Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

A طريقة لإسكات العصبية عن بعد آخر في القوارض وخلال مراحل متقطعة التعلم

Published: June 22, 2015 doi: 10.3791/52859
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, Oberlin College

Abstract

يصف هذا البروتوكول كيف مؤقتا وبعد لإسكات نشاط الخلايا العصبية في مناطق الدماغ منفصلة في حين تشارك الحيوانات في مهام التعلم والذاكرة. يجمع بين النهج الدوائي (مصمم-مستقبلات حصريا المنشط تلو مصمم المخدرات) مع النموذج السلوكي (شروط مسبقة الحسي) التي تم تصميمها للتمييز بين أشكال مختلفة من التعلم. على وجه التحديد، ويستخدم تسليم الفيروسية التي تتوسط للتعبير عن مستقبلات المعدلة وراثيا المثبطة G-البروتين يقترن (مصمم مستقبلات) إلى منطقة الدماغ منفصلة في القوارض. بعد ثلاثة أسابيع، عندما تكون مستويات التعبير مصمم مستقبلات مرتفعة، ويدير وكيل الدوائي (مصمم المخدرات) بشكل منتظم 30 دقيقة قبل جلسة سلوكية محددة. المخدرات قد تقارب لمستقبلات مصمم وبالتالي يؤدي إلى تثبيط الخلايا العصبية التي تعبر عن مستقبلات مصمم، بل هي على خلاف ذلك خاملة بيولوجيا. منطقة الدماغ لا يزال إسكات لمدة 2-5 ساعة (depenقرع على الجرعة وطريقة التعاطي). عند الانتهاء من النموذج السلوكي، ويتم تقييم أنسجة المخ لوضع الصحيح ومستقبلات التعبير. هذا النهج هو مفيدة بشكل خاص لتحديد مساهمة من مناطق الدماغ الفردية لعناصر محددة من السلوك، ويمكن استخدامها عبر أي عدد من النماذج السلوكية.

Introduction

تحديا مثيرا في مجال علم الأعصاب السلوكي هو تحديد ركائز العصبية من السلوكيات المعقدة. وقد تم استخدام عدد من التقنيات مثل الآفات دائمة، تعطيل الدماغ مؤقت عن طريق زرع حقنة عادية وoptogenetics للتعرف على مساهمات من مناطق الدماغ منفصلة لفرعية من السلوكيات المعقدة. في حين أن هذه النهج إبلاغ فهمنا لخصوصية الإقليمية خلال التعلم، كل تقنية ليست دون قيود. على وجه التحديد، وعادة ما تجرى الآفات دائمة قبل الاختبار السلوكي، وبالتالي آثارها موجودة طوال مدة النموذج. دراسات كيفية تركيب الكانيولا التي تنطوي على عرض لinactivator العصبي على المدى القصير (على سبيل المثال، سم الأسماك الرباعية الأسنان) يمكن أن تنتج أضرار كبيرة في أنسجة المخ ويمكن أن تحدث التوتر في المواضيع فقط قبل الاختبار السلوكي. وعلاوة على ذلك، من خلال تعطيل إقناء؛ إدخال القنية يقتصر على المنطقة من الأنسجة التي تحيطغيض من حقنة عادية. وأخيرا، في حين optogenetics يقدم مجموعة من المرونة من أجل السيطرة الزمنية للنشاط في مناطق محددة في الدماغ، فمن باهظة التكلفة وتطلبا من الناحية الفنية.

هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام نهج pharmacogenetic (مصمم-مستقبلات المنشط حصريا على حدة مصمم المخدرات، DREADDs) 1،2. الأهم من ذلك، في حين أن مفهوم علم الوراثة الدوائي هو متطورة، وتنفيذ أسلوب واضح ومباشر. على غرار الأساليب الجراحية التجسيمي التقليدية التي تنطوي على ضخ السم (على سبيل المثال، NMDA، حمض ibotenic) في مناطق الدماغ منفصلة، ​​وهذا الأسلوب ينطوي على غرس فيروس الغدة المرتبطة (AAV) الذي يحتوي على جزء DNA لمستقبلات تعديل المثبطة G-البروتين يقترن (hM4Di، ومستقبلات مصمم) في المنطقة من اهتمام من القوارض المختبرية القياسية (انظر الشكل 1). يحتوي على ناقلات فيروسية أيضا مراسل فلوري (mcitrine). مرة واحدة مسجلة فيإلى الخلايا، ومستقبلات مصمم (والبروتين مراسل) يتم التعبير عن الحد الأقصى ~ 3 أسابيع بعد الحقن ويمكن تفعيلها بشكل انتقائي لمدة 2-5 ساعة من قبل الإدارة الشاملة للمصمم المخدرات غير ذلك خاملة بيولوجيا، كلوزابين-N-أكسيد (CNO) 1 (3). لأن وهبت المجرب مع دقيقة، بعد جهاز التحكم عن بعد الزمنية على النشاط العصبي في مناطق محددة في الدماغ، علم الوراثة الدوائي يجمع بشكل جيد مع النماذج السلوكية التي تجرى على مراحل متعددة. في هذا المثال، مساهمة من القشرة خلف الطحال (RSC) إلى التحفيز التحفيز تتم مقارنة التعليمية لدورها في التعلم بافلوف، ولكن هذا الجمع بين النهج مناسب تماما إلى أي عدد من الأسئلة التي تسعى إلى تحديد كيفية معينة تساهم مناطق الدماغ ل سلوك معقد.

