Abstract
Ce protocole décrit comment faire taire temporairement et à distance l'activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau tandis que les animaux sont engagés dans des tâches d'apprentissage et de mémoire. L'approche combine la pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues) avec un paradigme comportemental (préconditionnement sensorielle) qui est conçu pour distinguer entre les différentes formes d'apprentissage. Plus précisément, la livraison médiée viral est utilisé pour exprimer un récepteur du G-protéine inhibitrice génétiquement modifié couplé (designer Receptor) dans une région du cerveau discret dans le rongeur. Trois semaines plus tard, lorsque les niveaux d'expression des récepteurs de concepteur sont élevés, un agent pharmacologique (designer drogues) est administré par voie systémique 30 min avant une session de comportement spécifique. Le médicament a une affinité pour le récepteur de créateur et, par conséquent conduit à l'inhibition des neurones qui expriment le récepteur de concepteur, mais est par ailleurs biologiquement inerte. La région du cerveau reste réduit au silence pour 2-5 heures (Depending de la dose et la voie d'administration). À la fin du paradigme comportemental, le tissu cérébral est évaluée pour le placement correct et l'expression du récepteur. Cette approche est particulièrement utile pour déterminer la contribution des différentes régions du cerveau à des composants spécifiques de comportement et peut être utilisé dans un certain nombre de paradigmes comportementaux.
Introduction
Un défi passionnant dans le domaine de la neuroscience comportementale est de déterminer les substrats neuronaux de comportements complexes. Un certain nombre de techniques telles que des lésions permanentes au cerveau, l'inactivation temporaire par implants de canules et optogénétique ont été utilisées pour identifier les contributions des régions discrètes du cerveau à sous-composantes de comportements complexes. Bien que ces approches informent notre compréhension de la spécificité régionale lors de l'apprentissage, chaque technique est pas sans limites. Plus précisément, les lésions permanentes sont généralement menées avant le test comportemental, ainsi leurs effets sont présents tout au long de la durée du paradigme. études de canulation qui impliquent la présentation d'un inactivateur de neurones à court terme (par exemple, la tétrodotoxine) peut produire des dommages importants aux tissus du cerveau et peut induire un stress chez les sujets juste avant les tests de comportement. En outre, l'inactivation par insertion de canule est limitée à la région de tissu qui entoure lapointe de la canule. Enfin, tout en optogénétique propose une gamme de flexibilité pour le contrôle temporel de l'activité dans des régions spécifiques du cerveau, il est coût prohibitif et techniquement exigeant.
Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant une approche pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues, DREADDs) 1,2. Surtout, alors que le concept de la pharmacogénétique est sophistiqué, l'exécution de la technique est simple. Similaires à des méthodes chirurgicales stéréotaxiques traditionnels qui impliquent infusion de la toxine (par exemple, NMDA, l'acide iboténique) dans les régions du cerveau discrètes, cette technique implique l'infusion d'un virus adéno-associé (AAV) qui contient un fragment d'ADN d'un récepteur du G-protéine inhibitrice modifié couplée (hM4Di; le récepteur de designer) dans la région d'intérêt des rongeurs de laboratoire standard (voir Figure 1). Le vecteur viral contient également un rapporteur fluorescent (de mcitrine). Une fois incorporé danspour les cellules, le récepteur de concepteur (et protéine rapporteur) sont au maximum exprimé ~ 3 semaines après la perfusion et peuvent être activés sélectivement pour 2-5 heures par l'administration systémique du médicament concepteur contraire biologiquement inerte, la clozapine N-oxyde (CNO) 1 , 3. Parce que l'expérimentateur est doté de contrôle temporel précis, encore à distance sur l'activité neuronale dans des régions spécifiques du cerveau, la pharmacogénétique combine particulièrement bien avec les paradigmes comportementaux qui sont menées en plusieurs phases. Dans cet exemple, la contribution du cortex rétrosplénial (RSC) au stimulus stimulus apprentissage est comparé à son rôle dans l'apprentissage pavlovien, mais cette combinaison d'approches est bien adapté à un certain nombre de questions qui visent à déterminer comment les régions spécifiques du cerveau contribuent à comportement complexe.
En outre, bien que non décrite dans le présent protocole, les approches virales et transgéniques peuvent être utilisés pour atteindre cellule spécifique de type DREADD expression 2. Comme is inhérente à paradigmes comportementaux qui impliquent pharmacologiques et / ou d'autres types de manipulations expérimentales, un examen attentif de la conception expérimentale et l'analyse quantitative ultérieure est nécessaire lors de l'utilisation de l'approche DREADD. Expérimentateurs nouvelles à l'approche DREADD sont renvoyés à un examen complet de la technologie de DREADD actuelle 2.
