Summary
Den metastatiske spredning af cancer er den vigtigste årsag til cancerrelaterede dødsfald. Vi leverer en grundig beskrivelse af vores overlevelse kirurgi metode til at etablere en "patient-lignende" ortotopisk syngenisk musemodel system til at studere mekanismerne i metastaser i faste organer tumorer.
Protocol
Etik Statement
Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Hunter College of The City University of New York.
Bemærk: Otte BALB / c-mus blev anvendt i denne eksperimentelle procedure. Fem BALB / c-mus blev implanteret med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse hepatocellulært carcinom celler til at producere de primære tumorer. Tre BALB / c-mus uden implantationer blev anvendt som kontroller. BNL 1ME A.7R.1 er et murint hepatocellulært carcinom cellelinie, blev afledt ved kemisk omdannelse fra den murine non-tumorigen hepatocyt cellelinie BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC).
1. Pre-kirurgi
- Sørg for, at mus for alle overlevelse kirurgi er sunde. For at sikre, at mus er sunde, inspicere tegn på dehydrering ved udspiling af huden. Brug ikke mus med tegn på sygdom eller distress i disse eksperimenter.
- Mus vejer for at sikre, at de ikke er undervægtige. Sørg for, at vægten er mindst 16-20 gram.
- Forbered 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse HCC-celler til implantation per mus:
- Aspirer medier fra en 10 ml 60% - 70% sammenflydende celledyrkningsskål af BNL 1ME A.7R.1 muse HCC-celler. Vask to gange med 5 ml PBS. Tilsæt 2 ml trypsin i skålen og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet inkubator med luft og 5% CO2 i 5 minutter.
- Efterfølgende pipette 10 pi trypsinbehandlet celler i en manuel hæmocytometer til celletælling under et mikroskop ved forstørrelse på 10X. Tæl antallet af celler, som findes i de fire store hjørne kvadrater og formere fortyndingsfaktoren med det samlede antal celler. Derefter dividere med antallet af firkanter tælles og gange med 10 6 til cellekoncentrationen (celler pr ml).
- Anvendelse af den beregning, der opsamles 5 millioner celler per mus i sterilt1,5 ml mikrocentrifugerør. Label 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Resuspender 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse HCC-celler i 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS). Hold disse celler på is indtil implantation i kirurgi.
- Udføre aktiviteter til forberedelse af mus for kirurgi såsom anæstesi induktion og hår klipning væk fra sterilt udstyr og materialer for at undgå forurening.
- Inducere generel anæstesi i mus ved inhalation af isofluran ved hjælp af en isofluran fordamper sammen med oxygen ved en konstant koncentration strømningshastighed på 1 l pr min (ca. 2,1%). Bemærk: Systemet er selvhjulpne, og omfatter en præcision fordamper, en ilt forsyning og en kul beholder, der er knyttet til en vejrtrækning kredsløb behov for gas / narkose latrintømning.
- Sikre, at bedøvelse er tilstrækkelig til at forhindre dyret i at undergå smerte under operationen. Udfør tå-pinch og observere dyr for ikke-Responsiveness at bekræfte anæstesi.
- På det tidspunkt skifter ventilen linje, forsegling til kassen og åben for næsekeglen.
- Så snart musen er bedøvet, anvende en lille mængde af en oftalmisk salve til hornhinderne som en forebyggende foranstaltning mod udtørring og skader.
- Efterfølgende flytte dyret til forberedelse område, med næse kegle korrekt placeret og tilsluttet (til vedligeholdelse af anæstesi). Forbered stedet for kirurgisk snit til operation ved hårfjerning på dette forberedelse område.
- Kontroller, at området for kirurgi er på et sted fri for al anden aktivitet.
- Sørg for, at arbejdet overflade er robust og hensigtsmæssigt desinficeret, unsoiled og rod-fri før operationen. Placer en steril stykke linned eller kirurgisk bakke over den.
- Sørg for, at den operative felt er tilgængelig for kun personer, der udfører operationen. Sørg for, at den kirurgiske værelse er rengøres og fejede med en passende rengøringsmiddel og sprøjtes med en passende disinfectant.