بالإضافة إلى ذلك، في حين لم توصف في هذا البروتوكول، والنهج الفيروسية والمعدلة وراثيا يمكن استخدامها لتحقيق الخلية نوع معين DREADD التعبير 2. بما انيالصورة الكامنة في النماذج السلوكية التي تنطوي على أنواع الدوائية و / أو غيرها من التلاعب التجريبية، دراسة متأنية من التصميم التجريبي والتحليل الكمي لاحق مطلوب عند إستخدام أسلوب DREADD. ويشار إلى المجربون جديد إلى نهج DREADD إلى مراجعة شاملة لتكنولوجيا DREADD الحالية 2.

كل يوم، الكائنات تعلم حول المحفزات وأحداث جديدة وعلاقاتهم مع بعضهم البعض. حتى في بيئة مألوفة، مثل المنزل، هو واحد سريع للكشف عن تغيرات في العلاقات بين المثيرات لأن هذه التغيرات قد تكون التنبؤية للأحداث ذات مغزى. هذا التحفيز التحفيز (أي العلائقية) التعلم ينطوي على نحفظ من المحفزات متعددة وتقليديا يرتبط الحصين، الذي يقيم مركزيا في الفص الصدغي وسطي 4. ومع ذلك، لا توجد الحصين ولا تعمل في عزلة. المناطق القشرية داخل وخارج على حد سواءجانب من الفص الصدغي وسطي توفير المعلومات الحسية حاسمة لتشكيل الحصين 5-7. وتوفر دراسات التقليدية الآفة دائمة أدلة دامغة على تورط عدد من المناطق القشرية (مثل القشور خلف الطحال، postrhinal والمخية الأنفية الداخلية) في التعلم المعتمد على الحصين لكنها محدودة في قدرتها على تمييز دور منطقة معينة خلال مراحل منفصلة من تعلم 10/08.

هذا البروتوكول باختبار فرضية أن RSC من الضروري للتعلم التحفيز التحفيز بإسكات RSC خلال مرحلة واحدة من 3 مراحل شروط مسبقة الحسي النموذج 11،12. لفترة وجيزة، الفئران تتلقى دفعات من AAV التي تحتوي على مستقبلات مصمم و~ 3 أسابيع في وقت لاحق تدار المصمم المخدرات (CNO) 30 دقيقة قبل بدء الاختبار السلوكي. في هذا البروتوكول، فئران التجارب تتلقى CNO خلال المرحلة الأولى من اختبار (عندما لير التحفيز التحفيزنينغ يحدث) وأنها تتلقى السيارة خلال المراحل القادمة 2 من الاختبار. للسيطرة على الآثار غير المقصودة من CNO على السلوك، ولبث الفئران مع المصمم مستقبلات (hM4Di) وحقن مع السيارة بدلا من CNO. لحساب الآثار العامة من ضخ الفيروسي ومستقبلات التعبير، ولبث فيروس التحكم التي لا تحتوي على مستقبلات مصمم وإدارة CNO.

ويستخدم عدد من الأنماط المصلية مختلفة من AAV لتقديم المادة الوراثية. المبادئ التوجيهية الحالية NIH للبحوث إشراك المؤتلف أو الجزيئات الاصطناعية تؤكد أن AAV (جميع الأنماط المصلية) ويبني AAV المؤتلف أو الاصطناعية، والتي التحوير لا ترميز إما منتج جيني يحتمل أن يكون مكون للأورام أو جزيء السموم وتنتج في حالة عدم وجود فيروس المساعد، تتطلب BSL-1 الاحتياطات (مجموعة الملحق B-1. المخاطر 1 (RG1) وكلاء) 13. تتوفر 14،15 عدد من الاستعراضات المتعلقة بنية AAV، والمرافق والسلامة. والجدير بالذكر، على الرغم من، بسبب مخاوف تتعلق الممكنة والمحتملة 16،17 الآليات المسببة للسرطان الإنجابية 18-20 في القوارض وبعض المؤسسات تتطلب استخدام BSL-2 الاحتياطات عند العمل مع AAV. التحقق من BSL المناسب قبل استخدامها من خلال التشاور مع لجان الرقابة في المؤسسات الفردية حيث سيتم إجراء البحوث، ومراكز السيطرة على الأمراض والمبادئ التوجيهية NIH للبحوث إشراك المؤتلف DNA الجزيئات 13 عند استخدام ناقلات فيروسية للتلاعب الجيني في الولايات المتحدة. يتم تحديد الحماية الشخصية، والتدريب محقق، ناقلات الاحتواء، وإزالة التلوث، والتخلص من المواد تطهيرها، وبعد حقن الحيوان متطلبات السكن من خلال هذه المبادئ التوجيهية. وبالإضافة إلى ذلك، يجب استشارة والمتابعة المناسبة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية لجنة أو المبادئ التوجيهية لجنة الرقابة المؤسسية تعادل لضمان سلامة التعامل والإدارة والتخلص من AAV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات من قبل كلية أوبرلين رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم اللجنة، وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 21.

1. إعداد لتسريب الفيروسي

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول BSL-1 الاحتياطات. عندما توظف BSL-2 الاحتياطات، معطف المختبر القابل للتصرف، والقفازات، ويغطي الحذاء، حماية العين وجهاز تنفس الجسيمات (نوع N95) مطلوبة. يجب أن تناسب جميع الأفراد التعامل مع BSL-2 مركبات اخضعت للاختبار للجهاز للتنفس الصناعي الجسيمات من قبل وكالة الصحة العامة المحلية. الرجوع إلى لوري وMajewska (2010) 22 للحصول على تفاصيل إضافية عن مناولة وتخزين ناقلات فيروسية.

