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Medicine

A "Patient-Like" Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

doi: 10.3791/52858 Published: October 24, 2015

Summary

A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo sing�ico rato "paciente-like" orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos.

Protocol

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Declaração de ética
Todos os estudos com animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Hunter College of The City University of New York.

Nota: Oito ratos BALB / c foram utilizados neste procedimento experimental. Cinco ratinhos BALB / c foram implantados com 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 carcinoma hepatocelular células de rato para produzir os tumores primários. Três ratinhos BALB / c sem implantes foram usadas como controlos. BNL A.7R.1 1ME é uma linha celular de carcinoma hepatocelular murino que foi derivada através de transformação química a partir da linha celular de hepatócitos não tumorigénico murino BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC).

1. Pré-cirurgia

  1. Certifique-se de que os ratos para todas as cirurgias de sobrevivência são saudáveis. Para assegurar que os ratos são saudáveis, inspeccionar sinais de desidratação por tenting da pele. Não utilize ratos com qualquer evidência de doença ou distress nestas experiências.
  2. Pesar ratos para garantir que eles não estão abaixo do peso. Assegure-se que o peso é, pelo menos, 16-20 gramas.
  3. Prepare 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC para a implantação per mouse:
    1. Aspirar media de 10 ml de 60% - 70% de cultura de células confluentes prato de células HCC A.7R.1 rato BNL 1ME. Lavar duas vezes com 5 ml de PBS. Adicionar 2 ml de tripsina para o prato e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com ar e 5% de CO 2 durante 5 min.
    2. Subsequentemente, pipeta de 10 uL de células tripsinizadas em um hemocitómetro manual para contagem de células sob um microscópio com uma ampliação de 10X. Contar o número total de células encontradas nas quatro grandes quadrados de canto e multiplicar pelo factor de diluição pelo número total de células. Em seguida, divida pelo número de quadrados contados e multiplicar por 10 6 para a concentração de células (células por ml).
    3. Usando o cálculo, coletar 5 milhões de células por rato em estéril1,5 ml tubos de microcentrífuga. Rotular 1,5 ml microtubos.
  4. Ressuspender as 5 x 10 6 células BNL 1ME A.7R.1 rato HCC em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha estas células em gelo até a implantação em cirurgia.
  5. Executar as atividades necessárias para a preparação de ratos para a cirurgia, tais como a indução da anestesia e cabelo recorte longe de equipamentos e materiais esterilizados para evitar a contaminação.
  6. Induzir a anestesia geral em ratos por inalação de isoflurano utilizando um vaporizador de isoflurano, juntamente com oxigénio a uma taxa de fluxo constante de 1 concentração L por min (aprox. 2,1%). Nota: O sistema é auto-suficiente, e inclui um vaporizador de precisão, um suprimento de oxigênio e um botijão de carvão que está ligado a um circuito de respiração necessária para o gás / anestésico limpeza.
  7. Certifique-se de que a anestesia é adequada para impedir o animal de sofrer dor durante a cirurgia. Execute-toe pitada e observar animais para não-responsiveness para confirmar a anestesia.
  8. Naquele tempo, mudar a linha de válvula, vedação à caixa e aberto ao cone do nariz.
  9. Assim que o rato é anestesiado, aplicar uma pequena quantidade de uma pomada oftálmica para as córneas como uma medida preventiva a secagem e danos.
  10. Subsequentemente, o animal se mover para a área de preparação, com o cone do nariz adequadamente colocado e ligado (para a manutenção da anestesia). Prepare o local da incisão cirúrgica para a cirurgia por depilação a esta área de preparação.
  11. Certifique-se de que a área de cirurgia é em um local livre de todas as outras atividades.
  12. Certifique-se de que a superfície de trabalho é resistente e adequadamente higienizado, unsoiled e antes da cirurgia livre de desordem. Coloque um pedaço estéril de linho ou bandeja cirúrgica sobre ele.
  13. Certifique-se de que o campo operatório está disponível apenas para pessoas que exercem a cirurgia. Certifique-se de que a sala cirúrgica é limpo e varreu com um limpador adequado e aspergidos com um disinfe apropriadoctant.
  14. Assegure-se que também é posicionada afastada da portas e janelas, como correntes de ar podem espalhar pó levando à contaminação do sítio.
  15. Realizar a cirurgia sobrevivência com instrumentos esterilizados. Ou mergulhar instrumentos num desinfectante de acordo com a recomendação do fabricante ou autoclave. Use suprimentos básicos que são estéreis pronto para uso.
  16. Instrumentos distintos de acordo com a função de ajudar a prevenir a contaminação de áreas estéreis.
  17. Raspar aproximadamente 1 polegada em torno do local da incisão (incisão na linha média) para aceder ao fígado do animal. Remover o cabelo a partir do animal para longe do local da cirurgia.
  18. Após a depilação, esfregue a área com um desinfetante e sabão (betadine cirúrgica matagal) e lavar o excesso com uma solução desinfetante de distância PBS estéril. Realizar isso várias vezes, com todo o processo de esfoliação com duração de aproximadamente 5 min. Remover e descartado as luvas utilizadas.
  19. Depois, mude para roupas protetoras como Surgical vestido, top matagal, e máscara facial. Em seguida, higienizar as mãos com esfoliação solução adequada antes de colocar luvas cirúrgicas. Nota: Este é um passo necessário para evitar derramamento e contaminar o local da cirurgia com potenciais contaminantes.

