiungere 2 ml di tripsina al piatto e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato con aria e 5% di CO _{2 per} 5 min.
   2. Successivamente, pipette 10 ml tripsinizzate cellule in un emocitometro manuale per il conteggio delle cellule al microscopio a ingrandimento di 10X. Contare il numero totale di cellule trovate nei quattro angoli piazzali e moltiplicare il fattore di diluizione per il numero totale di cellule. Poi, dividere per il numero di quadrati contati e moltiplicare per 10 ⁶ per la concentrazione cellulare (cellule per ml).
   3. Utilizzando il calcolo, raccogliere 5 milioni di cellule per topo in sterili1,5 ml microprovette. Etichettare provette da 1,5 ml microcentrifuga.
4. Risospendere le 5 × 10 ⁶ celle BNL 1ME A.7R.1 topo HCC in 100 ml di tampone fosfato salino (PBS). Tenere queste cellule in ghiaccio fino impianto in chirurgia.
5. Svolgere attività necessarie per la preparazione di topi per la chirurgia come l'induzione dell'anestesia e capelli clipping lontano da attrezzature e materiali sterili per evitare la contaminazione.
6. Un'anestesia generale nei topi per inalazione di isoflurano utilizzando un vaporizzatore isoflurano con ossigeno ad un flusso costante concentrazione di 1 L per min (circa. 2,1%). Nota: Il sistema è autosufficiente, e comprende un vaporizzatore di precisione, un apporto di ossigeno e un contenitore di carbone che è collegato a un circuito di respirazione necessario per gas / anestetici scavenging.
7. Assicurarsi che l'anestesia sia adeguata per evitare che l'animale da subire dolore durante l'intervento chirurgico. Eseguire toe-pinch e osservare animali per non responsiveness per confermare l'anestesia.
8. A quel tempo, cambiare la linea di valvole, la guarnizione alla casella e aperto al cono.
9. Appena il mouse è anestetizzato, applicare una piccola quantità di una pomata oftalmica alle cornee come misura preventiva da essiccazione e danni.
10. Successivamente, spostare l'animale alla zona di preparazione, con l'ogiva correttamente posizionati e connessi (per anestesia di mantenimento). Preparare il sito della incisione chirurgica per la chirurgia depilatoria in questa zona di preparazione.
11. Assicurarsi che l'area di chirurgia è in una posizione libera di ogni altra attività.
12. Assicurarsi che la superficie di lavoro è robusta e adeguatamente igienizzati, unsoiled e prima della chirurgia senza matasse di cavi. Posizionare un pezzo sterile lino o tray chirurgico su di esso.
13. Assicurarsi che il campo operatorio è disponibile solo per persone che effettuano l'intervento chirurgico. Assicurarsi che la sala operatoria è pulita e spazzata con un detergente appropriato e spruzzato con un adeguato disinfectant.
14. Assicurarsi che sia posizionato anche lontano da porte e finestre, come le correnti d'aria può diffondere la polvere che porta alla contaminazione del sito.
15. Eseguire l'intervento chirurgico di sopravvivenza con strumenti sterili. O immergere gli strumenti in un disinfettante secondo le raccomandazioni del fabbricante o in autoclave. Utilizzare materiali sterili di base che sono pronti per l'uso.
16. Strumenti separati in base alla funzione per aiutare a prevenire la contaminazione delle aree sterili.
17. Shave circa 1 pollice intorno al sito di incisione (incisione mediana) per accedere al fegato dell'animale. Rimuovere il pelo dall'animale lontano dal sito chirurgico.
18. Dopo la rasatura, strofinare la zona con un disinfettante e sapone (betadine scrub chirurgico) e lavare il disinfettante in eccesso con la soluzione di PBS sterile. Eseguire questo più volte, con l'intero processo di macchia della durata di circa 5 minuti. Rimuovere e scartato i guanti usati.
19. In seguito, cambiare per indumenti protettivi, come SurgicAl abito, top scrub e maschera. Avanti, disinfettare le mani con soluzione macchia adeguata prima di indossare guanti chirurgici. Nota: Questo è un passo necessario per evitare spargimento e contaminare il sito chirurgico con potenziali contaminanti.