  1. عند الاستخدام الأول، قسامة وتخزين الفيروس غير المستخدمة في 20 أنابيب microcentrifuge ميكرولتر لتجنب تكرار التجميد والذوبان.
  2. إعداد سطح العمل عن طريق إزالة أية كائنات غير الضرورية وتعقيم السطح مع 70٪ من الإيثانول. إعداد 10٪ محلول التبييض لإزالة التلوث من النفايات AAV. وضع كوب كامل من محلول التبييض ومعقمة 10 ميكرولتر حقنة على سطح العمل. وضع أنبوب microcentrifuge مع AAV في وعاء مع الثلج المجروش أثناء الإعداد.
  3. وضع أنبوب microcentrifuge مع الفيروس في مقعد نائب القياسية. تحميل حقنة 10 ميكرولتر مع لا يقل عن 4 ميكرولتر من AAV. الحرص على عدم ثني غيض من حقنة ضد الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge أثناء التحميل. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في 4 ميكرولتر من محلول AAV في المحقنة.
  4. التخلص من الأنبوب فيروس فارغة في دورق يحتوي على 10٪ مواد التبييض. تخزين الأجزاء غير المستخدمة من الفيروس كما هو محدد من قبل المورد.
  5. إضافة إضافية التبييض 10٪ إلى حاوية النفايات، والسماح النفايات على الجلوس لمدة 30 دقيقة قبل التخلص من المخلفات السائلة تطهير.
  6. التخلص من جميع معدات الوقاية والنفايات البلاستيكية في حاوية واقية وفقا لتعليمات المبادئ التوجيهية المؤسسية. ديكوntaminate أي معدات أو الأسطح التي جاءت في اتصال مع الفيروس باستخدام المبيض بنسبة 10٪.

2. جراحة

  1. إعداد المنطقة الجراحية عن طريق وضع ورقة ماصة مقاعد البدلاء تحت جهاز التجسيمي وعلى مساحة مجاورة تسمى منطقة معالجة فيروس مخصصة.
    1. وضع حاوية النفايات التبييض 10٪ في مجال التعامل مع فيروس مخصصة بالقرب من جهاز جراحي.
  2. لحث على مستوى ثابت من التخدير وإعداد الفئران لإجراء عملية جراحية.
    1. وضع الفئران في غرفة الاستقراء التي تحتوي على خليط من الغاز الأيزوفلورين (مجموعة من 1-3٪) والأكسجين (100٪ في حوالي 1 لتر / دقيقة) حتى يكون هناك فقدان الوعي وقلة الحركة هادفة الإجمالية. الحفاظ على التخدير الأيزوفلورين طوال العملية الجراحية.
    2. بعد تحقيقه 6 التخدير العميق، حلق الفئران من بين العينين إلى قليلا خلف الأذنين.
    3. وضع الفئران مرة أخرى إلى غرفة الاستقراء ل1-3 دقيقة إضافية.
    4. تأكد من توصيل النظام التخدير الأيزوفلورين إلى مخروط الأنف من جراحة التجسيمي. فتح محبس على أنابيب الأيزوفلورين لبدء تدفق الأيزوفلورين إلى stereotax. الحفاظ على الأيزوفلورين والأوكسجين في المستويات المحددة أعلاه.
    5. وضع الفئران في جهاز التجسيمي من خلال تأمين الفم على شريط لدغة وتأمين القضبان الأذن.
    6. تطبيق مواد التشحيم العين للعيون وbetadine إلى موقع الجراحية قبل شق.
  3. جعل 2.4 سم خط الوسط شق الجلد على السطح الظهري للجمجمة بدءا حوالي 2 ملم الذيلية للعيون. سحب الجلد لفضح الجمجمة. دوري غرس العقيمة المالحة عقيمة 0.9٪ على هامش موقع الجراحية لمنع الأنسجة من التجفيف.
  4. نسيج غشائي واضحة من الجمجمة حتى bregma وامدا هي واضحة للعيان.
  5. تأكد من أن الجمجمة هو مستوى خلال قياس الإحداثيات الظهري البطني فيbregma وعلى امدا. ضبط الجهاز التجسيمي وفقا لذلك حتى الإحداثيات الظهري البطني في bregma وامدا تختلف بما لا يزيد عن 0.04 مم.
  6. في هذا الوقت، والحد من الغاز الأيزوفلورين إلى ما بين 2 و 2.5٪.
  7. عودة التدريبات إلى bregma، rezero الإحداثيات ومن ثم نقل الحفر إلى المطلوب وسطي-الجانبي والأمامي الخلفي تنسيق.
  8. حفر حفرة في تنسيق باستخدام 0.9 مم مثقاب كما أنها تنتج ثقب الحجم المناسب ل28 G ضخ حقنة.
  9. ضبط مضخة التسريب لتسليم فيروس بمعدل 0.2 ميكرولتر / دقيقة. وضع حقنة في الذراع ضخ الجهاز التجسيمي وخفض الحقنة في المطلوب تنسيق. تسليم المبلغ المطلوب من فيروس (تتراوح 0،1-0،8 ميكرولتر). على سبيل المثال، تقديم 0.8 ميكرولتر من AAV أكثر من 4 دقيقة.
    ملاحظة: إجراء دراسات تجريبية لتحديد حجم ضخ مثالي ونموذجي انتشار الفيروس في كل منطقة من الفائدة.
    1. بعد تسليم الفيروس المشتركmplete ترك الحقنة في مكان لمدة 10 دقيقة لمنع ارتجاع في المسالك الإبرة. رفع ببطء الحقنة بمعدل حوالي 5 مم / دقيقة. كرر حتى تم غرست جميع الإحداثيات مع AAV.
  10. إغلاق الجرح باستخدام الدبابيس الجراحية ومعطف الجرح مع مرهم مضاد حيوي موضعي.
  11. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية لإدارة الألم بعد العمليات الجراحية.
  12. وضع الفئران في قفص مع الفراش، وغطاء واللافتات المناسبة والعودة الفئران على منشأة الحيوان.
    1. إذا كان يعمل تحت BSL-2 الاحتياطات، وجمع الفراش لفترة من الوقت (عادة 48-72 ساعة) المحدد من قبل الإرشادات المؤسسية. وضع الفراش في وعاء نفايات بيولوجية.
    2. التخلص من كل المواد الملوثة AAV كما هو محدد من قبل الإرشادات للتخلص الآمن منها.