- Sørg for, at den også er placeret væk fra døre og vinduer som luftstrømme kan sprede støv, der fører til forurening af sitet.
- Udfør overlevelse operation med sterile instrumenter. Enten suge instrumenter i et desinfektionsmiddel i henhold til producentens anbefaling eller autoklave. Bruge grundlæggende sterile forsyninger, der er klar til brug.
- Særskilte instrumenter efter funktion for at hjælpe med at forhindre forurening af sterile områder.
- Barbere ca. 1 inch omkring stedet for indskæring (midtlinieincision) for at få adgang til leveren hos dyret. Fjerne hår fra dyret væk fra stedet for kirurgi.
- Efter barbering, krat området med en sæbevand desinfektionsmiddel (betadine kirurgisk krat) og vask den overskydende desinfektionsmiddel bort med sterilt PBS løsning. Udfør dette flere gange, med hele krat processen varer cirka 5 minutter. Fjern og kasseret de brugte handsker.
- Bagefter, skifte til beskyttelsesbeklædning såsom havnen kirurgial kjole, krat top, og ansigtsmaske. Dernæst desinficere hænder med ordentlig krat løsning, inden du tager kirurgiske handsker. Bemærk: Dette er et nødvendigt skridt for at forhindre kaste og forurene operationsstedet med potentielle kontaminanter.
2. Kirurgi
- Giv en ekstern varmekilde til varme i hele perioden af anæstesi. Dyret kan opleve nogle hypotermi, fordi bedøvelse forårsager forstyrrelser af termoregulering; derfor opretholde kroppens temperatur.
- Læg musen på ryggen hele operationen.
- Fastgør Forlemmerne, bagben og hale på musen til operationen bordet med stykker af kirurgiske bånd.
- Lav en lige linje snit umiddelbart ringere end den xyphisternum.
- Brug en steril selvtilbageholdende kirurgisk spærhage at eksponere leveren.
- Med en sprøjte med en nål 20G, langsomt og forsigtigt injicere 100 pi PBS indeholdende 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1muse HCC-celler i højre lap af leveren.
- Efter fjernelse af nålen, anvendes en steril vatpind i mindst 1 minut for at stoppe enhver potentiel blødning på grund af høj vaskularitet af leveren.
- Luk subkutane væv med en absorberbar sutur efterfulgt af lukning huden ved hjælp af kirurgiske klemmer. Efterfølgende rense såret igen med betadine krat. Bemærk: Dette vil sikre lukning af operationssåret.
- Subkutant giver 100 pi normal saltopløsning.
3. Post-kirurgi
- Umiddelbart efter operationen, overføre musen til et rent bur med en post-kirurgi identifikationskort at underrette husholdere af muse tilstand. Sørge for mad og vand. Bemærk: Det er vores erfaring, en mus, der har netop gennemgået kirurgi vil klare bedst, hvis opstaldet alene med vådfoder og vand til den indledende 24-timers periode efter operationen.
- Hold dyret varm med en varmelampe, der genererer varme ikke oversteg 38 ºC. USE et termometer til måling af temperatur, indtil musen er fuldt genvundet.
- Hus dyret i et bur helst med papir strøelse for at sikre komfort.
- Efter første opsving, overvåge dyret for tegn på ubehag, blødning, smerte og lidelse. Giv buprenorphin (0,05 -0,1 mg / kg) for at lindre smerter. Nøje overvåge aktiviteten, adfærd og udseende, samt vand og fødeindtagelse for cirka 2 timer. Hvis ambulant, flytte dyret tilbage til området for regelmæssig normale boliger af mus og fortsætte med at overvåge i 6-12 timers intervaller i 24 timer efter kirurgi. Udfør en vægt kontrol, hvis det ønskes.
- Men hvis dyret har problemer komme sig, træffe passende støttende pleje handlinger. Hvis mus ikke er i stand til at komme sig, humant aflive mus via CO 2 kvælning og cervikal dislokation. Følg godkendte institutionelle retningslinjer for eutanasi.
