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Medicine

"환자와 같은"동소 이식 동계 마우스 모델 간세포 암의 전이

doi: 10.3791/52858 Published: October 24, 2015

Summary

암의 전이 확산 암 관련 사망의 주요 원인이다. 우리는 고형 장기의 종양에서 전이의 메커니즘을 연구하기위한 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델 시스템 구축을위한 우리의 생존 수술 방법에 대한 심층적 인 설명을 제공한다.

Protocol

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윤리 선언문
모든 동물 실험은 뉴욕 시립 대학의 헌터 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

주 : 에이트 BALB / c 마우스는이 실험 절차에서 사용 하였다. 다섯 BALB / c 마우스는 차 종양을 생성하기 위해 5 X 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포를 이식 하였다. 아니오 주입 세 BALB / c 마우스는 대조군으로 사용 하였다. BNL 1ME A.7R.1은 쥐의 비 종양 간세포 세포주 BNL c12에에서 화학 변환에 의해 유도 된 쥐의 간세포 암 세포주이다. BNL 1ME A.7R.1는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)로부터 수득 하였다.

1. 사전 수술

  1. 모든 생존 수술은 건강을 위해 그 쥐를 확인합니다. 마우스가 건강하도록하려면, 피부의 텐팅 (tenting)에 의해 탈수의 징후를 검사합니다. 질병 또는 d의 증거와 마우스를 사용하지 마십시오이 실험에서 istress.
  2. 그들은 저체중하지 보장하기 위해 마우스의 무게를. 무게가 적어도 16-20g 있는지 확인하십시오.
  3. 마우스 당 주입 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 마우스의 간세포 암 세포를 준비합니다
    1. BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포의 70 % 융합 성 세포 배양 접시 - 10 ml의 60 %에서 대기음 매체. 5 ml의 PBS로 두 번 씻는다. 접시에 트립신 2 ML을 추가하고 5 분 동안 공기와 5 % CO 2 가습 배양기에서 37 ° C에서 품어.
    2. 그 후, 피펫 10 μL은 10 배의 배율 현미경으로 세포 계수에 대한 수동 혈구로 세포를 트립신. 4 개의 큰 코너에 위치한 사각형 셀들의 총 수를 카운트하고 세포의 총 수에 의해 희석 계수를 곱한다. 이어서, (ML 당 셀) 카운트 제곱의 수로 나누어 세포 농도 10 (6)에 의해 곱.
    3. 계산을 이용하여, 무균 마우스 당 500 만 세포를 수집1.5 ml의 마이크로 원심 튜브. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 레이블.
  4. 포스페이트 완충 염수 100 ㎕ (PBS)에 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 HCC 세포 재현 탁. 수술에서 이식까지 얼음이 세포를 보관하십시오.
  5. 마취의 유도 및 머리 오염을 방지하기 위해 멸균 장비와 물질을 멀리 클리핑 등의 수술에 대한 쥐의 준비에 필요한 활동을 수행합니다.
  6. 분당 1 L (약. 2.1 %)의 농도를 일정한 유량으로 산소와 함께 기화기 이소 플루 란을 사용하여 이소 플루 란 흡입에 의해 마우스의 전신 마취를 유도한다. 주 : 시스템은 자립이며, 정밀 기화기, 산소 공급과 가스 / 마취제 소기 필요한 호흡 회로에 연결된 캐니스터 목탄을 포함한다.
  7. 마취는 수술 중 통증을 겪고에서 동물을 방지하기 위해 적절한 지 확인하십시오. 발가락 핀치를 수행하고 비 respon 위해 동물을 관찰siveness 마취를 확인합니다.
  8. 이 때, 코 콘에 밸브 라인, 인감 상자 열기를 전환합니다.
  9. 즉시 마우스를 마취로, 건조 및 손상 예방 조치로 각막에 안과 연고의 작은 금액을 적용합니다.
  10. 이어서, 노즈콘 제대로 (유지 마취)에 배치하고 연결하여, 준비 공간에 동물을 이동. 이 준비 영역에서 탈모에 의해 수술을위한 수술 절개 부위를 준비합니다.
  11. 수술의 영역이 다른 모든 활동이없는 위치에 있는지 확인합니다.
  12. 작업 표면이 견고하고 적절하게 소독, unsoiled과 혼란이없는 수술 전인지 확인하십시오. 리넨 또는 이상 수술 트레이의 살균 조각을 놓습니다.
  13. 수술 필드는 수술을 수행하는 사람 만 사용할 수 있는지 확인합니다. 수술 방 적절한 소독과 청소하고 적절한 세제를 휩쓸 및 분사되어 있는지 확인ctant.
  14. 그것은 또한 거리에 문 및 공기 흐름 등의 창에서 위치 사이트의 오염에 이르는 먼지를 확산 할 수 있는지 확인합니다.
  15. 멸균 악기 생존 수술을 수행합니다. 어느 제조업체의 권장하거나 오토 클레이브에 따라 살균제에 악기를 흡수. 사용할 준비가 기본 멸균 공급 장치를 사용합니다.
  16. 별도의 장비는 기능에 따라 멸균 지역의 오염을 방지하기 위해.
  17. 동물의 간을 액세스 할 수 절개 (중간 선 절개)의 사이트 주위에 약 1 인치를 면도. 수술의 사이트에서 멀리 동물에서 머리를 제거합니다.
  18. 면도 후, 비누 살균제 (betadine 수술 스크럽)와 영역을 문질러 멸균 PBS 용액에 과량의 소독제를 씻어. 약 5 분 동안 지속 전체 스크럽 과정이 여러 번 수행합니다. 제거하고 사용 장갑을 폐기.
  19. 그 후, 같은 surgic로 보호 복으로 변경알 가운, 스크럽 상단, 얼굴 마스크입니다. 다음으로, 수술 장갑 착용하기 전에 적절한 스크럽 솔루션 손을 소독. 참고 :이 흘리기 및 잠재적 오염 물질과 수술 부위의 오염 방지하기 위해 필요한 단계입니다.