3. جهاز السلوكي

ملاحظة: يتكون الجهاز الحسي شروط مسبقة من معيار هواء فعال تكييف شامنوفمبر (12 "ل س 9.5" W X 11.5 "H) مع المقاوم للصدأ الطابق شبكة الصلب، 2 الجوانب زجاجي و 2 الجدران المعدنية.

  1. جبل الضوء 2.8 W على أحد الجدران الألومنيوم لتكون بمثابة ضوء البيت وكما التحفيز البصري عندما تومض في 2 هرتز. جبل أحد المتحدثين في الغرفة لتقديم المحفزات السمعية (10 ثانية و 1500 هرتز، 78 ديسيبل لهجة نقية و 10 ثانية 78 ديسيبل من الضوضاء البيضاء).
    1. استخدام قادوس الغذاء لتسليم 45 الكريات الغذائية ملغ في كوب الغذاء. داخل كوب الغذائية، الخلايا الضوئية بالأشعة تحت الحمراء للكشف عن إجمالي الوقت الذي يقضيه في كوب الطعام قبل وأثناء وبعد العروض من المحفزات والمكافآت الغذاء.
    2. بيت الدوائر في خزانات-تخفيف الصوت (22 "W × 22" H × 16 "D) مزودة مراوح العادم (~ 68 ديسيبل).
    3. استخدام الكمبيوتر PC مع ميد أسوشيتس برنامج للسيطرة على غرفة استثابي والحصول على البيانات. خلال جلسات تكييف، وجمع بيانات عن إجمالي الوقت الذي يقضيه مع الرأس في كأس الغذائية خلال سيقدم العرضنشوئها من (ثانية الحقبة 5) التحفيز الخفيفة وخلال عرض مكافأة الغذائية (5 ثانية العصر). خلال الدورة اختبار، وجمع بيانات عن إجمالي الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذاء في الاستجابة لعروض من المنبهات السمعية (10 ثانية عصر البداية عندما يتم إنهاء المنبهات السمعية).

4. لمحة عامة عن الحسية شروط مسبقة بارادايم

  1. بعد التعافي من الجراحة، تدريجيا الطعام تحد من الفئران إلى 85٪ من وزن الجسم فراغهم التغذية. استشارة الموظفين البيطريين لنموذج تقييد الغذاء المناسب.
    ملاحظة: يتم توضيح 3-مرحلة شروط مسبقة الحسي النموذج في الشكل 2.
  2. شروط مسبقة جلسات (المرحلة 1؛ دورات تدريبية 64 دقيقة يوميا أجرت عبر 4 أيام متتالية):
    1. الفئران الحالية مع 12 المحاكمات اختلط التي تتكون من تسليم المنبهات السمعية والبصرية. تشمل فترات بين المحاكمة أن متوسط ​​4.5 للدقيقة (مجموعة 4،0-5،0 دقيقة) بعد كل لعرض uditory.
    2. في 6 من التجارب والحاضر لهجة (التحفيز شروطا مسبقة) لمدة 10 ثانية، يليه مباشرة عرض 5 ثانية للضوء وامض التحفيز.
    3. من جهة أخرى 6 المحاكمات، تقديم الضوضاء البيضاء (التحفيز المفردة) وحدها لمدة 10 ثانية.
  3. (؛ دورات تدريبية 64 دقيقة يوميا أجريت عبر 5 أيام متتالية المرحلة 2) جلسات تكييف:
    1. وجاءت الفئران الحالية مع 8 المحاكمات التي تتكون من تسليم التحفيز البصري (وميض ضوء التحفيز) لمدة 5 ثوان على الفور بتسليم اثنين من 45 ملغ كريات الغذاء. تشمل فترات بين المحاكمة أن متوسط ​​7 دقيقة (مجموعة 6،0-8،0 دقيقة) بعد كل محاكمة. أحيانا الفئران تتطلب أكثر من 5 جلسات تكييف لتعلم جمعية الغذائية الخفيفة.
  4. دورة اختبار (المرحلة 3، واحدة جلسة 78 دقيقة):
    1. تقديم الفئران مع 12 المحاكمات اختلط التي تتكون من تسليم المنبهات السمعية وحدها. تشمل فترات بين المحاكمة التي افيالغضب 4.5 دقيقة (مجموعة 4،0-5،0 دقيقة) بعد كل عرض السمعي.
    2. على 6 من المحاكمات، تقديم الحوافز لهجة (التحفيز شروطا مسبقة) وحدها لمدة 10 ثانية.
    3. من جهة أخرى 6 المحاكمات، تقديم الضوضاء البيضاء (التحفيز المفردة) وحدها لمدة 10 ثانية.
  5. موازنة المحفزات من خلال استكمال الدراسة مع مجموعة ثانية من الفئران التي تتلقى الضوضاء البيضاء بوصفها حافزا شروطا مسبقة والنغمة مثل التحفيز المفردة.