- Post-kirurgi, tjek for kliniske tegn på HCC som normalt observable som signifikant reduktion i huld. Bemærk: På dette tidspunkt, er en primær tumor sandsynligvis udviklet i leveren og metastatiske aflejringer har sandsynligvis udviklet i lungerne.
- På dette tidspunkt, at ofre alle mus (eksperimentel og kontrol) er involveret i forsøg ved human eutanasi. Underkaste mus til kuldioxid kvælning: meget langsomt frigiver kuldioxid ind i kammeret over en periode på 5 -10 min. Dette vil medføre respirationsstop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lever af Balb / c-mus blev implanteret med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse HCC-celler. Kliniske tegn på HCC udvikling kunne observeres 63 dage efter operationen. Derfor blev mus humant aflivet. Obduktion blev udført på de aflivede mus. Lunger og lever blev reseceret og en omhyggelig grov undersøgelse blev udført for at identificere makroskopiske tumorer. I en mus, blev en overfladisk tumor observeret på overfladen af leveren med nogle fastgørelse til bugvæggen (figur 1A). I en anden mus blev en unormalt udseende lever observeret. Abnormitet meget stærkt ligner en overfladisk tumor (figur 1B). Som forventet, mus i kontrolgruppen uden implantation af BNL 1ME A.7R.1 HCC-celler udviklet nogen tumorer, hvilket fremgår af en lever (figur 1D) og lunger (1E) ud fra en kontrol mus. Også lungerne fra mus med tumorer så noget unormalt, displayrende områder af hæmoragisk nekrose (figur 1C). Baseret på tidligere erfaringer, kan disse lungerne havnen metastatiske aflejringer 3.
Figur 1. Gross undersøgelse af tumor og metastase. Balb / c-mus blev implanteret med 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 tumorceller og aflivet 63 dage senere. Repræsentative levertumorer observerede blev fotograferet og vist her. (A og B) viser begge overfladiske levertumorer. (C) er lunger fra tumorceller implanteret mus. (D) viser lever af en kontrol mus. (E) angiver lunger en kontrol mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk af metoden i en "patient-lignende" ortotopisk syngen musemodel af hepatocellulært carcinom metastaser. Når bedøvet, er muselever implanteret med 5 x 106 BNL 1ME A.7R.1 mus hepatocellulært carcinom (HCC) celler. Når kliniske tegn på HCC kan observeres, er dyr ofret af human eutanasi (udsat for kuldioxid kvælning, efterfulgt af perkutan intrakardial forblødning og cervikal dislokation). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel gives en grundig beskrivelse af den metode, der for nylig blev rapporteret af Ogunwobi og kolleger på vellykket etablering af et orthotopisk syngenisk musemodel af HCC metastaser (figur 2) 3. Take sats af tumorer til denne procedure er generelt høj. Vi har tidligere observeret en tumor take på 100% 3. Dog kan take rate være variabel afhængigt af kompetence investigator. I en nylig eksperiment udført af en ny ph.d.-studerende under uddannelse, tumor take satsen var så lav som 40%. Selv om de fleste eksperimenter er opsiges med 4 - 6 uger på grund at falde i huld, mener vi af erfaring med subkutan implantation af de samme celler i den samme mus, primære tumorer kan etableres ved 2 - 3 uger. Vi forventer normalt at se en tumor knude fra en vellykket eksperiment. Og selvom vi forventer lunge metastase at udvikle mellem 4 - 6 uger, er det conceivstand, at tumor i leveren kan ske meget tidligere.
Gode kirurgiske teknikker og aseptiske forhold er afgørende for succes i denne overlevelse kirurgi metode. Mus anvendt for overlevelse kirurgi bør være sunde. Vejning før og efter kirurgi er en god praksis. De gennemsnitlige præoperativ vægte af mus anvendes i eller seneste forsøg var 18 gram, og den eksperimentelle endepunkt (63 dage efter kirurgisk implantation) deres gennemsnitlige vægt var kun 22 gram. En gevinst på kun 4 gram vægt under denne periode sandsynligvis fordi der var nogle fald i vægtforøgelse på grund af systemisk sygdom fra tumoren. Vi ville have haft en mere objektiv vurdering af dette havde vi målte musevægt én eller to gange om ugen under hele forsøget. Dette anbefales bedste praksis.