2. 수술

  1. 마취의 전체 기간 동안 따뜻함을위한 외부 열원을 제공합니다. 마취는 체온 조절의 장애를 야기하기 때문에 동물은 일부 저체온증이 발생할 수 있습니다; 따라서, 체온을 유지한다.
  2. 수술을 통해 그 뒷면에 마우스를 놓습니다.
  3. 외과 테이프 조각과 수술 테이블에 앞 사지, 뒷다리와 마우스의 꼬리를 수정합니다.
  4. xyphisternum에 직선 절개 즉시 열등합니다.
  5. 간을 노출 멸균 자기 유지 외과 견인기를 사용합니다.
  6. 주사기 차분히, 20G 바늘을 갖는 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1를 포함하는 PBS 100 ㎕를 주입간 우엽에 마우스 간암 세포.
  7. 바늘을 제거한 후, 인해 간 높은 혈관에 잠재적 인 출혈을 멈추게하기 위해 적어도 1 분 동안 멸균 면봉을 적용합니다.
  8. 수술 클립을 사용하여 피부 폐쇄 다음 흡수성 봉합사와 피하 조직을 닫습니다. 그 후, betadine 스크럽과 함께 다시 한 번 상처를 청소하십시오. 참고 :이 수술 상처의 폐쇄를 보장합니다.
  9. 피하 생리 식염수 100 ㎕를 제공합니다.