5. الدوائي والسلوكي الداخلي

  1. تشغيل الطاقة إلى جهاز السلوكي وتحميل رمز MED-PC للدورة السلوكية المناسبة. الأسلاك وبرنامج الجهاز السلوكي مثل أن المشجعين التي شنت على خزائن الصوت المخففة تشغيل عند تشغيل الطاقة.
  2. لإعداد 1 ملغ / مل حل للكلوزابين N-أكسيد (CNO)، ويزن 5.0 ملغ من CNO إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة 5 مل من الماء المعقم أو 5 مل من معقم 0.9٪ ساليشمال شرق. دوامة حتى حل واضح.
    1. إذا CNO لا تذوب في حل أو إذا رغبت في حلول أكثر تركيزا من CNO إضافة كيل الانحلال، مثل DMSO 23. على وجه التحديد، لإعداد محلول 1 ملغ / مل من CNO مع 0.5٪ DMSO، تزن 5.0 ملغ من CNO وإضافة 25 ميكرولتر من DMSO إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. نفض الغبار ضمان بلطف أن محتويات تبقى في قاعدة الأنبوب. عندما يصبح حل واضح، إضافة 5 مل من الماء المعقم أو 5 مل من العقيمة 0.9٪ المالحة. متوفرة على صفحة موارد DREADD يكي 25 مزيد من التعليمات لإعداد حلول CNO.
    2. يعد حل CNO جديد كل يوم أن يدار.
  3. حقن CNO البريتونى بجرعة 1 ملغم / كغم حوالي 30 دقيقة قبل الاختبار السلوكي. على سبيل المثال، وضخ 200 غرام الفئران مع 0.2 مل من 1 ملغ / مل حل CNO. وقد تم اختيار مسار الجرعة ووقت الإدارة CNO استنادا إلى تقارير نشرت سابقا 2،12.
    1. حقن CNO 30 دقيقة قبل كل دورة شروط مسبقة (المرحلة 1؛ مجموعه 4 أيام من الحقن) ولكن إدارة السيارة قبل جميع دورات سلوكية لاحقة.
  4. بعد 30 دقيقة، ووضع الفئران في غرف اختبار السلوكية والشروع رمز الكمبيوتر للدورة السلوكية المناسبة.
  5. عند الانتهاء من المهمة السلوكية، على الفور بإزالة الفئران من الدوائر وعودة الجرذان إلى مستعمرة الحيوانات.

6. التحليلات السلوكية البيانات

ملاحظة: المتغير التابع للجميع الدورات السلوكية هو مقدار الوقت الذي رأس فأر هو داخل الكأس المواد الغذائية والكشف عنها من قبل انقطاع الخلايا الضوئية الحمراء في الكأس الغذاء. البيانات (في ثانية) يتم جمعها وتسجيلها بواسطة برنامج كمبيوتر.

  1. لا إجراء تحاليل على البيانات التي تم إنشاؤها خلال مرحلة شروط مسبقة.
  2. لدورات تكييف: تحليل كل الفئرانبيليتي لتعلم جمعية الغذائية الخفيفة بمقارنة سلوك كوب المواد الغذائية خلال تقديم محفزات بصرية عبر جلسات السلوكية 5. على وجه التحديد، وحساب متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذائية خلال ضوء الحقبة 5 ثانية لكل من 8 محاكمات / الدورة (أي ما معدله 8 المحاكمات التي هي كل 5 ثانية في مدة / فأر). مقارنة متوسط ​​الرقابة والقيم التجريبية لكل من 5 جلسات يومية (انظر الشكل 3A).
    1. تحليل الدوافع الفئران للحصول على مكافأة الطعام بمقارنة سلوك كوب الطعام أثناء الولادة المكافأة الغذائية (5 ثانية العصر) عبر جلسات السلوكية 5 باستخدام نفس الحساب كما هو محدد في ضوء الحقبة 5 ثانية أعلاه. وهذه القيم يكون دائما أعلى من تلك التي تم الحصول عليها خلال عرض محفزات بصرية (انظر الشكل 3B).
  3. للدورة اختبار: حساب نسبة التمييز الذي يصف سلوك كوب الغذاء الفئران استجابة لبريهentations كل التحفيز السمعي.
    1. على وجه التحديد، لكل فأر، وتقسيم متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذائية التالية كل من 6 عروض من التحفيز الحسي شروطا مسبقة (أي لهجة) من خلال مجموع متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الكأس الغذائية التالية كل من 6 عروض لل التحفيز الحسي شروطا مسبقة (أي حافز لهجة) بالإضافة إلى متوسط ​​إجمالي الوقت الذي يقضيه في كأس الغذائية التالية كل من 6 عروض من التحفيز المفردة (أي ضجيج التحفيز الأبيض). كل عصر هو 10 ثانية في المدة.
      ملاحظة: A درجة التمييز من 0.5 أو أكثر تبين أن الفئران علمت جمعيات الكامنة في شروط مسبقة النموذج الحسي.

7. التأكيد من AAV التنسيب والتعبير

  1. تخدير ويروي الفئران transcardially باستخدام 4٪ لامتصاص العرق. يرجع ذلك إلى استخدام العلامات الفلورية، لا تتجاوز فترة ما بعد التثبيت من 2 ساعة إلى دقيقةفقدان imize من استضداد والحفاظ على إشارة الفلورسنت.
  2. يذوى العقول perfused لبنقلهم في وعاء الدماغ تحتوي على 30 مل من محلول السكروز 20٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (1X) لمدة لا تقل عن 2 أيام أو حتى الدماغ المصارف إلى أسفل الجرة الدماغ.
  3. استخدام انزلاق مشراح تجميد لجعل أقسام الدماغ الاكليلية (20-40 ميكرون) في جميع أنحاء كامل مدى rostrocaudal المنطقة من الفائدة.
  4. إجراء المناعية الموجهة ضد مستقبلات الموسومة أو البروتين مراسل للتأكد من مكان والتعبير عن مستقبلات مصمم و / أو مراسل (12). يتم توفير بروتوكول المناعية تلطيخ على صفحة موارد DREADD يكي 25.
  5. تحميل المقاطع على الشرائح-superfrost زائد وساترة باستخدام 100-200 ميكرولتر من وسط مائي التركيب.
  6. أداء مضان المجهر على أنسجة المخ للتحقق من وضع AAV وتعبير البروتين 12،24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج السلوكية

عند الانتهاء من التجربة، يجب كميا ونوعيا تقييم فعالية تعطيل مؤقت منطقة محددة. ينطوي هذا المثال نموذج 3-مرحلة السلوكي (شروط مسبقة الحسي)، والتي كانت تدار CNO لتخفيف النشاط العصبي في RSC خلال جلسات شروط مسبقة لاختبار فرضية أن RSC الضروري لتشكيل جمعيات بين المحفزات محايدة 12. الأهم من ذلك، والمجربون لا تقتصر على النموذج السلوكي أو التصميم التجريبي الموصوفة هنا مع اقتراب pharmacogenetic يمكن أن يقترن مع معظم النماذج السلوكية.