Chaque jour, les organismes apprennent de nouveaux stimuli et les événements et leurs relations les uns aux autres. Même dans un environnement familier, comme la maison, on est prompt à détecter des altérations dans les relations entre les stimuli parce que ces changements peuvent être un facteur prédictif d'événements significatifs. Tel stimulus stimulus (ie, relationnelle) apprentissage implique la conjonction de multiples stimuli et a toujours été associée à l'hippocampe, qui réside au centre du lobe temporal médial 4. Cependant, ne existe pas l'hippocampe, ni agir dans l'isolement; régions corticales à l'intérieur et à l'extérieurcôté du lobe temporal médian fournir des informations sensorielles critique pour la formation hippocampique 7.5. Études de lésions permanentes traditionnels fournissent des preuves convaincantes de la participation d'un certain nombre de régions corticales (par exemple, les cortex rétrosplénial, postrhinal et entorhinal) dans l'apprentissage de l'hippocampe-dépendante, mais sont limités dans leur capacité à discerner le rôle d'une région en particulier lors des phases distinctes de apprentissage 8-10.
Le présent protocole teste l'hypothèse que la SRC est nécessaire pour l'apprentissage de stimulus-relance en faisant taire la SRC au cours d'une seule phase d'un 3-phase de préconditionnement sensorielle paradigme 11,12. En bref, les rats reçoivent des perfusions d'un AAV qui contient le récepteur de concepteur et ~ 3 semaines plus tard sont administré le concepteur médicament (CNO) 30 min avant le début des tests comportementaux. Dans le présent protocole, les rats expérimentaux reçoivent CNO lors de la première phase de test (lorsque stimulus stimulus LearNing se produit) et ils reçoivent véhicule pendant les deux prochaines phases de test. Pour contrôler les effets involontaires des CNO sur le comportement, infuser rats avec le récepteur de concepteur (hM4Di) et injecter avec le véhicule à la place du CNO. Pour tenir compte des effets généraux de perfusion virale et l'expression du récepteur, insuffler un virus de contrôle qui ne contient pas le récepteur de concepteur et administrer CNO.
Un certain nombre de différents serotypes de l'AAV sont utilisées pour fournir le matériel génétique. Les NIH Guidelines actuelles pour la recherche impliquant recombinant ou des molécules synthétiques soutient que l'AAV (tous les sérotypes) et constructions de AAV recombinants ou synthétiques, dans lequel le transgène ne code pas non plus un produit de gène potentiellement tumorigène ou une molécule de la toxine et sont produites en l'absence d'un virus auxiliaire, exige BSL-1 (groupe précautions Annexe B-1. risque 1 (RG1) Agents) 13. Un certain nombre de critiques se rapportant à la structure de l'AAV, l'utilité et la sécurité sont disponibles 14,15. En particulier, bien que, En raison de préoccupations relatives à 16,17 et potentiels mécanismes cancérogènes possibles sur la reproduction 18-20 chez les rongeurs, certains établissements exigent l'utilisation de BSL-2 précautions lorsque vous travaillez avec AAV. Vérifiez la BSL appropriée avant d'utiliser en consultation avec les comités de surveillance dans les établissements individuels où la recherche sera menée, les Centers for Disease Control et les lignes directrices des NIH pour la recherche impliquant l'ADN recombinant molécules 13 lors de l'utilisation de vecteurs viraux pour la manipulation génétique aux États-Unis. Les besoins en logement de protection individuelle, formation des enquêteurs, vecteur confinement, décontamination, l'élimination des matériaux décontaminés, animales et post-injection sont spécifiées par ces directives. En outre, consulter et suivre appropriée institutionnel de protection des animaux et utilisation des lignes directrices du comité ou des directives équivalentes du comité de surveillance institutionnels pour assurer la manipulation, l'administration et la disposition de l'AAV.
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Protocol
L'utilisation d'animaux sont approuvés par le Oberlin College institutionnel de protection des animaux et utilisation comité et sont en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire 21.
1. Préparation pour perfusion virale
Remarque: Ce protocole utilise BSL-1 précautions. Quand on emploie BSL-2 précautions, une blouse de laboratoire jetable, gants, couvre-chaussures, protections oculaires et un respirateur de particules (tapez N95) sont obligatoires. Toutes les personnes qui les manipulent BSL-2 composés doivent être aptes testé pour un respirateur de particules par une agence de santé publique local. Reportez-vous à Lowery & Majewska (2010) 22 pour plus de détails sur la manipulation et le stockage de vecteurs viraux.
- Lors de la première utilisation, aliquote et stocker le virus utilisé dans 20 microtubes pi pour éviter le gel et le dégel répétés.
- Préparer la surface de travail en supprimant tous les objets inutiles et la stérilisation de la surface avec 70% d'éthanol. Préparer un 1Solution d'eau de Javel 0% pour décontaminer les déchets de l'AAV. Placez un bécher rempli de la solution d'eau de Javel et une seringue stérile de 10 pi sur la surface de travail. Placer le tube à centrifuger avec l'AAV dans un récipient avec de la glace pilée lors de mise en place.
- Placer le tube à centrifuger avec le virus dans un étau standard. Charger une seringue de 10 ul avec au moins 4 pi d'AAV. Prenez soin de ne pas plier l'embout de la seringue contre le fond du tube de microcentrifugeuse pendant le chargement. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les 4 pi de solution de AAV dans la seringue.
- Jeter le tube vide de virus dans le bécher contenant 10% de l'eau de Javel. Rangez le restant du virus comme indiqué par le fournisseur.
- Ajouter supplémentaire de 10% de javel pour le conteneur de déchets, et laissez les déchets reposer pendant 30 min avant d'éliminer les déchets liquides décontaminés.
- Éliminer tous les équipements de protection et de déchets en plastique dans un container prévu comme indiqué par les directives institutionnelles. Décontaminate tout équipement ou surfaces ayant été en contact avec le virus en utilisant 10% de javel.
2. Chirurgie
- Préparer la zone chirurgicale en plaçant le papier absorbant banc sous l'appareil stéréotaxique et sur un espace adjacent désigné comme une zone de manipulation de virus dédié.
- Placez un récipient de déchets de Javel à 10% dans la zone de manipulation du virus dédié près de l'appareil chirurgical.
- Provoquer un niveau stable de l'anesthésie et de préparer le rat pour la chirurgie.
- Placez le rat dans une chambre d'induction qui contient un mélange de gaz isoflurane (plage de 1 à 3%) et d'oxygène (100% à environ 1 L / min) jusqu'à ce que il ya une perte de conscience et le manque de mouvement intentionnel brut. Maintenir anesthésie à l'isoflurane pendant toute la procédure chirurgicale.
- Après 6 anesthésie profonde est atteint, de se raser le rat d'entre les yeux légèrement derrière les oreilles.
- Placez le rat nouveau dans la chambre d'induction pour une1-3 min supplémentaire.
- Assurez-vous que le système d'anesthésie à l'isoflurane est connecté à la pointe avant de la chirurgie stéréotaxique. Ouvrez le robinet d'arrêt sur le tube isoflurane pour commencer l'écoulement de l'isoflurane à l'stereotax. Maintenir l'isoflurane et de l'oxygène aux niveaux indiqués ci-dessus.
- Placez le rat dans un appareil stéréotaxique de fixation de la bouche sur la barre de morsure et la fixation des barres d'oreilles.
- Appliquer un lubrifiant oculaire pour les yeux et la bétadine sur le site chirurgical avant l'incision.
- Ajouter un 2,4 cm incision médiane de la peau sur la surface dorsale du crâne à partir d'environ 2 mm caudale pour les yeux. Rétracter la peau pour exposer le crâne. Périodiquement inculquer 0,9% saline stérile stérile sur les marges du site chirurgical pour empêcher les tissus de séchage.
- Tissus membraneux Effacer du crâne jusqu'à ce bregma et lambda sont clairement visibles.
- Assurez-vous que le crâne est de niveau en mesurant les coordonnées dorsales-ventrale aubregma et au lambda. Ajuster le dispositif stéréotaxique en conséquence jusqu'à ce que les coordonnées dorsale-ventrale au bregma et lambda diffèrent pas de plus de 0,04 mm.
- A cette époque, de réduire le gaz isoflurane à entre 2 et 2,5%.
- Retour à la perceuse bregma, remettre à zéro les coordonnées et ensuite passer la perceuse à la médio-latérale désirée et antéro-postérieure de coordonnées.
- Percer un trou à l'aide de coordonnées d'un foret de 0,9 mm car il produit un trou de taille appropriée pour un 28 G perfusion seringue.
- Mettre la pompe à perfusion pour délivrer virus à un débit de 0,2 ul / min. Placer la seringue dans le bras de perfusion du dispositif stéréotaxique et abaisser la seringue dans la coordination souhaitée. Fournir la quantité voulue de virus (varier de 0,1 à 0,8 ul). Par exemple, offrir 0,8 pi de AAV plus de 4 min.
Remarque: mener des études pilotes pour déterminer le volume d'infusion idéale et la propagation typique de virus dans chaque région d'intérêt.- Après la livraison du virus est complete laisser la seringue en place pendant 10 min pour empêcher le reflux dans les voies de l'aiguille. Soulevez lentement la seringue à un taux d'environ 5 mm / min. Répétez jusqu'à ce que toutes les coordonnées ont été infusé avec AAV.
- Fermer la plaie en utilisant des agrafes chirurgicales et manteau de la plaie avec une pommade antibiotique topique.
- Suivez les directives institutionnelles pour la gestion de la douleur post-opératoire.
- Placez le rat dans une cage avec literie, un couvercle et une signalisation adéquate et retourner le rat à l'animalerie.
- Si vous travaillez sous BSL-2 précautions, literie pour recueillir la quantité de temps (généralement 48-72 h) spécifié par les directives institutionnelles. Placez la literie dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux.
- Jetez tous les matériaux d'AAV contaminés comme spécifié par les lignes directrices pour leur élimination sûre.
3. Appareil Behavioral
Remarque: L'appareil de préconditionnement sensorielle consiste en un conditionnement opérant cham normeber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) avec un plancher inoxydable grille en acier, 2 parois latérales en plexiglas et 2 parois métalliques.
- Monter un 2,8 W lumière sur l'un des murs d'aluminium pour servir de la lumière de la maison et que le stimulus visuel lorsque flashé à 2 Hz. Monter un haut-parleur sur la chambre de livrer les stimuli auditifs (10 sec, 1500 Hz, 78 dB et un son pur dB bruit blanc 10 sec 78).
- Utilisation d'une trémie d'alimentation pour délivrer 45 mg de granulés de produits alimentaires dans la coupe des aliments. Dans la coupe de la nourriture, des cellules photoélectriques infrarouges détectent le temps total passé dans la tasse de nourriture avant, pendant et après les présentations des stimuli et des récompenses alimentaires.
- Maison des chambres dans des armoires de insonorisants (22 "W x 22" H x 16 "D) équipés de ventilateurs d'extraction (~ 68 dB).
- Utiliser un ordinateur PC avec le logiciel Med Associates pour contrôler la chambre opérant et acquérir les données. Pendant les séances de conditionnement, de recueillir des données sur le temps total passé avec la tête dans la tasse de nourriture pendant presentation du stimulus lumineux (5 sec époque) et lors de la présentation de la récompense alimentaire (5 sec d'époque). Au cours de la session de test, recueillir des données sur le temps total passé dans la tasse alimentaire en réponse aux présentations des stimuli auditifs (10 sec époque du début, quand les stimuli auditifs sont terminées).
4. Aperçu de la sensorielle préconditionnement Paradigm
- Suite à la récupération de la chirurgie, de restreindre progressivement l'alimentation des rats à 85% de leur poids corporel d'alimentation libre. Consultez le personnel vétérinaire pour un paradigme de restriction alimentaire approprié.
Remarque: le préconditionnement 3-sensoriel paradigme de phase est illustrée à la figure 2. - Préconditionnement Sessions (Phase 1; quotidiennes des sessions de formation de 64 min menée sur 4 jours consécutifs):
- Rats présents avec 12 essais entremêlées qui se composent de la livraison des stimuli auditifs et visuels. Inclure les intervalles inter-essai que moyenne de 4,5 min (intervalle de 4,0 à 5,0 min) après chacun unprésentation uditory.
- Le 6 des essais, présente une tonalité (relance préconditionnés) pendant 10 secondes, suivi immédiatement par une présentation de 5 sec du stimulus de lumière clignotante.
- Sur les 6 autres essais, présenter le bruit blanc (stimulus non apparié) seul pendant 10 sec.
- séances de conditionnement (Phase 2; Daily sessions de formation 64 min menée dans 5 jours consécutifs):
- Rats présents avec 8 essais qui se composent de la livraison du stimulus visuel (le stimulus de lumière clignotante) pendant 5 secondes immédiatement suivi par la livraison de deux boulettes de nourriture de 45 mg. Inclure les intervalles inter-essai cette moyenne 7 min (intervalle 6,0 à 8,0 min) après chaque essai. Parfois rats nécessitent plus de 5 séances de conditionnement d'apprendre l'association de la nourriture légère.
- Session d'essai (phase 3; une seule session de 78 min):
- Présenter les rats avec 12 essais entremêlées qui se composent de la livraison des seuls stimuli auditifs. Inclure les intervalles inter-essai que AVErage 4,5 min (intervalle de 4,0 à 5,0 min) après chaque présentation auditive.
- Le 6 des essais, présenter le stimulus de tonalité (le stimulus préconditionnés) seul pendant 10 sec.
- Sur les 6 autres essais, présenter le bruit blanc (le stimulus non apparié) seul pendant 10 sec.
- Contrebalancer les stimuli en complétant l'étude avec une deuxième série de rats qui reçoivent le bruit blanc que le stimulus préconditionnés et le ton que le stimulus non apparié.
5. pharmacologique et comportementale procédure
- Tournez sur la puissance de l'appareil de comportement et charger le code Med-PC pour la session de comportement approprié. Fil et le programme de l'appareil de comportement telles que les fans qui sont montés sur les armoires de son atténuation allument quand l'appareil est sous tension.
- Pour préparer une solution à 1 mg / ml de N-oxyde de la clozapine (CNO), peser 5,0 mg de CNO dans un tube conique de 15 ml et ajouter 5 ml d'eau stérile ou stérile 5 ml de 0,9% saliNE. Vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
- Si CNO ne se dissout pas dans la solution ou si des solutions plus concentrées de CNO on souhaite ajouter un agent de solubilisation, tel que le DMSO 23. Plus précisément, pour préparer une solution à 1 mg / ml de CNO avec 0,5% de DMSO, 5,0 mg de peser CNO et ajouter 25 ul de DMSO dans un tube conique de 15 ml. Flick doucement assurer que le contenu reste à la base du tube. Lorsque la solution devient limpide, ajoutez 5 ml d'eau stérile ou 5 ml de solution saline stérile à 0,9%. Des instructions supplémentaires pour la préparation de solutions de CNO sont disponibles sur la page des ressources DREADD wiki 25.
- Préparer une nouvelle solution CNO chaque jour qu'il est administré.
- Injecter le CNO intrapéritonéale à une dose de 1 mg / kg environ 30 min avant le test comportemental. Par exemple, une injection de 200 g de rat avec 0,2 ml de la / ml solution CNO 1 mg. Le cours de la dose et la durée d'administration CNO ont été sélectionnés sur la base de rapports précédemment publiés 2,12.
- Injecter CNO 30 min avant chaque session de préconditionnement (phase 1; total de 4 jours d'injections), mais administrer le véhicule avant de toutes les sessions ultérieures de comportement.
- Après 30 min, placer les rats dans les chambres de tests comportementaux et lancer le code informatique pour la session de comportement approprié.
- À la fin de la tâche comportementale, retirer immédiatement les rats issus des chambres et retourner les rats à la colonie animale.
6. Les analyses des données comportementales
Note: La variable dépendante pour toutes les sessions de comportement est la quantité de temps que la tête du rat est à l'intérieur de la tasse de nourriture comme détecté par l'interruption des cellules infrarouges dans la tasse de nourriture. Les données (à sec) sont recueillies et enregistrées par le logiciel de l'ordinateur.
- Ne pas effectuer des analyses sur des données générées pendant la phase de préconditionnement.
- Pour les séances de conditionnement: analyser l'un de chacun des ratsbilité d'apprendre l'association de la nourriture légère en comparant le comportement de tasse alimentaire durant la présentation du stimulus visuel à travers les 5 sessions de comportement. Plus précisément, calculer le temps moyen passé dans la tasse de nourriture pendant la lumière époque 5 sec pour chacun des 8 essais / session (soit une moyenne de 8 essais qui sont chacun 5 secondes dans la durée / rat). Comparez commande moyenne et les valeurs expérimentales pour chacune des 5 séances par jour (voir la figure 3A).
- Analyser la motivation des rats pour obtenir récompense alimentaire en comparant le comportement de coupe alimentaire lors de la livraison de la récompense alimentaire (5 sec d'époque) à travers les 5 sessions de comportement en utilisant le même calcul spécifiée pour l'époque de la lumière 5 sec ci-dessus. Ces valeurs seront systématiquement plus élevés que ceux acquis durant la présentation du stimulus visuel (voir la figure 3B).
- Pour la session de test: calculer un ratio de la discrimination qui décrit le comportement de la Coupe alimentaire des rats en réponse à pressentations de chaque stimulus auditif.
- Plus précisément, pour chaque rat, diviser le temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus préconditionnés sensorielle (par exemple, le ton) par la somme du temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations de la stimulus sensoriel préconditionnés (ie, le stimulus de la tonalité) et de la moyenne du temps total passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus non apparié (à savoir, le bruit stimulus blanc). Chaque époque est de 10 secondes dans la durée.
Note: Un score de discrimination de 0,5 ou plus démontre que les rats ont appris les associations inhérentes dans le paradigme de préconditionnement sensorielle.
- Plus précisément, pour chaque rat, diviser le temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus préconditionnés sensorielle (par exemple, le ton) par la somme du temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations de la stimulus sensoriel préconditionnés (ie, le stimulus de la tonalité) et de la moyenne du temps total passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus non apparié (à savoir, le bruit stimulus blanc). Chaque époque est de 10 secondes dans la durée.
7. Vérification de l'AAV placement et d'expression
- Anesthésier et perfuser les rats transcardiaque utilisant 4% de paraformaldéhyde. Grâce à l'utilisation de marqueurs fluorescents, ne pas dépasser un temps de post-fixation de 2 h à minla perte de l'antigénicité de imize et pour préserver le signal fluorescent.
- Déshydrater cerveaux perfusés en les transférant dans un pot de cerveau contenant 30 ml d'une solution de saccharose à 20% dans une solution saline tamponnée phosphate (1x) pour un minimum de 2 jours ou jusqu'à ce que le cerveau coule au fond du pot de cerveau.
- Utiliser un microtome coulissant congélation pour faire des coupes de cerveau coronale (20-40 um) dans toute l'étendue rostrocaudal de la région d'intérêt.
- Mener immunohistochimie dirigé contre le récepteur étiqueté ou la protéine rapporteur pour déterminer l'emplacement et l'expression du récepteur de concepteur et / ou rapporteur 12. Un protocole de coloration immunohistochimique est fourni sur la page des ressources DREADD wiki 25.
- Montez les sections sur des lames et lamelle SuperFrost-plus à l'aide de 100-200 ul d'un milieu de montage aqueux.
- Effectuer la microscopie à fluorescence sur le tissu du cerveau de vérifier le placement de l'AAV et l'expression des protéines 12,24.
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Representative Results
Résultats de comportement
À la fin de l'expérience, l'efficacité de l'inactivation temporaire spécifique à la région doit être évaluée quantitativement et qualitativement. Le présent exemple concerne un paradigme trois phases du comportement (préconditionnement sensoriel), dans lequel CNO a été administrée afin d'atténuer l'activité neuronale dans le RSC pendant les sessions de préconditionnement pour tester l'hypothèse que la SRC est nécessaire pour la formation d'associations entre stimuli neutre 12. Fait important, les expérimentateurs sont pas limités au paradigme comportemental ou protocole expérimental décrit ci-après comme la pharmacogénétique approche peut être couplé avec la plupart des paradigmes comportementaux.
Alors que les analyses ne sont pas généralement effectuées sur des données générées pendant les sessions de préconditionnement (Phase 1), il est important de quantifier si les rats ont appris l'association de la nourriture légère pendant les séances de conditionnement (Phase 2). Comme le montre la Fifigure 3A, à la fois expérimentales (Exp) et de contrôle (Ctrl) rats démontrent de plus en plus le comportement de coupe alimentaire pendant les présentations du stimulus lumineux (figure 3A) indiquant que les rats ont acquis une association pavlovien entre le stimulus visuel (lumière) et la récompense alimentaire. En outre, les deux groupes démontrent de plus en plus le comportement de coupe alimentaire lors de la présentation de la récompense alimentaire (figure 3B) indiquant la motivation équivalente pour obtenir une récompense. Au cours de la session de test critique, lorsque les stimuli auditifs sont présentés en l'absence d'autres stimuli, les rats témoins ont un indice de discrimination qui est significativement différente de rats expérimentaux (Figure 3C). L'inspection visuelle du graphique révèle que le rapport de la discrimination moyenne de rats témoins est supérieure à 0,5, ce qui indique une plus grande comportement tasse alimentaire en réponse à des présentations du stimulus auditif qui a été jumelé avec la lumière (au cours du préconditionnement) par rapport à leur tasse de nourriturecomportement en réponse à des présentations de stimulus auditif qui a été apparié (au cours du préconditionnement). En revanche, les rats de laboratoire ne parviennent pas à démontrer un score de différence qui est au-dessus de chance. Ainsi, la figure 3C montre que les rats expérimentaux contrôle mais pas montré l'effet de préconditionnement sensorielle.
Vérification de l'AAV Placement
À l'achèvement des essais de comportement, analyser rat tissu cérébral pour le placement et l'expression du récepteur de concepteur correcte. Conduite 12,25 immunohistochimie utilisant des anticorps primaires dirigés contre une balise de récepteur (par exemple, un anticorps primaire anti-HA) ou le rapporteur fluorescent (dans cet exemple, mcitrine qui est détecté par un anticorps dirigé contre la protéine fluorescente verte (GFP)). Un schéma d'une section coronale par le cerveau du rat est représenté sur la figure 4A. La figure 4B illustre robuste immunodétection de la prot fluorescent rapporteur. ein dans la RSC dans un rat expérimental représentant sans marqueur fluorescent détecté dans les régions entourant les figures 4C - D illustrent représentant marquage fluorescent de protéines rapporteurs dans expérimental (Expt; rats ont été perfuses avec une construction d'AAV contenant le gène du récepteur de créateur et le gène de mcitrine ) et de contrôle (Ctrl; rats ont été perfuses avec une construction d'AAV similaire contenant le gène de la GFP, mais pas de séquence pour le récepteur créateur) chez le rat, respectivement. les niveaux de récepteurs peuvent également être affichées comme minimum, représentatif et l'expression maximale 24. Si l'étiquetage est détectée dans des régions à l'extérieur de la zone d'intérêt, d'exclure les données des analyses comportementales.
Figure 1:. Diagramme schématique de la construction d'AAV Un diagramme de la Hsyn-HA-hM4D (Gi) IRES-mCitrine AAV utilisé à express le récepteur de concepteur inhibitrice (hM4Di) en vertu d'un promoteur spécifique neuronale synapsine (Hsyn) dans les neurones RSC. reporters immunofluorescence (HA-tag et / ou mcitrine) peuvent être utilisés pour visualiser l'expression de la protéine et journaliste, respectivement. Hsyn, promoteur de synapsine humaine; spécifie expression dans les neurones. HA, hemagluttinin étiquette; cette balise est fusionné au récepteur de concepteur et sert comme un marqueur d'épitope permettant la détection de l'expression du récepteur. hM4Di, le gène pour le récepteur couplé créateur inhibiteur de protéine G. IRES, le site d'entrée de ribosome interne; permet le journaliste (mcitrine) à traduire. mcitrine, un rapporteur fluorescent qui est une variante de la GFP, mais est plus résistant au photoblanchiment.
Figure 2: Schéma du paradigme de préconditionnement sensorielle (A) Pendant le préconditionnement, sess.ions, 12 essais entremêlées sont présentés. Au cours des 6 essais, un stimulus auditif est présenté pendant 10 secondes suivi immédiatement par un stimulus maison de lumière clignotante (2 Hz, pendant 5 secondes). Pendant les 6 autres essais, un deuxième stimulus auditif est présenté sans un stimulus visuel. (B) Pendant les séances de conditionnement, le stimulus visuel déjà jumelé est jumelé avec récompense alimentaire. (C) Au cours de la session de test, il ya 12 présentations entremêlées des deux stimuli auditifs en l'absence de stimuli visuels ou de la nourriture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Les résultats comportementaux tasse alimentaire moyen de répondre au cours de la (A) Lumière et (B) époques alimentaires Dusonner les séances de conditionnement (Phase 2). Les données ont été analysées en utilisant des mesures répétées analyse de variance. ratios (C) de discrimination lors de la session de test (phase 3). La ligne pointillée indique des quantités égales de climatisation tasse alimentaire répondant à chaque stimulus auditif (ie, pas de préconditionnement sensorielle) Les données ont été analysées à l'aide d'échantillons indépendants t-test. Exp; rats expérimentaux (n = 17) infusées avec une construction d'AAV contenant la séquence d'ADN pour le récepteur du G-protéine inhibitrice créateur couplé (hM4Di) et la séquence d'ADN pour un rapporteur fluorescent (mcitrine). Ctrl; les rats témoins (n = 6) et perfusé avec hM4Di véhicule administré combiné avec les rats témoins (n = 4) perfusé avec un virus de l'AAV qui ne contient pas le récepteur de créateur et qui ont été administrés CNO. Les groupes témoins ne différaient pas significativement l'une de l'autre (p> 0,05). Les barres d'erreur indiquent ± SEM.
Figure 4: vérification histologique de l'expression de protéine (A) Un schéma illustrant l'emplacement de la RSC dans une section coronale par le cerveau de rat.. (B) des images représentatifs d'immunohistochimie marqué tissu de cerveau de rat à partir d'un rat expérimental (Exp) qui a été infusé avec une construction d'AAV contenant la séquence d'ADN pour le récepteur de créateur couplé à la protéine G inhibitrice (hM4Di) et la séquence d'ADN pour un rapporteur fluorescent ( mcitrine). mcitrine est une variante hautement résistant à la décoloration de la protéine fluorescente verte. (C) d'image représentant d'un rat expérimental illustrant l'emplacement de l'étiquette de rapporteur fluorescent (de mcitrine). (D) de l'image représentative à partir d'un rat de contrôle (Ctrl) infusé avec une construction d'AAV contenant la séquence d'ADN pour un rapporteur fluorescent (GFP améliorée). Les barres d'échelle: B, 500 um; C et D, 10081;. M S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit comment appliquer une approche pharmacogénétique (DREADD) d'étudier comment une région spécifique du cerveau contribue à une tâche d'apprentissage complexe multi-phase. Avec la possibilité de faire taire temporairement et à distance l'activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau à travers les phases de l'apprentissage, cette combinaison d'approches fournit une plate-forme pour enquêter sur un large éventail de comportements, y compris les formes plus nuancées ou masquées de l'apprentissage. Dans l'exemple décrit dans ce protocole, lutte contre les rats et les rats qui expriment le récepteur de concepteur dans le cortex rétrosplénial (RSC) ont été testés dans une tâche comportementale 3 phases 12. La première phase de la tâche impliquée présentation de multiples stimuli neutres avec l'hypothèse qui contrôlent rats acquerrait une association stimulus-stimulus entre deux des stimuli. L'hypothèse de travail est que la SRC est nécessaire pour l'apprentissage de stimulus-stimulus, ainsi, sur chacun des 4 jours de conditionnement, 30 min avant le début du test comportementalING, le contrôle et les rats expérimentaux ont reçu soit l'administration systémique de la drogue de concepteur (CNO) ou d'un véhicule. Quand liée au récepteur de concepteur, CNO réduit l'activité des neurones dans lequel ce récepteur est exprimé. Pendant les phases restantes de conditionnement et d'essai de comportement, lorsque la SRC n'a pas l'hypothèse d'influencer l'apprentissage, le CNO n'a pas été administré et donc l'activité neuronale n'a pas été perturbé.
Étapes critiques dans le Protocole
La manipulation sécuritaire des composés d'AAV: Les interventions chirurgicales impliquées dans l'approche pharmacogénétique ne sont techniquement plus exigeante qu'une infusion stéréotaxique simple, cependant, l'utilisation de l'AAV dans certains établissements nécessite que les expérimentateurs adhèrent à BSL-2 précautions. Il est essentiel que les enquêteurs suivent les lignes directrices établies par les Centers for Disease Control, les organismes de financement, les établissements d'origine et d'autres comités de surveillance spécifiques à leur programme de recherche. Informations sur ee manipulation sécuritaire des AAV est facilement disponible 13.
Préparation et l'administration du médicament créateur: CNO, le médicament de marque, se lie au récepteur de concepteur et de silences activité neuronale, mais est contraire biologiquement inerte 1,3. Livraisons des CNO de fournisseurs peuvent varier en cohérence. Le composé doit arriver sous forme de poudre qui ne sont pas adhéré aux parois du récipient.
Groupes témoins importants à considérer: Pour contrôler les effets non spécifiques de la drogue de concepteur, avant le test comportemental, insufflent un ensemble différent de rats expérimentaux (ie, ceux qui expriment le récepteur de designer) avec des injections de véhicules au lieu de CNO. En outre, pour contrôler les effets non spécifiques du récepteur de designer comprennent un groupe de rats qui sont infusées avec un virus de commande qui contient un rapporteur fluorescent mais pas le récepteur design modifié et injecter ces rats avec le médicament de marque (c.-à-CNO) . Ensunouveau design expérimental adéquat en contrebalançant les groupes.
Vérification expression de la construction: Il ya un certain nombre de façons de maximiser l'expression et la détection du récepteur de designer. Avant la perfusion, vérifiez que le titre viral est près de 10 12 particules / ml. Souvent, la visualisation du reporter fluorescent est faible et, par conséquent, il est recommandé que l'immunohistochimie être réalisée sur la région d'intérêt en utilisant des anticorps dirigés contre le rapporteur (s) inclus dans le produit d'assemblage viral 25. Dans cet exemple, l'immunoréactivité anti-GFP fournit un signal robuste (figures 4B - D). Il est important, en raison de la nature des marqueurs fluorescents, de limiter la durée du temps de fixation de deux heures.
Avantages des Techniques
Une fois la construction virale a été livré au cerveau par chirurgie stéréotaxique, l'approche pharmacogénétique permet la INACTIF temporairevation de l'activité cérébrale dans des régions discrètes à l'aide d'une injection systémique mini-invasive de la drogue de concepteur. L'administration du médicament peut se produire plusieurs fois, ce qui est avantageux pour des tâches de comportement qui se produisent sur des jours ou des semaines successives 12,24,26. En outre, la preuve indique que le médicament de marque (CNO) ne pas interférer avec le comportement locomoteur ou de l'appétit 27,28. Ainsi, le procédé offre la possibilité d'atténuer l'activité neuronale pendant une courte période de temps (5/2 h), tout en évitant les facteurs de stress inhérents à d'autres méthodes d'inactivation temporaire. Plus précisément, dans les études de canulation, inactivation temporaire est obtenu par la livraison des neurotoxines à travers des canules qui sont fixés de façon permanente sur le crâne. Cette approche est limitée par le fait que garder la canule claire de débris et protégé est difficile. En outre, pour induire l'inactivité, les animaux sont traités abondamment (pour administrer la toxine à travers la canule) juste avant les tests de comportement, WHIch impose des contraintes sur l'animal et augmente également la probabilité que les canules peut déloger du crâne. Parce que les effets de la CNO sont relativement court terme, la possibilité de mécanismes de compensation à long terme (tels que ceux observés à la suite de lésions permanentes ou chez des souris génétiquement modifiées) sont réduites au minimum 29,30.
Limitations des Techniques
DREADD est une méthode relativement nouvelle d'atténuer de manière non invasive l'activité neuronale. Comme ces expérimentateurs peuvent être enclins à vérifier de manière indépendante que le silençage neuronale se produit dans leur préparation. La vérification peut être effectuée en utilisant des approches électrophysiologiques, mais ces expériences sont long, coûteux et nécessitent des compétences spécifiques. En outre, tandis que les techniques chemogenetic sont moins coûteux que optogénétique, l'approche est plus cher que l'inactivation traditionnelle avec des agents pharmacologiques tels que TTX. Une autre limitation de l'approche DREADD est que Infusion des constructions virales ne conduit pas à une infection de 100% des neurones de la région d'intérêt, pas plus que par l'intermédiaire d'inactivation CNO conduisent à la réduction de l'activité neuronale à 100%. Enfin, certains sérotypes d'AAV peuvent être transportés par voie rétrograde qui peut compliquer l'interprétation des résultats expérimentaux 2.
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Acknowledgments
Nous remercions les auteurs de Robinson et al. 12 pour leurs contributions à le manuscrit à partir de laquelle ce protocole est partiellement dérivé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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