2. Cirurgia

  1. Fornecer uma fonte externa de calor para o calor durante todo o período da anestesia. O animal pode experimentar alguns hipotermia porque anestesia provoca distúrbios da termorregulação; portanto, manter a temperatura do corpo.
  2. Coloque o mouse sobre as suas costas durante toda a cirurgia.
  3. Corrigir os membros dianteiros, membros posteriores e cauda do mouse na tabela de cirurgia com pedaços de fitas cirúrgicas.
  4. Faça uma linha reta incisão imediatamente inferior ao xyphisternum.
  5. Usar um afastador cirúrgico auto-retenção estéril para expor o fígado.
  6. Com uma seringa com uma agulha de 20G, lentamente e cuidadosamente, injectar 100 ul de PBS contendo 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1células de rato HCC no lobo direito do fígado.
  7. Após a remoção da agulha, aplicar um cotonete esterilizado durante pelo menos 1 min para parar qualquer sangramento potencial devido à alta vascularização do fígado.
  8. Feche o tecido subcutâneo com uma sutura absorvível seguido de fechamento da pele usando grampos cirúrgicos. Posteriormente, limpar a ferida mais uma vez com betadine matagal. Nota: Isso irá garantir o fechamento da ferida cirúrgica.
  9. Subcutaneamente dar 100 ul de solução salina normal.

3. Pós-cirurgia

  1. Imediatamente após a cirurgia, transferir o mouse para uma gaiola limpa com um cartão de identificação pós-cirurgia para notificar cuidadores da condição mouse. Fornecer alimentos e água. Nota: Em nossa experiência, um rato que acaba de passar por cirurgia se sairá melhor se alojado sozinho com o alimento úmido e água para o período inicial de 24 horas pós-cirurgia.
  2. Manter o animal aquecido com uma lâmpada de calor que gera calor, não ultrapassando 38 ºC. vcif um termômetro para medir a temperatura até que o mouse está totalmente recuperado.
  3. Casa do animal em uma gaiola de preferência com roupa de cama de papel para garantir conforto.
  4. Após a recuperação inicial, monitorar o animal para sinais de desconforto, sangramento, dor e angústia. Dê buprenorfina (0,05 -0,1 mg / kg) para aliviar a dor. Estreitamente monitorizar a actividade, comportamento e aparência, assim como água e o consumo de alimentos durante cerca de 2 horas. Se ambulatorial, mover o animal de volta para a área de habitação periódica normal dos ratos e continuar a acompanhar em intervalos de 6-12 h para 24 horas pós-cirurgia. Executar uma verificação de peso se o desejar.
  5. No entanto, se o animal está tendo problemas de recuperação, tomar medidas de cuidados de suporte apropriados. Se os ratos são incapazes de recuperar, humanamente euthanize camundongos através de asfixia com CO2 e deslocamento cervical. Siga as orientações institucionais aprovados para a eutanásia.
  6. Pós-cirurgia, verifique se há evidência clínica de HCC que normalmente é observable redução tão significativa no escore de condição corporal. Nota: Neste ponto, um tumor primário tem provavelmente desenvolvido no fígado e depósitos metastáticos têm probabilidade desenvolvidas nos pulmões.
  7. Neste ponto, sacrificar todos os ratos (experimental e controle) envolvidos no experimento por eutanásia humanitária. Sujeitar os ratinhos para o dióxido de carbono asfixia: libertação muito lenta de dióxido de carbono no interior da câmara ao longo de um período de 5 a 10 minutos. Isto fará com parada respiratória.