في حين لم تتم التحليلات عادة على البيانات التي تم إنشاؤها خلال جلسات شروط مسبقة (المرحلة 1)، فمن المهم لتحديد ما إذا كانت الفئران علمت جمعية الغذائية الخفيفة خلال جلسات تكييف (المرحلة 2). كما هو مبين في فايجوري 3A، سواء التجريبية (Expt) والتحكم (السيطرة) الفئران تبرهن تزايد السلوك كأس الغذائية خلال العروض من التحفيز ضوء (الشكل 3A) تشير إلى أن الفئران حصلت جمعية بافلوف بين التحفيز البصري (الضوء) ومكافأة الغذاء. بالإضافة إلى ذلك، كلا الفريقين تبرهن تزايد السلوك كوب المواد الغذائية خلال تقديم مكافأة الغذائية (الشكل 3B) مبينا الدافع يعادل الحصول على مكافأة. خلال الدورة اختبار حرجة، عندما يتم عرض المنبهات السمعية في غياب محفزات أخرى، الفئران السيطرة لديها درجة التمييز الذي يختلف كثيرا عن فئران التجارب (الشكل 3C). الفحص البصري من الرسم البياني يكشف عن أن متوسط ​​نسبة التمييز الجرذان تحكم أكبر من 0.5، مما يدل على قدر أكبر من السلوك كوب الطعام ردا على العروض من التحفيز السمعي الذي يقترن ضوء (خلال شروط مسبقة) مقارنة مع كوب طعامهمالسلوك في الاستجابة لعروض من التحفيز السمعي الذي المفردة (خلال شروط مسبقة). في المقابل، فشلت فئران التجارب لإثبات درجة الاختلاف الذي هو فوق فرصة. وبالتالي، الشكل 3C يدل على أن السيطرة ولكن لا فئران التجارب أظهرت تأثير شروط مسبقة الحسي.

التحقق من الموضع AAV

عند الانتهاء من الاختبار السلوكية وتحليل الفئران أنسجة المخ لوضع الصحيح والتعبير عن مستقبلات مصمم. سلوك المناعية 12،25 باستخدام الأجسام المضادة الأولية الموجهة ضد علامة مستقبلات (على سبيل المثال، والأجسام المضادة الأولية لمكافحة HA) أو مراسل فلوري (في هذا المثال، mcitrine التي تم الكشف عنها بواسطة أجسام مضادة لبروتين الفلورية الخضراء (GFP)). ويرد التخطيطي لقسم الاكليلية من خلال الدماغ الفئران في الشكل 4A. ويوضح الشكل 4B مناعي قوي فلوري من البروتوكول الاضافي مراسل. عين في RSC في فأر التجارب التمثيلية مع عدم وجود التسمية الفلورسنت المكتشفة في المناطق المحيطة أرقام 4C - D توضح وضع العلامات الفلورية تمثيلية من البروتينات مراسل في التجريبية (Expt؛ وغرست الفئران مع بناء AAV التي تحتوي على مصمم مستقبلات الجينات والجينات mcitrine ) والسيطرة (السيطرة؛ وغرست الفئران مع بناء AAV مماثلة تحتوي على الجين GFP لكن لا تسلسل لمستقبلات مصمم) الفئران، على التوالي. ويمكن أيضا أن مستويات مستقبلات للظهور كحد أدنى، ممثل والتعبير القصوى 24. إذا تم الكشف عن وضع العلامات في المناطق خارج المنطقة من الفائدة، واستبعاد تلك البيانات من التحليلات السلوكية.

الشكل 1
-IRES-mCitrine رسم تخطيطي للبناء AAV رسم تخطيطي للhSyn-HA-hM4D (غي) AAV تستخدم لإكسب: الرقم 1.ريس المصمم مستقبلات المثبطة (hM4Di) تحت العصبية synapsin المروج معين (hSyn) في الخلايا العصبية RSC. للصحفيين مناعي (HA-العلامة و / أو mcitrine) يمكن استخدامها لتصور التعبير من البروتين ومراسل، على التوالي. hSyn، المروج synapsin البشري؛ يحدد التعبير في الخلايا العصبية. HA، العلامة hemagluttinin. وتنصهر هذه العلامة لمستقبلات مصمم وبمثابة علامة حاتمة تمكين الكشف عن مستقبلات التعبير. hM4Di، الجين للمصمم المثبطة G-مستقبلات البروتين يقترن. IRES، دخول موقع الريبوسوم الداخلية. يسمح مراسل (mcitrine) ليتم ترجمتها. mcitrine، وهو مراسل الفلورسنت هذا هو البديل من GFP ولكنه أكثر مقاومة للphotobleaching من.