2. Chirurgia

1. Fornire una fonte di calore esterna per calore durante l'intero periodo di anestesia. L'animale può verificarsi alcuni ipotermia a causa dell'anestesia provoca disturbi di termoregolazione; quindi, mantenere la temperatura corporea.
2. Posare il mouse sulla sua schiena per tutta la chirurgia.
3. Fissare gli arti anteriori, arti posteriori e la coda del mouse al tavolo operatorio con pezzi di nastri chirurgici.
4. Fare una linea di incisione retta immediatamente inferiore al xyphisternum.
5. Utilizzare uno sterile divaricatore chirurgica auto-mantenimento per esporre il fegato.
6. Con una siringa con un ago 20G, lentamente e con attenzione iniettare 100 ml di PBS contenente 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1topo cellule HCC nel lobo destro del fegato.
7. Dopo aver rimosso l'ago, applicare un tampone di cotone sterile per almeno 1 minuto per arrestare qualsiasi sanguinamento potenziale causa dell'alta vascolarizzazione del fegato.
8. Chiudere il tessuto sottocutaneo con una sutura assorbibile seguita da chiusura pelle con clip chirurgiche. Successivamente, pulire la ferita ancora una volta con betadine scrub. Nota: Ciò garantirà la chiusura della ferita chirurgica.
9. Sottocutanea dare 100 ml di soluzione fisiologica.

3. Post-chirurgia

1. Subito dopo l'intervento chirurgico, trasferire il mouse in una gabbia pulita con una carta d'identità post-operatorio per notificare custodi della condizione del mouse. Fornire cibo e acqua. Nota: Nella nostra esperienza, un mouse che ha appena subito un intervento chirurgico se la passeranno meglio se alloggiati solo con cibo umido e acqua per il periodo di 24 ore dopo il primo intervento chirurgico.
2. Tenere il caldo animale con una lampada di calore che genera calore non supera 38 ° C. USE un termometro per misurare la temperatura fino a quando il mouse è completamente recuperato.
3. Casa l'animale in una gabbia, preferibilmente con biancheria da letto di carta per assicurare il comfort.
4. Dopo il recupero iniziale, monitorare l'animale per segni di disagio, sanguinamento, dolore e angoscia. Dare buprenorfina (0,05 -0.1 mg / kg) per alleviare il dolore. Strettamente monitorare l'attività, comportamento e l'aspetto, così come l'acqua e il consumo di cibo per circa 2 ore. Se ambulatoriale, spostare l'animale torna alla zona per regolare un alloggio normale di topi e di continuare a monitorare a intervalli 6-12 hr per la post-operatorio 24 ore. Eseguire un controllo del peso se lo si desidera.
5. Tuttavia, se l'animale sta avendo problemi recuperare, adottare le adeguate misure terapeutiche di supporto. Se i topi sono in grado di recuperare, umanamente eutanasia topi via di CO ₂ asfissia e dislocazione cervicale. Seguire le linee guida istituzionali approvate per l'eutanasia.
6. Post-operatorio, verificare la presenza di segni clinici di HCC che di solito è observable come significativa riduzione del body condition score. Nota: A questo punto, un tumore primario ha probabilmente sviluppato nel fegato e depositi metastatici hanno probabilmente sviluppata nei polmoni.
7. A questo punto, sacrifica tutti i topi (sperimentale e di controllo) coinvolti nella sperimentazione per eutanasia umana. Sottoporre i topi all'anidride carbonica asfissia: molto lentamente rilasciare biossido di carbonio nella camera per un periodo di 5 -10 min. Ciò causerà arresto respiratorio.

Representative Results

Il fegato dei topi Balb / c sono stati impiantati con 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC. L'evidenza clinica di sviluppo HCC era osservabile 63 giorni dopo l'intervento. Di conseguenza, i topi sono stati umanamente eutanasia. Necroscopia è stata effettuata su topi eutanasia. I polmoni e il fegato sono stati asportati e un esame attento lordo è stata effettuata per identificare i tumori macroscopiche. In un mouse, un tumore superficiale è stata osservata sulla superficie del fegato con qualche attacco alla parete addominale (Figura 1A). In un secondo mouse, è stato osservato un fegato anormalmente aspetto. L'anomalia appare molto forte come un tumore superficiale (Figura 1B). Come previsto, i topi del gruppo di controllo senza alcun impianto di cellule BNL 1ME A.7R.1 HCC sviluppato nessun tumore, come evidenziato da un fegato (Figura 1D) e polmoni (Figura 1E) da un topo di controllo. Inoltre, i polmoni di topi con tumori visto qualcosa di anormale, visualizzazionearee ing di necrosi emorragica (Figura 1C). Sulla base di esperienze precedenti, questi polmoni possono ospitare depositi metastatici ^3.

Figura 1. Esame lordo di tumore e metastasi. Topi Balb / c sono stati impiantati con 5 ^x 10 6 cellule tumorali BNL 1ME A.7R.1 e eutanasia 63 giorni più tardi. Tumori del Rappresentante del fegato osservati sono stati fotografati e mostrato qui. (A e B) entrambi mostrano tumori epatici superficiali. (C) è polmoni dalle cellule tumorali topi impiantati. (D) visualizza il fegato di un topo di controllo. (E) indica i polmoni di un controllo mouse. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Schema della metodologia di un modello di topo singenici ortotopico "paziente-like" di carcinoma epatocellulare metastasi. Una volta anestetizzato, fegato di topo è impiantato con 5 X 106 BNL 1ME topo A.7R.1 carcinoma epatocellulare (HCC), le cellule. Quando evidenza clinica di carcinoma epatocellulare è osservabile, animale viene sacrificato per eutanasia umana (sottoposto ad anidride carbonica per asfissia, seguito da dissanguamento percutanea intracardiaca e dislocazione cervicale). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo articolo viene fornita una descrizione approfondita del metodo che è stato recentemente riportato da Ogunwobi e colleghi di successo creazione di un modello di topo singenici ortotopico di HCC metastasi (Figura 2) ^3. Il tasso di tumori per questa procedura è generalmente elevata. Abbiamo già osservato un tasso di tumore al ^100% 3. Tuttavia, il tasso di utilizzo può essere variabile a seconda della competenza del ricercatore. In un recente esperimento condotto da un nuovo studente laureato in formazione, il tasso di tumore è stato a partire da 40%. Sebbene la maggior parte degli esperimenti sono terminati a 4 - 6 settimane dovuto declinare nel punteggio di condizione corporea, crediamo che l'esperienza con impianto sottocutaneo delle stesse cellule nella stessa topi che i tumori primari possono essere stabilite da 2 - 3 settimane. Noi di solito aspettiamo di vedere un tumore del nodulo da un esperimento riuscito. E anche se ci aspettiamo metastasi polmonari di sviluppare tra i 4 - 6 settimane, è conceivgrado che del tumore nel fegato può avvenire molto prima.

Buone tecniche chirurgiche e condizioni asettiche sono essenziali per il successo di questo metodo di operazione sopravvivenza. I topi utilizzati per la chirurgia sopravvivenza devono essere in buona salute. Pesatura pre e post-operatorio è una buona pratica. I pesi medi pre-chirurgia dei topi utilizzati o più recente esperimento era 18 grammi, e al punto finale sperimentale (63 giorni dopo l'impianto chirurgico) il loro peso medio era di soli 22 grammi. Un guadagno di soli 4 grammi di peso durante questo periodo di tempo è probabilmente perché c'era un certo calo in aumento di peso a causa di malattia sistemica dal tumore. Avremmo avuto una valutazione più obiettiva di questo aveva abbiamo misurato il peso del mouse una volta o due volte alla settimana per tutto l'esperimento. Questo è consigliata migliori pratiche.

Come riassunto nella Figura 2, i topi dovrebbero essere adeguatamente anestetizzati prima dell'intervento e per tutto il periodo di intervento chirurgico per evitare il dolore un angoscia nd. L'area dovrebbe essere libera da ogni disordine, e l'accesso dovrebbe essere solo a disposizione di coloro che svolgono l'intervento chirurgico. Sia l'area chirurgia nonché gli strumenti utilizzati dovrebbero essere sterili.

Un passo fondamentale per il successo dell'impianto è la preparazione delle cellule del mouse HCC BNL 1ME A.7R.1 da impiantare. Durante la preparazione, è fondamentale per evitare la contaminazione della raccolta delle cellule da colture cellulari confluenti piatti. Questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare in condizioni sterili. Un conteggio delle cellule dovrebbe essere fatto anche per garantire 5 × 10 ⁶ celle BNL 1ME A.7R.1 topo HCC sono stati raccolti in una provetta sterile da 1,5 ml microcentrifuga per mouse che è risospeso in 100 ml tampone fosfato salino (PBS). Trypan blue colorazione può essere eseguita anche opzionalmente per confermare la vitalità delle cellule. Queste cellule devono essere tenuti in ghiaccio non più di 2 ore prima dell'impianto nel fegato di topi.

_content "> L'impianto delle cellule tumorali deve essere maneggiato con cura a causa della natura delicata del fegato (Figura 2). Durante l'iniezione delle cellule tumorali, evitare troppo profonda una foratura che può provocare l'ago passa attraverso tutto il fegato . E 'essenziale per iniettare le cellule tumorali lentamente e con attenzione. D'altra parte, troppo superficiale una puntura con l'ago prima dell'iniezione probabilmente causare la fuoriuscita delle cellule tumorali iniettate nella cavità peritoneale. Inoltre, dopo aver rimosso l'ago, c'è sempre un potenziale dell'organo sanguinamento a causa della sua elevata vascolarizzazione. Pertanto, applicando un tampone di cotone sterile per almeno 1 min è raccomandata. Cura e attenzione garantirà il più alto tasso di successo dell'impianto. L'animale deve essere fornito un fonte esterna di calore in tutta la procedura di ipotermia è una delle principali preoccupazioni causare disturbi di termoregolazione durante l'anestesia. post-chirurgia, l'animale deve essere monitorato pereventuali segni di disagio o dolore a quel punto adeguate cure deve essere somministrato. Se il mouse è in grado di recuperare dalla chirurgia, dovrebbe essere umanamente eutanasia.

Come metastasi del cancro è la causa principale di mortalità da cancro, è fondamentale per delineare i meccanismi di diffusione ematogena ^2-4. Nuove cellule tumorali circolanti sono state stabilite da questo ortotopico modello singenici murino di HCC metastasi ^3. Inoltre, i CTC derivati ​​da questo modello sempre mostrano un aumento iniziazione tumorale e la capacità metastatica ^3. Le cellule tumorali circolanti isolate con questo metodo potrebbe rivelarsi molto importante in quanto aiutano a svelare i fattori molecolari specifici, marcatori e possibili bersagli terapeutici di metastasi del cancro ^2-4. Questa metodologia è già identificato che vi è un aumento del fattore di crescita upregulation epatociti (HGF) e il suo recettore, c-Met in cellule tumorali circolanti rispetto aile cellule del tumore primario di HCC ^3. Questi risultati si basano sul precedente lavoro dimostrare che un aspetto importante di metastasi tumorali è il processo cellulare di epitelio-mesenchimale transizione ^2-4,10. Ulteriori caratterizzanti cellule tumorali circolanti utilizzando questo romanzo modello aumenteranno la nostra comprensione dei complessi meccanismi di fattori che favoriscono il processo determinando in tal modo lo sviluppo di una gestione più efficace del carcinoma epatocellulare ^1-3,10.

Attualmente, i modelli tumorali animali più usati sono modelli di tumore xenotrapianto di topo in cui le cellule tumorali umane sono impiantati in topi immunodeficienti. Il modello descritto in questo articolo presenta vantaggi importanti perché è singenici ed è pertanto adatto per studiare il ruolo del sistema immunitario in metastasi tumorali ^3. Questo modello ha dimostrato di essere altamente riproducibile per isolare, coltura e lo studio di cellule tumorali circolanti vitali ^3. Si ha pertanto tremenpotenziale dous per valutare le applicazioni cliniche, come lo screening, la diagnosi, la prognosi, il monitoraggio della terapia e la scoperta di nuove strategie terapeutiche. Una limitazione della metodologia sopra descritta è che una parte significativa di cellule di carcinoma epatico di topo A.7R.1 BNL 1ME impiantato in topi sarà in grado di sopravvivere e quindi solo una piccola parte delle cellule sarà vitale e abili a introdurre i tumori a siti secondari ^3. Ci conto per questa limitazione di impianto iniziale di 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 cellule del mouse HCC per mouse.

In conclusione, questo modello ortotopico singenici murino di cancro metastatico organo solido fornisce una buona piattaforma per chiarire i meccanismi biologici alla base della capacità metastatica delle cellule tumorali circolanti nel sangue di pazienti affetti da cancro ^3. Questo a sua volta probabilmente gettare nuove informazioni sui meccanismi di metastasi tumorali perché metastasi del cancro avviene principalmente per via Hematogenous diffuse ^11-13. Nuove conoscenze acquisite in tal modo nei meccanismi di metastasi tumorali sarà fondamentale per lo sviluppo di nuove applicazioni cliniche benefiche ^3,14,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Tweezer	Roboz	(RS-5040)	Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip	Roboz	(RS-5111)	1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs)	Roboz	(RS-6501)	Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs)	Roboz	(RS-6503)	Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors)	Roboz	(RS-6466)	80 mm/3 inch scale, chrome plated
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp	Roboz	(RS-5852)	23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures	Roboz	(RS-9861-36)
Scalpel handle	Roboz	(RS-9884)	Solid
Littauer Stitch Sissors	Roboz	(RS-7074)	Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying	Roboz	(RS-7960)	Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier	Roboz	(RS-9262)	safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid	Roboz	RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade	Roboz	(RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer	Roboz	Ds-400, Ds-401, DS-501	For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec.
Microinjection needles	VWR	BD305125	25G Needle