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Representative Results

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Os fígados de ratos Balb / c foram implantados com 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células rato HCC. Evidência clínica de desenvolvimento HCC foi observado 63 dias pós-cirurgia. Consequentemente, os ratos foram humanamente eutanasiados. A necropsia foi realizada nos ratos sacrificados. Os pulmões eo fígado foram ressecados e um exame cuidadoso bruta foi realizada para identificar tumores macroscópicos. Em um rato, um tumor superficial foi observada sobre a superfície do fígado com alguma ligação à parede abdominal (Figura 1A). Em um segundo rato, um fígado anormalmente aparência foi observada. A anormalidade parece muito fortemente como um tumor superficial (Figura 1B). Como esperado, os ratinhos no grupo de controlo sem implantação de células BNL 1ME A.7R.1 HCC desenvolvido nenhum tumor, como evidenciado por um fígado (Figura 1D) e pulmões (Figura 1E) a partir de um ratinho de controlo. Além disso, os pulmões de ratinhos com tumores pareciam ligeiramente anormal, exposiçãoing áreas de necrose hemorrágica (Figura 1C). Com base na experiência anterior, esses pulmões podem abrigar depósitos metastáticos 3.

figura 1
Figura 1. O exame macroscópico de tumor e metástases. Ratinhos Balb / c foram implantados com 5 X 10 6 células tumorais BNL 1ME A.7R.1 e sacrificados 63 dias mais tarde. Tumores representativos do fígado observados foram fotografados e exibidos aqui. (A e B) ambos mostram tumores hepáticos superficial. (C) é pulmões a partir de células tumorais camundongos implantados. (D) mostra fígado de um rato controle. (E) indica pulmões de um controle mouse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 2. Diagrama esquemático da metodologia de um modelo de camundongo singênico "paciente-like" ortotópico de carcinoma hepatocelular metástase. Uma vez anestesiados, rato fígado é implantado com 5 X 106 BNL 1ME carcinoma hepatocelular A.7R.1 rato células (HCC). Quando evidência clínica de HCC é observável, animal é sacrificado por eutanásia humanitária (sujeito a dióxido de carbono asfixia, seguido de sangria intracardíaca percutânea e deslocamento cervical). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Neste artigo, uma descrição detalhada do método é dado que foi relatado recentemente por Ogunwobi e colegas de concretizar a criação de um modelo de camundongo singênico orthotopic de HCC metástase (Figura 2) 3. A taxa de absorção de tumores para este procedimento é geralmente elevada. Nós já observamos uma taxa de take tumor de 100% 3. No entanto, a taxa de absorção pode ser variável dependendo da competência do investigador. Em um experimento recente realizado por um novo aluno de pós-graduação em formação, a taxa de absorção tumor era tão baixa quanto 40%. Embora a maioria das experiências são terminadas em 4 - 6 semanas devido a declinar no escore de condição corporal, acreditamos que a partir da experiência com o implante subcutâneo das mesmas células na mesma ratos que tumores primários pode ser estabelecida por 2 - 3 semanas. Nós geralmente esperar para ver um nódulo tumoral a partir de uma experiência bem sucedida. E embora nós esperamos metástase pulmonar para desenvolver entre 4 - 6 semanas, é conceivque capaz de tumor no fígado pode ocorrer muito mais cedo.

Boas técnicas cirúrgicas e condições assépticas são essenciais para o sucesso deste método de cirurgia sobrevivência. Os ratos utilizados para a cirurgia de sobrevivência deve ser saudável. Pesando pré e pós-cirurgia é uma boa prática. Os pesos médios pré-operatórios dos ratos usados ​​no experimento ou mais recente foi de 18 gramas, e no ponto final experimental (63 dias pós implantação cirúrgica) o seu peso médio foi de apenas 22 gramas. Um ganho de apenas 4 gramas de peso durante esse período de tempo é provável porque houve algum declínio no ganho de peso devido a uma doença sistêmica do tumor. Nós teria tido uma avaliação mais objectiva do que teve medimos o peso do mouse uma vez ou duas vezes por semana durante todo o experimento. Isto é recomendado melhores práticas.

Tal como resumido na Figura 2, os murganhos devem ser adequadamente anestesiados antes da cirurgia e durante todo o período da cirurgia, para evitar uma dor aflição nd. A área deve ser livre de toda a desordem, e acesso deve ser disponível apenas para aqueles a realização da cirurgia. Tanto a área de cirurgia, bem como os instrumentos utilizados devem todos ser estéril.

Um passo vital para o sucesso da implantação, é a preparação das células de rato HCC BNL 1ME A.7R.1 para ser implantado. Durante a preparação, é fundamental para evitar a contaminação da recolha das células de culturas de células confluentes pratos. Estes passos devem ser executados em uma capa de cultura celular sob condições estéreis. Uma contagem de células deve ser também feito para garantir que as células 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 rato HCC foram recolhidos num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril por ratinho que é ressuspenso em 100 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS). Azul corante Trypan também pode ser opcionalmente realizada para confirmar a viabilidade das células. Estas células devem ser mantidos em gelo não mais de 2 horas antes da implantação em fígados de ratos.

_content "> A implantação das células cancerosas devem ser manuseados com cuidado devido à natureza delicada do fígado (Figura 2). Durante a injecção das células cancerosas, evitar muito profundo de uma punção que pode resultar em que a agulha passar por todo o fígado . É essencial para injectar as células cancerosas lentamente e cuidadosamente. Por outro lado, demasiado raso um punção com a agulha antes da injecção irá provavelmente provocar derrame das células cancerosas injectadas para dentro da cavidade peritoneal. Além disso, após a remoção da agulha, há sempre um potencial de o órgão de sangramento devido a sua alta vascularização. Portanto, é recomendável a aplicação de uma mecha de algodão estéril, durante pelo menos 1 min. cuidado e atenção vai garantir a maior taxa de sucesso da implantação. O animal também deve ser fornecida uma fonte externa de calor ao longo do processo como hipotermia é uma grande preocupação provocar perturbações de regulação térmica durante a anestesia. pós-cirurgia, o animal deve ser monitorizado paraquaisquer sinais de desconforto ou dor em que deve ser administrado ponto de cuidados adequados. Se o mouse não é capaz de se recuperar da cirurgia, ele deve ser humanamente eutanasiados.

Como a metástase do câncer é a principal causa de mortalidade por câncer, é fundamental para delinear os mecanismos de disseminação hematogênica 2-4. Novas células tumorais circulantes foram estabelecidos a partir deste modelo de camundongo singênico orthotopic de HCC metástase 3. Além disso, os CTC derivados deste modelo mostram consistentemente iniciação do tumor e aumentou a capacidade metastática 3. As células tumorais em circulação isolado utilizando este método, pode revelar-se muito importante, pois ajudam a desvendar factores específicos, os marcadores moleculares e possíveis alvos terapêuticos da metástase do cancro 2-4. Esta metodologia já identificados que há um aumento da regulação positiva do factor de crescimento de hepatócitos (HGF) e o seu receptor, c-Met em células tumorais circulantes em comparação comas células de tumor primário de HCC 3. Estes resultados baseiam em trabalhos anteriores demonstrando que um aspecto importante da metástase tumoral é o processo celular epitelial-mesenquimal de transição 2-4,10. Mais de caracterização circulam células tumorais usando este novo modelo irá aumentar a nossa compreensão dos intrincados mecanismos de fatores que promovem o processo que conduz assim para o desenvolvimento de uma gestão mais eficaz de HCC 1-3,10.

Actualmente, os modelos de tumor animal mais largamente utilizados são modelos de tumor de xenoenxerto de ratinho, em que as células tumorais humanas são implantadas em ratinhos imunodeficientes. O modelo descrito neste artigo tem vantagens importantes porque é singeneicos e é, portanto, adequado para estudar o papel do sistema imunológico em metástase tumoral 3. Este modelo provou ser altamente reprodutível para o isolamento, a cultura, e o estudo de células tumorais circulantes viáveis ​​3. É, por conseguinte, tem tremendous potencial para avaliar aplicações clínicas, como triagem, diagnóstico, prognóstico, terapêutica e monitorização descoberta de novas estratégias terapêuticas. Uma limitação da metodologia descrita acima, é que uma porção significativa de células CHC A.7R.1 BNL 1ME rato implantado em ratinhos será incapaz de sobreviver e, assim, apenas uma pequena porção das células será viável e adaptado a introdução em tumores 3 sites secundários. Contabilizamos essa limitação implantação inicial de 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC por rato.

Em conclusão, este modelo de rato singeneico ortotópico de cancro metastático de órgão sólido proporciona uma boa plataforma para elucidar os mecanismos subjacentes biológicos a capacidade metastática de células de tumor que circulam no sangue de pacientes com cancro 3. Este, por sua vez, provavelmente, lançar novos insights sobre os mecanismos da metástase do câncer, porque a metástase do câncer ocorre principalmente via hematogenous espalhar 11-13. Introspecções novas assim obtidos nos mecanismos da metástase do câncer será fundamental para o desenvolvimento de novas aplicações clínicas benéficas 3,14,15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micro Dissecting Tweezer  Roboz (RS-5040) Tip 0.20 x 0.12 mm
Graefe Micro Dissecting Forceps, serrated curved tip Roboz (RS-5111) 1 X 2 teeth, curved tip width 0.6 mm
Micro Dissecting Retractor-Agricola (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6501) Blunt 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 25 mm
Micro Dissecting Retractor-Goldstein (3 by 3 prongs) Roboz (RS-6503) Blunt, 3 X 3 prongs, depth 4 mm, spread 19 mm
Jameson Caliper (Measures tumors) Roboz (RS-6466) 80 mm/3 inch scale, chrome plated 
Micro Dissecting Scissors, large ring sissors, straight and sharp Roboz (RS-5852) 23 mm blades, length 4 inches, flat shanks and large rings
Scalpel with blades, for delicate dissecting procedures Roboz (RS-9861-36)
Scalpel handle  Roboz (RS-9884) Solid
Littauer Stitch Sissors Roboz (RS-7074) Length 4.5 inches
Brown needle holder, for easy suture tying Roboz (RS-7960) Convex jaw, fine serrations
Reflex 7MM wound clips with reflex 7 clip applier Roboz (RS-9262) safe, secure alternative method of wound closure
Instrument tray and lid Roboz RT-1350S
Mini-clipper with detachable blade Roboz (RS-5903)
Germinator 500 (the Germ Terminator) Dry Sterilizer Roboz Ds-400, Ds-401, DS-501 For fast decontamination of micro-dissecting instruments.   Instruments decontaminate within 15 sec. 
Microinjection needles VWR BD305125 25G Needle

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References

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A "Patient-Like" Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase
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Cite this Article

Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).More

Das, D. K., Durojaiye, V., Ilboudo, A., Naidoo, M. K., Ogunwobi, O. A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis. J. Vis. Exp. (104), e52858, doi:10.3791/52858 (2015).

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