الرقم 2
الشكل 2: رسم تخطيطي للشروط مسبقة النموذج الحسي (A) خلال شروط مسبقة sess.الأيونات، وتعرض 12 محاكمة مختلط. خلال 6 من التجارب، وتقدم حافزا السمعي لمدة 10 ثانية وجاء على الفور من قبل وامض التحفيز ضوء البيت (2 هرتز، لمدة 5 ثانية). خلال 6 محاكمات أخرى، يتم تقديم التحفيز السمعي الثاني دون التحفيز البصري. (B) وخلال جلسات تكييف، يقترن التحفيز البصري يقترن سابقا مع مكافأة الغذاء. (C) خلال الدورة اختبار، وهناك 12 العروض تتشابك اثنين من المنبهات السمعية في ظل غياب المحفزات البصرية أو الطعام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: النتائج السلوكية متوسط ​​كوب الغذاء الاستجابة أثناء (A) ضوء و (B) العهود الغذاء ودودق جلسات تكييف (المرحلة 2). وقد تم تحليل البيانات باستخدام تدابير المتكرر تحليل التباين. نسب (C) التمييز خلال الدورة اختبار (المرحلة 3). خط منقط يشير كميات متساوية من مكيفة كوب الغذاء الرد على كل التحفيز السمعي (أي لا شروط مسبقة الحسي) وقد تم تحليل البيانات باستخدام عينات المستقلة اختبار t. Expt. فئران التجارب (ن = 17) غرست مع بناء AAV التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي للالمثبطة G-بروتين مصمم جانب مستقبلات (hM4Di) وتسلسل الحمض النووي لمراسل فلوري (mcitrine). السيطرة؛ الفئران التحكم (ن = 6) يملؤه hM4Di والمركبات تدار جنبا إلى جنب مع الفئران التحكم (ن = 4) غرست مع فيروس AAV التي لا تحتوي على مستقبلات مصمم والتي كانت تدار CNO. لم مجموعات المراقبة لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض (P> 0.05). أشرطة الخطأ دلالة ± SEM.

الرقم 4 الرقم 4: التحقق النسيجي للتعبير البروتين (A) A التخطيطي يوضح موقع RSC في قسم الاكليلية من خلال الدماغ الفئران. (B) صور الممثل المسمى immunohistochemically أنسجة دماغ الفئران من الفئران التجريبية (Expt) الذي غرست مع بناء AAV التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي للالمثبطة G-بروتين مصمم جانب مستقبلات (hM4Di) وتسلسل الحمض النووي لمراسل فلوري ( mcitrine). mcitrine هو البديل مقاومة تتلاشى عالية من البروتين الفلوري الأخضر. (C) صورة الممثل من الفئران التجريبية التي توضح موقع التسمية مراسل فلوري (mcitrine). (D) صورة الممثل من الفئران التحكم (السيطرة) التي غرست مع بناء AAV التي تحتوي على تسلسل الحمض النووي لمراسل فلوري (المعزز GFP). الحانات النطاق: B، 500 ميكرون. C و D، 10081؛ م الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول كيفية تطبيق نهج pharmacogenetic (DREADD) لمعرفة كيف تساهم منطقة محددة في الدماغ على مراحل متعددة المهام المعقدة التعلم. مع القدرة على مؤقتا وبعد إسكات النشاط العصبي في مناطق الدماغ منفصلة عبر مراحل التعلم، وهذا المزيج من النهج يوفر منبرا للتحقيق في مجموعة واسعة من السلوكيات، بما في ذلك أشكال أكثر دقة أو ملثمين التعلم. في المثال الموصوفة في هذا البروتوكول، ومراقبة تم اختبار الفئران والجرذان التي تعبر عن مستقبلات مصمم في القشرة خلف الطحال (RSC) في مهمة السلوكية 3-المرحلة 12. شملت المرحلة الأولى من مهمة تقديم المحفزات محايدة متعددة مع افتراض أن السيطرة على الفئران ستشتري جمعية التحفيز التحفيز بين اثنين من المنبهات. فرضية العمل هي أن RSC من الضروري للتعلم التحفيز التحفيز، وبالتالي، على كل من 4 أيام تكييف، 30 دقيقة قبل بداية الاختبار السلوكيأعطيت جي والرقابة وفئران التجارب الإدارة النظامية إما المخدرات مصمم (CNO) أو مركبة. عندما منضمة إلى مستقبلات مصمم، CNO يقلل من نشاط الخلايا العصبية التي يتم التعبير عن ذلك المستقبل. خلال المراحل المتبقية من تكييف السلوك والاختبار، وعندما لا يفترض ان هذه RSC للتأثير على التعلم، وCNO لا تدار وبالتالي لم بالانزعاج النشاط العصبي.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

التعامل الآمن مع المركبات AAV: إن العمليات الجراحية تشارك في نهج pharmacogenetic لا أكثر تطلبا من الناحية الفنية من ضخ التجسيمي بسيط، ومع ذلك، فإن استخدام AAV في بعض المؤسسات يتطلب أن المجربون تلتزم BSL-2 الاحتياطات. فمن الأهمية بمكان أن المحققين اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعتها مراكز السيطرة على الأمراض ووكالات التمويل والمؤسسات الرئيسية واللجان الرقابية الأخرى المحددة لبرنامج أبحاثهم. معلومات عن اله التعامل الآمن مع AAVs في متناول الجميع (13).

إعداد وإدارة مصمم المخدرات: CNO، والمخدرات مصمم، بربط مستقبلات مصمم، ويسكت النشاط العصبي كنه فيما عدا ذلك خاملة 1،3 بيولوجيا. شحنات CNO من الموردين يمكن أن تختلف في الاتساق. مجمع يجب أن يصل على شكل مسحوق التي لم تلتزم الجانبين من الحاوية.

مجموعات المراقبة هامة للنظر: للسيطرة على الآثار غير محددة من المخدرات مصمم، قبل الاختبار السلوكي، لبث مجموعة مختلفة من فئران التجارب (أي تلك التي تعبر عن مستقبلات مصمم) مع حقن السيارة بدلا من CNO. بالإضافة إلى ذلك، للسيطرة على الآثار غير محددة من مستقبلات مصمم تشمل مجموعة من الفئران التي غرست مع فيروس التحكم الذي يحتوي مراسل الفلورسنت ولكن ليس مصمم مستقبلات المعدلة وحقن هذه الفئران بعقار مصمم (أي CNO) . Ensuإعادة التصميم التجريبي الكافي من موازنة بين المجموعات.