3. 수술 후

  1. 수술 후 즉시, 마우스 조건 관리인에게 통지 수술 후 신분증 깨끗한 케이지에 마우스를 옮긴다. 음식과 물을 제공합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면, 초기 24 시간의 기간 후 수술 젖은 음식과 물을 혼자 보관하면 그냥 최선을 운임됩니다 수술을 한 마우스를.
  2. 38 ºC을 능가하지 열을 생성하는 가열 램프와 함께 동물을 따뜻하게 유지. 유마우스가 완전히 회복 될 때까지 온도를 측정하는 온도계를 SE는.
  3. 바람직하게는 종이 침구와 케이지 하우스 동물의 편안함을 보장합니다.
  4. 초기 복구 한 후, 불편 함, 출혈, 통증과 고통의 징후 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 통증을 완화하기 위해 프레 노르 핀 (0.05 -0.1 ㎎ / ㎏)을 얻었다. 밀접하게 약 2 시간 동안 활성 동작과 모양뿐만 아니라 물과 음식 소비를 모니터링. 외래 경우, 마우스의 정규 일반 주택을 다시 지역에 동물을 이동하고 24 시간 후 수술 6-12 시간 간격으로 모니터링을 계속합니다. 원하는 경우 체중 검사를 수행합니다.
  5. 동물이 문제가 회복 데 경우, 적절한지지 요법의 조치를 취할. 마우스는 복구 할 수없는 경우, 인도적으로 CO 2 질식 자궁 경부 전위를 통해 쥐를 안락사. 안락사에 대한 승인 기관의 지침을 따르십시오.
  6. 수술 후 보통 observab입니다 간세포 암의 임상 적 증거를 확인몸 상태 점수 르로 크게 감소. 주 :이 시점에서, 일차 종양 가능성 간에서 개발 및 전이성 예금 가능성 폐에서 개발 하였다.
  7. 이 시점에서, 인도적인 안락사에 의해 실험에 참여 (실험 및 제어) 모든 쥐를 희생. 이산화탄소로 질식 생쥐 대상 : 매우 천천히 -10 5 분에 걸쳐 챔버 내에 이산화탄소를 방출. 이것은 호흡 정지의 원인이됩니다.

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Representative Results

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을 Balb / c 마우스의 간은 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포를 이식 하였다. HCC 개발의 임상 적 증거가 육십삼일 수술 후 관찰했다. 따라서, 마우스는 인도적으로 안락사시켰다. 검시는 안락사 쥐에 대해 수행 하였다. 폐 및 간을 절제하고, 조심 육안 검사를 육안 종양을 확인하기 위해 수행 하였다. 하나의 마우스에서 종양이 표면 복벽 (도 1a)에 일부 첨부 간 표면에서 발견되었다. 둘째 마우스에서 비정상적 간 예측이 관찰되었다. 이상은 매우 강력 피상적 종양 (그림 1B)처럼 보인다. 예상대로 제어 마우스에서 간 (도 1d) 및 폐 (도 1E)에 의해 입증되는 바와 같이, BNL 1ME A.7R.1 HCC 세포의 주입없이와 대조군 마우스는 종양이 전혀 개발되지. 또한, 종양을 가진 쥐에서 폐 다소 비정상적인 모습, 디스플레이출혈성 괴사 보내고 영역 (도 1C). 이전의 경험을 바탕으로, 이러한 폐 전이 예금 3 항구있다.

그림 1
종양 및 전이의도 1은 총 시험.의 Balb / c 마우스를 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 종양 세포 이식 63 일 후 안락사시켰다. 촬영하고 여기에 도시 된 관측 주제 간 종양. (A 및 B) 모두가 표면 간 종양을 나타낸다. (C)는 (E). 마우스 이식 종양 세포에서 폐. (D)이 제어 마우스의 간 표시되는 제어의 폐를 나타낸다 마우스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


간세포 암 전이의 "환자와 같은"동 소성 동계 마우스 모델의 방법론 그림 2. 도식. 일단 마취는 마우스 간은 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간세포 암 (HCC) 세포 주입된다. 간세포 암의 임상 적 증거가 관찰되면, 동물 (경피적 심장 내 방혈 및 자궁 경부 전위 다음 이산화탄소 질식을 실시,) 인도적인 안락사에 의해 희생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 문서의 방법에 대한 깊이있는 설명은 (그림 2)이 최근 Ogunwobi 및 간세포 암 전이의 동소 동계 마우스 모델의 성공적인 설립의 동료에 의해보고되었다 주어진다 3. 이 절차에 대한 종양의 테이크 속도는 일반적으로 높다. 우리는 이전에 100 % 3의 종양 걸릴 속도를 관찰했다. 그러나 테이크 속도는 연구자의 능력에 따라 변수가 될 수 있습니다. 훈련하에 새로운 대학원생 의한 최근의 실험에서, 종양 포획 율은 40 %로 낮았다. 대부분의 실험 4에서 종료되어 있지만 - 3 주 - 몸 상태 점수에 감소로 인해 6 주, 우리는 차 종양 (2)에 의해 설정 될 수있다 동일한 마우스에 동일한 세포의 피하 이식과 경험을 믿는다. 우리는 일반적으로 성공적인 실험에서 하나의 종양 결절을 볼 것으로 예상. 우리는 폐 전이가 4 사이에 개발 기대 비록 - 6 주, 그것은 conceiv입니다간에서 종양이 훨씬 일찍 일어날 수 있음을 수.

양호한 수술 기법 및 무균 조건이 생존 수술 방법의 성공에 필수적이다. 생존 수술에 사용되는 마우스는 건강해야한다. 사전 및 사후 수술을 계량하는 것이 좋습니다. 쥐의 평균 전 수술에 사용되는 가중치 또는 가장 최근의 실험은 평균 중량은 22g이었다 만 18g이고, 실험 종료 시점 (육십삼일 수술 후 주입). 의한 종양 전신성 질병으로 체중이 저하가 없기 때문에 그 기간 동안의 체중의 4g의 이득이 예상된다. 우리는이에 대한보다 객관적인 평가는 우리가 실험을하는 동안 한 번 또는 두 번 매주 마우스의 무게를 측정했다했을 것이다. 이것은 가장 좋은 방법을 추천합니다.

도 2에 요약 된 바와 같이, 마우스를 충분히 통증을 피하기 위해 수술 전에 수술 시간 및 마취 걸쳐되어야 ND 고통. 이 지역은 모든 혼란이 없어야하고, 액세스는 수술을 수행하는 사람들에게 사용할 수 있습니다. 모두 사용되는 수술 영역뿐만 아니라 장비는 모든 멸균해야한다.

이식의 성공을위한 중요한 단계는 주입 될 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포의 제조이다. 제조 동안, 융합 세포 배양 접시에서 세포 콜렉션의 오염을 방지하기 위해 중요하다. 이러한 단계는 무균 조건 하에서 세포 배양 후드에서 수행되어야한다. 세포 수는 5 × 106 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포는 100 μL 인산 완충 식염수 (PBS)에 재현 탁된다 무균 마우스 당 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 수집 된 보장하기 위해 수행되어야한다. 트립 판 블루 염색 임의로 세포의 생존 능력을 확인하기 위해 수행 될 수있다. 이 세포는 쥐의 간에서 이식 전에 2 시간보다 더 이상 얼음에 보관 될 수 없습니다.

_content "> 암세포 이식 인한 간 민감한 특성 (도 2)로 조심스럽게 취급되어야한다. 암세포 주입하는 동안 전체 간을 통과하는 바늘 될 수없는 깊은 구멍을 피하기 . 또한, 바늘을 제거한 후. 한편, 주사 전에 바늘 너무 얕은 천공 가능성 복강으로 밖으로 분사 암세포의 유출을 야기 할 것이다. 또한, 차분히 암 세포를 주입하는 것이 필수적이다 출혈 기관의 가능성이 높기 때문에 혈관에 항상있다. 따라서, 적어도 1 분 동안 멸균 면봉을 적용하는 것이 좋습니다. 관리 및주의가 주입 성공의 가장 높은 속도를 보장합니다. 동물도를 제공해야한다 저체온증과 절차 전반에 걸쳐 열을 외부 소스가 마취 중 체온 조절의 장애를 일으키는 주요 관심사이다. 수술 후, 동물 모니터링해야불편 함이나 고통의 흔적이있는 점 적절한주의를 투여해야한다. 마우스는 수술로부터 회복 할 수없는 경우에는 인도적 안락사한다.

암전이 암으로 사망의 주요 원인이기 때문에, 그것은 혈행 보급 2-4의 메커니즘을 묘사하는 것이 중요하다. 신규의 순환 성 종양 세포는 전이 HCC 3의 동소 동계 마우스 모델에서 확립되었다. 또한,이 모델에서 파생 된 CTCS 지속적으로 종양 개시 및 전이성 능력 (3)을 증가 보여줍니다. 그들은 특정 분자 요인, 마커 및 암 전이 2-4의 가능한 치료 목표를 해명하는 데 도움으로이 방법을 사용하여 격리 순환 종양 세포는 매우 중요하다는 것을 증명 할 수 있습니다. 이 방법론은 이미에 비해 순환 성 종양 세포에서 간세포 성장 인자 (HGF)와 이의 수용체, C-메트로의 상향 조절이 증가되는 것을 확인했다HCC (3)의 일차 종양 세포. 이러한 결과는 종양 전이의 중요한 측면은 상피 - 간엽 전환 2-4,10의 세포 과정임을 보여주는 이전의 연구에 구축 할 수 있습니다. 이 새로운 모델을 사용하여 다른 특징 순환 종양 세포 따라서 HCC 1-3,10보다 효율적인 관리의 개발로 이어지는 과정을 촉진 인자의 복잡한 메커니즘에 대한 이해를 증가시킬 것이다.

현재, 가장 널리 사용되는 동물 종양 모델은 인간 종양 세포를 면역 결핍 마우스로 주입되는 것을 특징으로 마우스 이종 이식 종양 모델이다. 이 때문에, 종양 전이 3 면역계의 역할을 연구하기에 적합한 동계하고 있기 때문에,이 문서에서 설명하는 모델은 중요한 이점을 갖는다. 이 모델은, 단리 배양 및 가능한 순환 종양 세포의 3 공부 재현성이 입증되었다. 이 때문에, tremen했다선별 검사, 진단, 예지, 치료 모니터링 및 새로운 치료 전략의 발견 등의 임상 응용 프로그램을 평가하기위한 DOUS 가능성. 상술 한 방법의 한계는 생쥐에 주입 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포의 상당한 부분이 생존 할 수 없게 될 것이며, 따라서 셀의 일부만에 종양을 도입 생존력과 숙달 될 것이라는 것이다 보조 사이트 3. 우리는 마우스 당 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 마우스 간암 세포의 초기 주입하여이 한계를 차지하고있다.

결론적으로, 전이성 고형 장기 암이 동소 동계 마우스 모델은 암 환자 (3)의 혈액에서 종양 세포 순환의 전이 능력의 기초 생물학적 메커니즘을 해명하기위한 우수한 플랫폼을 제공한다. 암 전이는 HEMA를 통해 주로 발생하기 때문에 차례로이 가능성이 암 전이의 메커니즘에 새로운 통찰력을 흘리는 것togenous는 11-13 확산. 따라서 암 전이의 메커니즘에 얻은 소설 통찰력은 새로운 유익한 임상 적용 3,14,15의 발전에 결정적인 역할을하게 될 것입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Tweezer  Roboz (RS-5040) Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip Roboz (RS-5111) 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6501) Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6503) Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors) Roboz (RS-6466) 80 mm/3 inch scale, chrome plated 
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp Roboz (RS-5852) 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures Roboz (RS-9861-36)
Scalpel handle  Roboz (RS-9884) Solid
Littauer Stitch Sissors Roboz (RS-7074) Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying Roboz (RS-7960) Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier Roboz (RS-9262) safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid Roboz RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade Roboz (RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer Roboz Ds-400, Ds-401, DS-501 For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec. 
Microinjection needles VWR BD305125 25G Needle

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References

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Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).More

Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).

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