Som opsummeret i figur 2, bør være tilstrækkeligt mus bedøvet før operationen og i hele den periode, operation for at undgå smerter en nd nød. Området skal være fri for al rod, og adgang bør kun være tilgængelige for dem, der udfører operationen. Både kirurgi området samt de anvendte instrumenter bør alle være sterile.
Et afgørende skridt for succes i implantation er forberedelsen af BNL 1ME A.7R.1 musen HCC celler, der skal implanteres. Under forberedelsen, er det afgørende at undgå forurening af indsamling af cellerne fra sammenflydende cellekulturer retter. Disse trin skal udføres i en cellekultur hætte under sterile betingelser. En celletælling bør også gøres for at sikre 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muse HCC-celler er blevet samlet i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør pr mus, resuspenderes i 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS). Trypan blåfarvning kan også eventuelt udføres for at bekræfte levedygtigheden af cellerne. Disse celler skal opbevares på is ikke længere end 2 timer før implantation i lever fra mus.
_content "> Den implantation af kræftcellerne skal håndteres med forsigtighed på grund af den fine karakter af leveren (figur 2). Under injektion af kræftceller, undgå for dybt en punktering, der kan resultere i, at nålen går gennem hele leveren . Det er vigtigt at injicere kræftcellerne langsomt og forsigtigt. På den anden side vil for overfladisk punktering med nålen før injektion sandsynligvis forårsage spild af cancerceller injiceret ud i bughulen. Også efter fjernelse af nålen, der er altid en potentiel af orglet blødning ud på grund af sin høje vaskularitet. Derfor anbefales det at anvende en steril vatpind i mindst 1 min. Pleje og opmærksomhed vil sikre den højeste implantation succes. Dyret bør også gives en eksterne varmekilde hele proceduren som hypotermi er et stort problem forårsager forstyrrelser i termoregulering under anæstesi. Post-kirurgi, bør dyret overvåges fornogen tegn på ubehag eller smerte på hvilket tidspunkt passende pleje bør administreres. Hvis musen ikke er i stand til at komme sig efter operationen, skal det humant aflivet.Som kræft metastaser er den primære årsag til dødsfald af kræft, er det afgørende at afgrænse mekanismerne i hæmatogen spredning 2-4. Nye cirkulerende tumorceller blev etableret fra denne ortotopisk syngeniske musemodel for HCC metastase 3. Desuden CTCs afledt af denne model konsekvent viser øget tumor initiering og metastatisk kapacitet 3. De cirkulerende tumorceller er isoleret ved hjælp af denne metode kan vise sig at være meget vigtige, da de hjælper med at trævle specifikke molekylære faktorer, markører og mulige terapeutiske mål for kræft metastaser 2-4. Denne metode er allerede identificeret, at der er forøget opregulering af hepatocyt vækstfaktor (HGF) og dets receptor, c-Met i cirkulerende tumorceller sammenlignet medde primære tumorceller af HCC 3. Disse resultater bygger på tidligere arbejde som viser, at et vigtigt aspekt af tumormetastasering er den cellulære proces med epitelial-mesenkymale overgang 2-4,10. Yderligere karakteriserende cirkulerende tumorceller ved hjælp af denne roman model vil øge vores forståelse af de indviklede mekanismer i faktorer, der fremmer processen hvilket fører til udviklingen af mere effektiv forvaltning af HCC 1-3,10.
I øjeblikket er de mest anvendte dyretumormodeller er mus xenograft tumormodeller, hvor humane tumorceller implanteret i immune deficiente mus. Beskrevet i denne artikel model har vigtige fordele, fordi det er syngen og er derfor god til at undersøge rollen af immunsystemet i tumormetastase 3. Denne model har vist sig at være meget reproducerbar til isolering, dyrkning og læsning af levedygtige cirkulerende tumorceller 3. Det har derfor tremendous potentiale til evaluering kliniske applikationer som screening, diagnose, prognosticering, overvågning og opdagelse af nye terapeutiske strategier terapi. En begrænsning af ovennævnte metode er, at en betydelig del af BNL 1ME A.7R.1 mus HCC-celler implanteret i musene vil være i stand til at overleve og dermed kun en lille del af cellerne vil være levedygtige og dygtige til at indføre tumorer sekundære sites 3. Vi står for denne begrænsning ved første implantation af 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 musen HCC celler pr mus.
Afslutningsvis denne ortotopisk syngene musemodel af metastatisk kræft fast organ giver en god platform for at belyse de biologiske mekanismer bag den metastatiske evne af cirkulerende tumorceller i blodet hos kræftpatienter 3. Dette vil igen sandsynligvis kaste nye indsigt i mekanismer i kræft metastaser, fordi kræft metastaser sker primært via HEMAtogenous sprede 11-13. Nye indsigter således fået ind i mekanismer i kræft metastaser vil være afgørende for udviklingen af nye gavnlige kliniske anvendelser 3,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz | (RS-5040) | Tip 0.20 x 0.12 mm |
| Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip | Roboz | (RS-5111) | 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6501) | Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm |
| Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) | Roboz | (RS-6503) | Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm |
| Jameson Caliper (Measures tumors) | Roboz | (RS-6466) | 80 mm/3 inch scale, chrome plated |
| Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp | Roboz | (RS-5852) | 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings |
| Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures | Roboz | (RS-9861-36) | |
| Scalpel handle | Roboz | (RS-9884) | Solid |
| Littauer Stitch Sissors | Roboz | (RS-7074) | Length 4.5 inches |
| Brown needle holder, for easy suture tying | Roboz | (RS-7960) | Convex jaw, fine serrations |
| Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier | Roboz | (RS-9262) | safe, secure alternative method of wound closure |
| Instrument tray and lid | Roboz | RT-1350S | |
| Mini-clipper with detachable blade | Roboz | (RS-5903) | |
| Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer | Roboz | Ds-400, Ds-401, DS-501 | For fast decontamination of micro-dissecting instruments. Instruments decontaminate within 15 sec. |
| Microinjection needles | VWR | BD305125 | 25G Needle |
References
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a Chip. 14, 89-98 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Therapeutic and prognostic importance of epithelial-mesenchymal transition in liver cancers: insights from experimental models. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 83, 319-328 (2012).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS One. 8, e63765 (2013).
- Ogunwobi, O. O., Liu, C. Hepatocyte growth factor upregulation promotes carcinogenesis and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via Akt and COX-2 pathways. Clinical and Experimental Metastasis. 28, 721-731 (2011).
- Fujiwara, S., et al. A novel animal model for in vivo study of liver cancer metastasis. World Journal of Gastroenterology : WJG. 18, 3875-3882 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11, 512-522 (2011).
- Heindryckx, F., Colle, I., Van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
- Zhang, L., et al. An in vivo mouse model of metastatic human thyroid cancer. Thyroid Official Journal of the American Thyroid Association. 24, 695-704 (2014).
- Menezes, M. E., et al. Genetically engineered mice as experimental tools to dissect the critical events in breast cancer. Advances in Cancer Research. 121, 331-382 (2014).
- Ogunwobi, O. O., Wang, T., Zhang, L., Liu, C. Cyclooxygenase-2 and Akt mediate multiple growth-factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 27, 566-578 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139, 1315-1326 (2009).
- Stolpe, A., Pantel, K., Sleijfer, S., Terstappen, L. W., den Toonder, J. M. Circulating tumor cell isolation and diagnostics: toward routine clinical use. Cancer Research. 71, 5955-5960 (2011).
- Saad, F., Pantel, K. The current role of circulating tumor cells in the diagnosis and management of bone metastases in advanced prostate cancer. Future Oncology. 8, 321-331 (2012).