التحقق من التعبير عن بناء: هناك عدد من الطرق لتحقيق أقصى قدر من التعبير والكشف عن مستقبلات مصمم. قبل التسريب، تحقق من عيار الفيروسي هو قرب 10 12 الجسيمات / مل. في كثير من الأحيان التصور لمراسل الفلورسنت منخفض وبالتالي، فمن المستحسن أن المناعية أن يؤديها على المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد مراسل (ق) المدرجة في بناء الفيروسي 25. في هذا المثال، يوفر مناعية مضادة للGFP إشارة قوية (أرقام 4B - D). الأهم من ذلك، بسبب طبيعة العلامات الفلورية، والحد من طول الفترة الزمنية التثبيت إلى 2 ساعة.

مزايا تقنيات

مرة واحدة وقد تم تسليم بناء الفيروسي إلى الدماغ عن طريق عملية جراحية التجسيمي، ونهج pharmacogenetic يسمح للinacti مؤقتvation من نشاط الدماغ في مناطق منفصلة عن طريق الحقن النظامية الغازية الحد الأدنى من المخدرات مصمم. يمكن أن يحدث الدواء بشكل متكرر، وهو أمر مفيد للمهام السلوكية التي تحدث عبر أيام متتالية أو أسابيع 12،24،26. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة إلى أن مصمم المخدرات (CNO) لا تتدخل في السلوك الحركي أو الشهية 27،28. وبالتالي، يوفر طريقة الفرصة لتخفيف النشاط العصبي لفترة قصيرة من الزمن (2-5 ساعة)، مع تجنب الإجهاد المتأصلة في وسائل أخرى للتعطيل مؤقت. على وجه التحديد، في الدراسات إقناء؛ إدخال القنية، ويتحقق تعطيل مؤقت بتسليم أعصاب من خلال حقنة عادية التي تلصق بشكل دائم في الجمجمة. وهذا النهج يقتصر في ذلك الحفاظ على قنية واضحة من الحطام وحمايتها هو التحدي. وعلاوة على ذلك، للحث على الخمول، يتم التعامل مع الحيوانات على نطاق واسع (لإدارة السم عن طريق حقنة عادية) فقط قبل الاختبار السلوكي، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل يفرض الضغط على الحيوان ويزيد أيضا من احتمال أن حقنة عادية قد طرد من الجمجمة. لأن تأثيرات CNO هي على المدى القصير نسبيا، والتقليل من إمكانية آليات تعويضية على المدى الطويل (مثل تلك التي لوحظت التالية الآفات دائمة أو في فئران معدلة وراثيا) 29،30.

القيود المفروضة على تقنيات

DREADD هو أسلوب جديد نسبيا من التخفيف غير جراحية نشاط الخلايا العصبية. كما يمكن أن يميل هؤلاء المجربون للتحقق بشكل مستقل يحدث أن إسكات الخلايا العصبية في إعدادها. التحقق يمكن القيام بها باستخدام نهج الكهربية، ولكن هذه التجارب ومضيعة للوقت ومكلفة وتتطلب خبرة معينة. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن تقنيات chemogenetic هي أقل تكلفة من optogenetics، فإن هذا النهج هو أكثر تكلفة من تعطيل التقليدي مع وكلاء الدوائية مثل TTX. قيود آخر من نهج DREADD هو أن infusأيون من بنيات الفيروسية لا يؤدي إلى إصابة 100٪ من الخلايا العصبية في منطقة الفائدة، ولا يفعل تعطيل عبر CNO تؤدي إلى تخفيض 100٪ من نشاط الخلايا العصبية. أخيرا، بعض الأنماط المصلية AAV يمكن نقل retrogradely التي يمكن أن تعقد تفسير النتائج التجريبية 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر واضعي روبنسون وآخرون. (12) لمساهماتها في المخطوطة التي يستمد جزئيا هذا البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male, Long Evans Rats, 55-60 days old Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-oxide R&D Systems 4936-10 Designer drug
Rat Cage lid (polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion
Filter paper (replacement) Alternative Design FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table top vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Biohazard trash bags Staples 113444 Medline biohazard liners
Biohazard trash can Amazon.com United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle
Isoflurane, 100 ml Patterson Veterinary Supply Inc. 07-890-8540 Anesthetic
Dual small animal stereotaxic with digital display readout console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia mask (rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated syringe pump with micro4 controller David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine skin cleanser Perdue Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple antiobiotic ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube vet ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite rigid table-top boom stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 G 10 μl syringe Hamilton 80308-701SN Surgical equipment
Extra tall MDF sound attenuating cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22' W x 22" H x 16" D
Extra tall modular test chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless steel grid floor Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular pellet dispenser Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet receptacle, cup type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head entry detector for rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage speaker for rat chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable audio generator Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart ctrl 8 input/16 output package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large table-top cabinet and power supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI interface package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard: carcinogen, weigh in hood
Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies 3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies 2956S Histology reagent
Anti-rabbit IgG Cell Signaling Technologies 4412S Histology supplies
Superfrost plus slides VWR international 483111-703 Histology supplies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Tags

السلوك، العدد 100، الصيدلة الجينية، والسلوك، علم الأعصاب، تعطيل العصبي مؤقت، شروط مسبقة الحسي، القوارض، اللحاء، وفيروس الغدة المرتبطة، DREADDs، والتعلم، وجراحة التجسيمي
A طريقة لإسكات العصبية عن بعد آخر في القوارض وخلال مراحل متقطعة التعلم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robinson, S., Adelman, J. S. A… More

Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter