Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

שיטה להשתקה מרחוק עצבית פעילות במכרסמים בשלבים בדידים של למידה

Published: June 22, 2015 doi: 10.3791/52859

Abstract

פרוטוקול זה מתאר כיצד באופן זמני ומרחוק כדי להשתיק את הפעילות עצבית באזורי המוח בדידים בעוד בעלי החיים עוסקים במשימות למידה וזיכרון. הגישה משלבת Pharmacogenetics (מעצב-רצפטורים-הופעל באופן בלעדי על ידי מעצב-בסמים) עם הפרדיגמה התנהגות (נפשית מראש חושי) שנועד להבחין בין צורות שונות של למידה. באופן ספציפי, משלוח בתיווך נגיפי משמש להביע קולט G-חלבון מעכב מהונדס גנטי בשילוב (מעצב קולט) לאזור במוח בדיד במכרסמים. שלושה שבועות לאחר מכן, כאשר רמות ביטוי קולט מעצב הן גבוהות, סוכן תרופתי (מעצב התרופות) מנוהל מערכתי 30 דקות לפני פגישת התנהגות ספציפית. יש תרופת זיקה לקולטן מעצב ובכך גורמת לעיכוב של נוירונים המבטאים את הקולטן המעצב, אבל אחרת אינרטי מבחינה ביולוגית. האזור במוח נשאר מושתק במשך 2-5 שעות (depenדינג על המינון ודרך המתן). עם השלמת הפרדיגמה ההתנהגות, רקמת המוח נבחנת למיקום נכון וביטוי הקולטן. גישה זו שימושית במיוחד לקביעת התרומה של אזורים במוח אדם לרכיבים ספציפיים של התנהגות וניתן להשתמש בו על פני כל מספר של פרדיגמות התנהגות.

Introduction

אתגר מרגש בתחום מדעי מוח התנהגות הוא לקבוע את מצעים העצביים של התנהגויות מורכבות. מספר הטכניקות כגון נגעים קבועים, איון מוח זמני באמצעות שתלי cannulae וoptogenetics להיות מועסק לזהות את תרומתם של אזורים במוח הבדידים למשנה של התנהגויות מורכבות. בעוד גישות אלה להודיע ​​ההבנה ספציפיות האזורי שלנו בלמידה, כל טכניקה היא לא בלי מגבלות. באופן ספציפי, נגעים קבועים מתבצעים בדרך כלל לפני בדיקות התנהגותיות, כך ההשפעות שלהם נמצאות בכל משך הזמן של הפרדיגמה. מחקרי Cannulation שכרוכים בהצגת inactivator טווח קצר עצבי (למשל, tetrodotoxin) יכול לייצר נזק משמעותי לרקמת מוח ויכול לגרום ללחץ בנושאים רק לפני בדיקות התנהגותיות. יתר על כן, איון באמצעות cannulation מוגבל לאזור של רקמה המקיף אתקצה cannulae. לבסוף, בעוד optogenetics מציע מגוון רחב של גמישות לשליטה הזמנית של פעילות באזורי מוח מסוימים, זה העלות ותובענית מבחינה טכנית.

ניתן להתגבר על המגבלות האלה באמצעות גישה pharmacogenetic (מעצב-הופעל באופן בלעדי על ידי מעצב-בסמים רצפטורים, DREADDs) 1,2. חשוב לציין, בזמן שמושג Pharmacogenetics הוא מתוחכם, ביצוע הטכניקה הוא פשוט. בדומה לשיטות ניתוחיות stereotaxic מסורתיים הכוללות עירוי של רעלן (למשל, NMDA, חומצת ibotenic) לאזורים במוח בדידים, טכניקה זו כרוכה בהחדרת וירוס adeno הקשורים (AAV) שמכיל קטע DNA לקולטן G- חלבון מעכב שונה בשילוב (HM4Di; קולט המעצב) לאזור של עניין של מכרסמים מעבדה סטנדרטיים (ראה איור 1). הווקטור הנגיפי מכיל גם כתב ניאון (mcitrine). ברגע שהתאגד בלתאים, קולט המעצב (וחלבון כתב) הם מקסימאלי הביעו ~ 3 שבועות לאחר עירוי-ויכולים להיות מופעל באופן סלקטיבי במשך 2-5 שעות על ידי ממשל מערכתי של תרופת מעצב אחר אינרטי מבחינה ביולוגית, קלוזאפין-N-תחמוצת (CNO) 1 , 3. בגלל ניסוי ניחן בשליטה זמנית מדויקת, עדיין רחוקה מעל הפעילות עצבית באזורים מסוימים במוח, Pharmacogenetics משלב טוב במיוחד עם פרדיגמות התנהגות שנערכות בשלבים מרובים. בדוגמא זו, התרומה של קליפת retrosplenial (RSC) ללמידה בהשוואה לתפקידה בלמידה הפבלובית-גירוי גירוי, לעומת זאת, השילוב של גישות הוא גם מתאים לכל מספר של שאלות שמבקשים לזהות כיצד ספציפי אזורים במוח תורמים ל התנהגות מורכבת.

בנוסף, בזמן שאינו מתואר בפרוטוקול הנוכחי, ניתן להשתמש בגישות ויראלי ומהונדסות כדי להשיג ביטוי DREADD סוג ספציפי תא 2. כפי שים הגלום בפרדיגמות התנהגות שכרוכות תרופתיים ו / או סוגים אחרים של מניפולציות ניסוייות, שיקול זהיר של תכנון ניסוי וניתוח כמותי שלאחר מכן נדרש כאשר העסקת גישת DREADD. הנסיינים חדשים לגישת DREADD מכונים סקירה מקיפה של טכנולוגית DREADD הנוכחית 2.

בכל יום, אורגניזמים ללמוד על גירויים חדשים ואירועים ומערכות היחסים שלהם אחד לשני. גם בסביבה מוכרת, כגון בית, אחד הוא מהיר כדי לזהות שינויים במערכות היחסים בין גירויים, כי שינויים אלה עשויים להיות חזוי של אירועים משמעותיים. גירוי-גירוי כזה (כלומר, יחסים) למידה כרוכה איחוד של גירויים מרובים ובאופן מסורתי נקשר עם ההיפוקמפוס, שמתגורר במרכז בתוך האונה הטמפורלית מדיאלית 4. עם זאת, ההיפוקמפוס אינו קיימת ולא לפעול בבידוד; אזורים בקליפת המוח הן בתוך ומחוץצד של האונה הטמפורלית מדיאלית לספק מידע חושי קריטי להיווצרות בהיפוקמפוס 5-7. מחקרי נגע קבועים מסורתיים לספק ראיות משכנעות למעורבותם של מספר האזורים בקליפת המוח (למשל, הקורטקס retrosplenial, postrhinal וentorhinal) בלמידה בהיפוקמפוס תלוי אך מוגבלים ביכולתם להבחין בתפקיד של אזור מסוים בשלבים בדידים למידת 8-10.

הפרוטוקול הנוכחי בוחן את ההשערה שRSC הכרחי ללמידת גירוי-גירוי על ידי השתקת RSC בשלב אחד של פרדיגמה נפשית מראש חושי 3-שלב 11,12. בקצרה, חולדות לקבל עירויים של AAV שמכיל את הקולטן המעצב ו~ 3 שבועות לאחר מכן מנוהלים סמים מעצב (CNO) 30 דקות לפני תחילת בדיקות התנהגותיות. בפרוטוקול הנוכחי, חולדות ניסוי לקבל CNO במהלך השלב הראשון של בדיקות (כאשר ליר גירוי-גירוינינג מתרחש) והם מקבלים רכב במהלך 2 השלבים הבאים של בדיקות. כדי לשלוט על השפעות מכוונות של CNO על התנהגות, להחדיר חולדות עם קולט המעצב (hM4Di) ולהזריק עם רכב במקום CNO. כדי להסביר את תופעות כלליות של עירוי נגיפי וביטוי הקולטן, להחדיר וירוס שליטה שאינו מכיל את הקולטן המעצב ולנהל CNO.

מספר קפסיד השונים של AAV משמש כדי לספק חומר גנטי. הנחיות NIH הנוכחיות למחקר מעורב רקומביננטי או מולקולות סינטטיים שומרת AAV ש( כל קפסיד) ומבני AAV רקומביננטי או סינטטיים, שבו transgene לא לקודד או מוצר גן פוטנציאל סרטני או מולקולת הרעלן ומיוצרים בהעדר וירוס עוזר, דורש BSL-1 אמצעי זהירות (נספח B-1. סיכון קבוצת 1 (RG1) סוכנים) 13. מספר ביקורות הנוגעות למבנה AAV, שירות ובטיחות זמין 14,15. יש לציין, אם כי, בשל חששות הנוגעים ל16,17 ופוטנציאל מנגנונים אפשריים רבייה מסרטנת 18-20 במכרסמים ל, חלק ממוסדות דורשים שימוש ב- 2 מנהלת הליגה אמצעי זהירות בעת עבודה עם AAV. ודא מנהלת הליגה המתאימה לפני השימוש על ידי התייעצות עם ועדות פיקוח במוסדות בודדים שבי המחקר ייערך, המרכז לבקרת מחלות והנחיות NIH למחקר מעורב רקומביננטי DNA מולקולות 13 בעת שימוש בוקטורים ויראליים למניפולציה גנטית בארצות הברית. הגנה אישית, הכשרת חוקר, בלימת וקטור, טיהור, סילוק חומרי חיטוי, ובעלי חיים לאחר הזרקת דרישות דיור שצוינו על ידי הנחיות אלה. בנוסף, להתייעץ ועיקבו אחרי מוסדי טיפול בבעלי חיים מתאים ובהתאם להנחיות וועדה או הנחיות ועדת ביקורת מוסדיות שווה ערך על מנת להבטיח את הטיפול, הממשל וסילוק של AAV הבטוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש בבעלי החיים מאושר על ידי מכללת אוברלין המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש והנו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחי המעבדה 21.

1. הכנה לעירוי ויראלי

הערה: פרוטוקול זה משתמש BSL-1 אמצעי זהירות. כאשר העסקת BSL-2 באמצעי זהירות, חלוק מעבדה חד פעמי, כפפות, נעליים מכסה, הגנות העין והנשמת חלקיקים (הקלד N95) נדרשים. כל אנשי טיפול BSL-2 תרכובות חייבים להיות בכושר נבדקו להנשמת חלקיקים על ידי סוכנות לבריאות הציבור מקומית. עיין אפלולי וMajewska (2010) 22 לפרטים נוספים על טיפול ואחסון של וקטורים ויראליים.

  1. עם השימוש ראשון, aliquot וחנות וירוס שאינו בשימוש ב 20 צינורות microcentrifuge μl כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
  2. הכן את משטח העבודה על ידי הסרת כל חפצים מיותרים וחיטוי את פני השטח עם 70% אתנול. הכן 10% פתרון אקונומיקה לdecontaminating פסולת AAV. מניחים כוס מלאה של פתרון אקונומיקה ומזרק 10 μl סטרילי על גבי משטח העבודה. מניחים את צינור microcentrifuge עם AAV במכל עם קרח כתוש בלהגדיר.
  3. מניחים את צינור microcentrifuge עם הווירוס לסגן ספסל סטנדרטי. לטעון מזרק 10 μl עם לפחות 4 μl של AAV. הקפד לא לכופף את קצה המזרק נגד התחתון של צינור microcentrifuge במהלך טעינה. ודא שאין בועות אוויר בμl 4 של פתרון AAV במזרק.
  4. השלך את צינור הווירוס הריק בכוס המכילה אקונומיקה 10%. אחסן חלקים שאינם בשימוש של הנגיף כמפורט על ידי הספק.
  5. להוסיף אקונומיקה 10% נוספות למכל הפסולת, ופסולת תאפשר לשבת במשך 30 דקות לפני השלכת הפסולת הנוזלית לחטא.
  6. השלך את כל ציוד מגן ופסולת פלסטיק במכל Biohazard כפי שהורה הנחיות מוסדיות. דקוntaminate כל ציוד או משטחים שבאו במגע עם הנגיף באמצעות אקונומיקה 10%.

2. ניתוח

  1. הכן את אזור הניתוח על ידי הנחת נייר סופג ספסל תחת מנגנון stereotaxic ועל חלל סמוך, המיועד כטיפול אזור וירוס ייעודי.
    1. מניחים 10% מיכל פסולת אקונומיקה באזור טיפול וירוס הייעודי ליד המכשיר כירורגי.
  2. לגרום לרמה קבועה של הרדמה ולהכין את החולדה לניתוח.
    1. מניחים את החולדה לתא אינדוקציה המכיל תערובת של גז isoflurane (טווח של 1 עד 3%) וחמצן (100% בכ 1 ליטר / דקה) עד שיש איבוד ההכרה וחוסר התנועה תכליתית ברוטו. לשמור על ההרדמה isoflurane לאורך ההליך הכירורגי.
    2. לאחר 6 הרדמה עמוקה מושגת, לגלח את העכברוש מבין העיניים למעט מאחורי האוזניים.
    3. מניחים את החולדה בחזרה לתא האינדוקציה ל1-3 דקות נוספות.
    4. ודא שמערכת ההרדמה isoflurane מחוברת לחרטום של ניתוח stereotaxic. פתח את השסתום על צינור isoflurane להתחיל את זרימת isoflurane לstereotax. לשמור על isoflurane וחמצן ברמות שצוינו לעיל.
    5. מניחים את החולדה במנגנון stereotaxic ידי הבטחת הפה על הבר הביס ואבטחת הברים האוזן.
    6. החל סיכה עין בעיניים ובטאדין לאתר כירורגית לפני החתך.
  3. לעשות חתך קו האמצע של 2.4 סנטימטר של העור על פני השטח הגבי של הגולגולת מתחיל כ 2 מ"מ הזנב לעיניים. לחזור העור לחשוף את הגולגולת. מעת לעת לטעת 0.9% תמיסת מלח סטרילית סטרילי בשולי האתר כירורגית כדי למנוע רקמות מייבוש.
  4. רקמה קרומית ברורה מהגולגולת עד גבחת ומבדה גלויה לעין.
  5. ודא שהגולגולת היא על ידי מדידת רמת הקואורדינטות הגבי-הגחון בגבחת ולמבדה. התאם את מכשיר stereotaxic בהתאם עד קואורדינטות הגבי-הגחון בגבחת ומבדה שונות על ידי לא יותר מ 0.04 מ"מ.
  6. בשלב זה, לצמצם את גז isoflurane לבין 2 ל 2.5%.
  7. להחזיר את התרגיל לגבחת, rezero הקואורדינטות ולאחר מכן להעביר את התרגיל לרצוי המדיאלי-צדדי וקדמי, אחורי לתאם.
  8. לקדוח חור בלתאם באמצעות מקדח 0.9 מ"מ כפי שהיא מייצרת חור בגודל מתאים למזרק עירוי G 28.
  9. הגדר את משאבת העירוי כדי לספק וירוס בשיעור של 0.2 μl / דקה. מניחים את המזרק לתוך זרוע העירוי של מכשיר stereotaxic ולהפחית את המזרק לתוך הרצוי לתאם. לספק את הכמות הרצויה של וירוס (טווח 0.1-0.8 μl). לדוגמא, לספק 0.8 μl של AAV מעל 4 דקות.
    הערה: לבצע מחקרי טייס לקבוע אידיאלי עירוי נפח וההתפשטות הטיפוסית של וירוס בכל אזור של עניין.
    1. לאחר המסירה של וירוס הוא שיתוףmplete לעזוב את המזרק במקום במשך 10 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת למערכת המחט. לאט לאט להעלות את המזרק בשיעור של כ -5 מ"מ / דקה. חזור על פעולה עד כל הקואורדינטות כבר חדורות AAV.
  10. לסגור את הפצע באמצעות סיכות כירורגיות ומעיל הפצע עם משחה אנטיביוטית מקומית.
  11. פעל לפי הנחיות מוסדיות לניהול כאב שלאחר ניתוח.
  12. מניחים את החולדה בכלוב עם מצעים, מכסה ושילוט מתאים ולהחזיר את החולדה למתקן בעלי החיים.
    1. אם עובד תחת BSL-2 באמצעי זהירות, לאסוף כלי מיטה לכמות הזמן (בדרך כלל 48-72 שעות) שצוינה על ידי הנחיות מוסדיות. הנח מצעים למכל פסולת ביולוגית מסוכנת.
    2. השלך את כל החומרים מזוהמים AAV כמפורט בהנחיות לסילוק הבטוח שלהם.

3. מכשירי התנהגות

הערה: המנגנון נפשית מראש החושי מורכב של צ'אם תניה אופרנטית סטנדרטיבער ("x 9.5 L" x 11.5 "H 12 W) עם רצפת רשת פלדת אל-חלד, 2 הצדדיים פרספקס ו 2 קירות מתכת.

  1. הר אור 2.8 W על אחד קירות האלומיניום לשמש אור הבית וכגירוי החזותי כאשר הבזיקו ב2 הרץ. הר רמקול בחדר כדי לספק את הגירויים השמיעתיים (10 שניות, 1500 הרץ, טון 78 dB טהור ורעש לבן dB 10 שניות 78).
    1. השתמש הופר מזון כדי לספק 45 כדורי מזון מ"ג לתוך כוס מזון. בתוך כוס המזון, photocells אינפרא אדום לזהות את סך כל הזמן בילה בכוס המזון לפני, במהלך ואחרי מצגות של הגירויים ותגמולים מזון.
    2. בית התאים בארונות מרכך-קול (ד H x 16 "" W x 22 "22) לבוש עם אוהדי פליטה (~ 68 dB).
    3. להשתמש במחשב PC עם תוכנת מד Associates לשלוט קאמרי אופרנטית ולרכוש את הנתונים. במהלך פגישות אוויר, לאסוף נתונים על הזמן הכולל בילה עם הראש בכוס המזון במהלך presentation של (עידן 5 שניות) גירוי האור ובמהלך הצגת גמול מזון (5 עידן שניות). במהלך פגישת המבחן, לאסוף נתונים על הזמן הכולל בילה בכוס המזון בתגובה למצגות של הגירויים השמיעתיים (תחילת עידן 10 שניות כאשר הגירויים השמיעתיים הסתיימו).

4. סקירה של החושית אכשור קד פרדיגמה

  1. בעקבות התאוששות מניתוח, בהדרגה מזון להגביל את החולדות עד 85% ממשקל גוף האכלה החופשי שלהם. התייעץ עם צוות וטרינרים לפרדיגמה הגבלת מזון מתאימה.
    הערה: הפרדיגמה נפשית מראש חושי 3-השלב מתואר באיור 2.
  2. אכשור קד מושבים (שלב 1; אימונים יומיים 64 דקות שנערכו על פני 4 ימים רצופים):
    1. חולדות הנוכחיות עם 12 ניסויים שהתערבבו מורכב ממסירה של גירויים שמיעתיים וחזותיים. כוללים מרווחים בין משפט שדקות ממוצעת 4.5 (טווח 4.0-5.0 דקות) לאחר כלמצגת uditory.
    2. ב -6 בניסויים, (הגירוי מותנה מראש) טון הנוכחי במשך 10 שניות, ומייד אחרי מצגת 5 שניות של גירוי האור המהבהב.
    3. על אחרים 6 הניסויים, להציג את הרעש הלבן (גירוי מזווג) לבד במשך 10 שניות.
  3. (; מפגשים יומיים 64 דקות אימון שנערכו על פני 5 ימים רצופים שלב 2) הפעלות אוויר:
    1. חולדות הווה עם 8 ניסויים שמורכבים ממסירה של הגירוי החזותי (גירוי האור המהבהב) במשך 5 שניות ומייד אחרי מסירה של שני כדורי מזון 45 מ"ג. כולל מרווחים בין משפט כי 7 דקות ממוצעת (טווח 6.0-8.0 דקות) אחרי כל משפט. לפעמים חולדות דורשות יותר מ -5 מפגשי אוויר כדי ללמוד עמותת מזון הקלה.
  4. מבחן מושב (שלב 3; פגישת 78 דקות בודדת):
    1. להציג את החולדות עם 12 ניסויים שהתערבבו מורכב ממסירה של הגירויים השמיעתיים לבד. כוללים מרווחים בין משפט שישתוזעם 4.5 דקות (טווח 4.0-5.0 דקות) לאחר כל הצגה שמיעתית.
    2. ב -6 בניסויים, להציג את גירוי הטון (הגירוי המותנה מראש) לבד במשך 10 שניות.
    3. על אחרים 6 הניסויים, להציג את הרעש הלבן (הגירוי מזווג) לבד במשך 10 שניות.
  5. משקל נגד לגירויים על ידי השלמת המחקר עם קבוצה שנייה של חולדות שקבלו את הרעש הלבן כגירוי המותנה מראש ואת הטון כמו הגירוי מזווג.

5. תרופתי והתנהגות נוהל

  1. הפעל את כוח מנגנון ההתנהגות ולטעון את קוד Med-PC לפגישת ההתנהגות המתאימה. תיל ותכנית מנגנון ההתנהגות כזו שהאוהדים שהם רכובים על ארונות הקול מרכך להפעיל כאשר הכח מופעל.
  2. כדי להכין פתרון 1 מ"ג / מיליליטר של קלוזאפין N-תחמוצת (CNO), שוקל 5.0 מ"ג של CNO לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 5 מיליליטר של מים סטריליים או 5 מיליליטר של סאלי 0.9% סטריליne. מערבולת עד הפתרון היא ברורה.
    1. אם CNO לא לפזר לפתרון או אם פתרונות מרוכזים יותר של CNO הם רצויים להוסיף סוכן solubilizing, כגון DMSO 23. באופן ספציפי, כדי להכין את פתרון 1 מ"ג / מיליליטר של CNO עם 0.5% DMSO, שוקל 5.0 מ"ג של CNO ולהוסיף 25 μl של DMSO לצינור חרוטי 15 מיליליטר. פליק בעדינות על מנת להבטיח כי התוכן יישאר בבסיס של הצינור. כאשר הפתרון מתברר, להוסיף 5 מיליליטר של מים סטריליים או 5 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% סטרילי. הוראות נוספות להכנת פתרונות של CNO זמינות בדף משאבי ויקי DREADD 25.
    2. הכן פתרון CNO חדש בכל יום שהוא מנוהל.
  3. הזרק CNO intraperitoneally במינון של 1 מ"ג / קילוגרם כ 30 דקות לפני בדיקות התנהגותיות. לדוגמא, להזריק עכברוש 200 גרם עם 0.2 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון CNO. כמובן במינון והזמן של ממשל CNO נבחרו על סמך דיווחים שפורסמו בעבר 2,12.
    1. הזרק CNO דקות 30 לפני כל פגישה נפשית מראש (שלב 1; כולל של 4 ימים של זריקות) אבל לנהל את הרכב לפני כל מפגשי ההתנהגות שלאחר מכן.
  4. לאחר 30 דקות, מניח את החולדות לתאי הבדיקות התנהגותיות וליזום את קוד המחשב לפגישת ההתנהגות המתאימה.
  5. עם השלמת המשימה התנהגותיות, להסיר באופן מיידי את החולדות מהתאים ולהחזיר את החולדות למושבה של בעלי החיים.

6. ניתוח של התנהגות נתונים

הערה: המשתנה התלוי לכל מפגשי ההתנהגות הוא כמות הזמן שראשו של העכברוש הוא בתוך כוס המזון כפי שזוהה על ידי הפרעה של תאי אור אינפרא אדום בכוס המזון. נתונים (בשניות) נאספים ונרשמו על ידי תוכנת המחשב.

  1. אל תנהל ניתוחים על הנתונים שנוצרו בשלב אכשור קד.
  2. למפגשי אוויר: לנתח כל חולדותbility ללמוד עמותת מזון האור על ידי השוואת מזון כוס התנהגות במהלך המצגת של הגירוי החזותי על פני 5 מפגשי התנהגות. באופן ספציפי, לחשב את הזמן הממוצע בילה בכוס המזון בעידן האור 5 שניות לכל אחד מניסויים 8 / מושב (כלומר, ממוצע של 8 ניסויים שכל 5 שניות בזמן / חולדה). שקלו את השליטה ממוצעת וערכים ניסיוניים עבור כל 5 מפגשים יומיים (ראה איור 3 א).
    1. לנתח את המוטיבציה של החולדות לקבל גמול מזון על ידי השוואת מזון כוס התנהגות במהלך הלידה של גמול מזון (5 עידן שניות) על פני 5 מפגשי התנהגות תוך שימוש באותו החישוב כמפורט לעידן אור 5 שניות לעיל. ערכים אלה יהיו גבוהים יותר באופן עקבי מאלו שנרכשו במהלך המצגת של הגירוי החזותי (ראה איור 3).
  3. לפגישת המבחן: לחשב יחס אפליה המתאר את חולדות כוס מזון התנהגות בתגובה לפרהentations של כל גירוי שמיעתי.
    1. באופן ספציפי, לכל חולדה, לחלק את המשך הזמן הממוצע בכוס המזון הבא כל אחד מ6 מצגות של הגירוי המותנה מראש החושי (כלומר, את הטון) בסכום של המשך הזמן הממוצע בכוס המזון הבא כל אחד ממצגות של 6 גירוי חושי preconditioned (כלומר, גירוי הטון) בתוספת הממוצעת של סך כל הזמן בילה בכוס המזון הבא כל אחד מ6 מצגות של הגירוי מזווג (כלומר, גירוי הרעש הלבן). כל עידן הוא 10 שניות בזמן.
      הערה: ציון אפליה של 0.5 או יותר מוכיח כי חולדות למדו עמותות הגלומות בפרדיגמה נפשית מראש החושית.

7. אימות של AAV מיקום וביטוי

  1. הרדימי וperfuse חולדות transcardially באמצעות paraformaldehyde 4%. בשל השימוש בתוויות ניאון, לא יעלה על זמן שלאחר קיבוע-של 2 שעות לקבוע מינימוםאובדן imize של antigenicity ולשמר את אות הניאון.
  2. מייבש את מוח perfused ידי העברתם לצנצנת מוח המכילה 30 מיליליטר של תמיסת סוכרוז 20% בופר פוספט (1x) למינימום של 2 ימים או עד שהמוח שוקע לתחתית צנצנת המוח.
  3. השתמש microtome הזזה הקפאה כדי להפוך את החלקים במוח העטרה (20-40 מיקרומטר) בכל מידת rostrocaudal השלם של האזור של עניין.
  4. לנהל אימונוהיסטוכימיה המכוונת נגד קולט מתויג או חלבון הכתב כדי לברר את המיקום וביטוי של הקולטן המעצב ו / או כתב 12. פרוטוקול מכתים אימונוהיסטוכימיה מסופק על דף משאבי ויקי DREADD 25.
  5. הר הסעיפים על גבי שקופיות SuperFrost פלוס וcoverslip באמצעות 100-200 μl של מדיום גובר מימי.
  6. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על רקמת מוח כדי לוודא מיקום AAV וחלבון ביטוי 12,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות התנהגות

עם השלמת הניסוי, את האפקטיביות של איון הזמני ספציפי לאזור יש להעריך כמותית ואיכותית. הדוגמא הנוכחית כרוכה הפרדיגמה 3-שלב התנהגות (נפשית מראש חושי), שבו היה מנוהל CNO כדי להחליש פעילות עצבית בRSC במהלך פגישות אכשור קד לבחון את ההשערה שRSC הכרחי להיווצרות של עמותות בין גירויים ניטראליים 12. חשוב לציין, הנסיינים אינם מוגבלים לפרדיגמה ההתנהגות או עיצוב ניסיון המתואר במסמך זה כגישת pharmacogenetic יכולה להיות בשילוב עם רוב פרדיגמות התנהגות.

ואילו ניתוחים לא מבוצעים בדרך כלל על הנתונים שנוצרו במהלך פגישות אכשור קד (שלב 1), חשוב לכמת אם חולדות למדו עמותת מזון הקלה במהלך פגישות אוויר (שלב 2). כפי שניתן לראות באינטרנט אלחוטיחולדות 3A דמות, שני ניסויים (Expt) ובקרה (Ctrl) להפגין הגדלת מזון כוס התנהגות במהלך מצגות של גירוי האור (איור 3 א) מצביעים על כך שחולדות רכשו עמותה הפבלובית בין הגירוי החזותי (אור) ואת הפרס מזון. בנוסף, שתי הקבוצות להפגין הגדלת מזון כוס התנהגות במהלך המצגת של גמול המזון (איור 3) מצביע על מוטיבציה שווה ערך לקבלת הפרס. במהלך פגישת המבחן הקריטית, כאשר הגירויים השמיעתיים מוצגים בהיעדר גירויים אחרים, יש חולדות שליטת ציון אפליה שהוא שונה באופן משמעותי מחולדות ניסוי (איור 3 ג). בדיקה ויזואלית של הגרף מגלה כי יחס האפליה הממוצע של חולדות שליטה גדולה יותר מ -0.5, מעיד יותר כוס מזון התנהגות בתגובה למצגות של הגירוי השמיעתי שזיווג עם האור (באכשור קד) בהשוואה לכוס את האוכל שלהםהתנהגות בתגובה למצגות של הגירוי השמיעתי שמזווג (במהלך אכשור קד). לעומת זאת, חולדות ניסוי ייכשלו להפגין ציון הבדל שהוא מעל הסיכוי. לפיכך, איור 3 ג מוכיח כי חולדות ניסוי שליטה אבל לא הראו את ההשפעה נפשית מראש החושית.

אימות של מיקום AAV

בסיום בדיקות התנהגותיות, לנתח רקמת מוח חולדה עבור מיקום וביטוי של הקולטן המעצב נכונים. אימונוהיסטוכימיה התנהלות 12,25 באמצעות נוגדנים עיקריים המכוונים נגד תג קולט (למשל, נוגדן ראשוני אנטי-HA) או כתב הניאון (בדוגמא זו, mcitrine שהוא זוהה על ידי נוגדן לחלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP)). סכמטי של סעיף עטרה דרך מוח העכברוש מוצג באיור 4 א. איור 4 ממחישים immunodetection ניאון חזק של prot הכתב. עין בRSC בחולדה ניסיונית נציג ללא תווית ניאון זוהתה באזורים המקיפים את דמויות 4C - D להמחיש תיוג ניאון נציג של חלבוני כתב בניסוי (Expt; חולדות חדורי מבנה AAV המכיל את גן קולט המעצב וגן mcitrine ) ושליטה (Ctrl; חולדות חדורי מבנה AAV דומה המכיל את גן GFP אבל אין רצף לקולט המעצב) חולדות, בהתאמה. ניתן להציג גם רמות קולט כמינימום, נציג וביטוי מקסימאלי 24. אם תיוג מזוהה באזורים מחוץ לאזור של עניין, שלא לכלול אותם נתונים מניתוחי ההתנהגות.

איור 1
איור 1:. תרשים סכמטי של מבנה AAV תרשים של hSyn-HA-hM4D (GI) -IRES-mCitrine AAV משמש לexpress קולט המעצב המעכב (hM4Di) תחת אמרגן עצבי ספציפי synapsin (hSyn) בנוירונים RSC. כתבי Immunofluorescent (ר 'תג ו / או mcitrine) יכולים לשמש כדי לחזות ביטוי של החלבון והכתב, בהתאמה. hSyn, אמרגן synapsin אנושי; מציין ביטוי בתאי עצב. HA, תג hemagluttinin; תג זה התמזגו לקולט המעצב ומשמש כתג epitope מאפשר זיהוי של ביטוי הקולטן. hM4Di, הגן לרצפטור בשילוב מעכב מעצב G-החלבון. IRES, אתר כניסת הריבוזום פנימי; מאפשר הכתב (mcitrine) להיות מתורגם. mcitrine, כתב ניאון שהינו נגזר של ה- GFP, אבל הוא עמיד יותר בפני photobleaching.

איור 2
איור 2: תרשים סכמטי של הפרדיגמה נפשית מראש החושית () במהלך sess אכשור קד.יונים, 12 ניסויים התערבבו מוצגים. במהלך 6 של הניסויים, גירוי שמיעתי מוצג במשך 10 שניות ומייד אחרי גירוי אור מהבהב הבית (2 הרץ, במשך 5 שניות). במהלך אחרים 6 הניסויים, גירוי שמיעתי שני מוצג ללא גירוי חזותי. (ב) במהלך פגישות אוויר, הגירוי החזותי לזווג בעבר הוא זיווג עם גמול מזון. (ג) במהלך פגישת המבחן, יש 12 מצגות מעורבבות של שני גירויים שמיעתיים בהיעדר גירויים או מזון חזותיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. תוצאות התנהגות כוס ממוצעת מזון להגיב במהלך () אור ועידנים (ב) מזון duלצלצל במפגשי אוויר (שלב 2). הנתונים נותחו באמצעות מדידות חוזרות ניתוח שונות. יחסי אפליה (ג) במהלך פגישת המבחן (שלב 3). הקו המקווקו מציין כמויות שווה של כוס מזון מותנה להגיב לכל גירוי שמיעתי (כלומר, לא נפשית מראש חושי) הנתונים נותחו באמצעות דגימות עצמאיות מבחן t. Expt; חולדות ניסוי (n = 17) חדורי מבנה AAV מכיל את רצף ה- DNA לקולטן G- החלבון המעכב מעצב בשילוב (hM4Di) ורצף ה- DNA לכתב ניאון (mcitrine). Ctrl; חולדות ביקורת (n = 6) חדורים hM4Di ושילוב רכב מנוהל עם חולדות ביקורת (n = 4) חדורי וירוס AAV שאינו מכיל את הקולטן המעצב ושמנוהלים CNO. קבוצות שליטה לא היו שונות באופן משמעותי מזו (p> 0.05). ברים שגיאה לציין ± SEM.

איור 4 איור 4: אימות היסטולוגית של ביטוי חלבון () סכמטי הממחיש את מיקומו של RSC בסעיף עטרה דרך מוח החולדה.. (ב) נציג תמונות של רקמת מוח חולדה שכותרת immunohistochemically מעכברוש ניסיוני (Expt) שזרם עם מבנה AAV מכיל את רצף ה- DNA לקולט המעצב יחד G-חלבון המעכב (hM4Di) ורצף ה- DNA לכתב ניאון ( mcitrine). mcitrine היא גרסה מאוד עמידה בפני דהייה של חלבון פלואורסצנטי ירוק. תמונת נציג מעכברוש ניסיוני הממחיש את המיקום של תווית ניאון הכתב (mcitrine) (ג). תמונת נציג מעכברוש שליטה (Ctrl) חדורי מבנה AAV מכיל את רצף ה- DNA לכתב ניאון (ד) (משופר GFP). ברים סולם: B, 500 מיקרומטר; C ו- D, 10081;. מ 'אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם גישת pharmacogenetic (DREADD) כדי לחקור כיצד אזור ספציפי במוח תורם למשימה למידה מורכבת רב-שלב. עם היכולת באופן זמני ומרחוק כדי להשתיק את הפעילות עצבית באזורי המוח הבדידים פני שלבים של למידה, זה שילוב של גישות מספק פלטפורמה לחקור מגוון רחב של התנהגויות, כוללים צורות יותר מורכב או רעולי פנים של למידה. בדוגמא שתוארה בפרוטוקול זה, לשלוט חולדות ועכברים המבטאים את הקולטן המעצב בקליפת retrosplenial (RSC) נבדקו במשימה התנהגותיות 3-שלב 12. השלב הראשון של המשימה מעורבת הצגת גירויים ניטראליים מרובים עם ההנחה כי חולדות לשלוט ירכוש עמותת גירוי-גירוי בין שני הגירויים. נחת העבודה היא שRSC הכרחי ללמידת גירוי-גירוי, וכך, בכל אחד מימי 4 אוויר, 30 דקות לפני תחילת מבחן התנהגותING, שליטה וחולדות ניסוי ניתנו ממשל מערכתי של את תרופת המעצב (CNO) או רכב. כאשר חייב קולט המעצב, CNO מפחית את הפעילות של תאי עצב שבקולט שבא לידי ביטוי. במהלך השלבים הנותרים של אוויר התנהגותיות ובדיקות, כאשר RSC לא שיערו להשפיע למידה, CNO לא מנוהל ובכך הפעילות עצבית לא תפריע לו.

שלבים קריטיים בפרוטוקול

טיפול בטוח של תרכובות AAV: הניתוחים מעורבים בגישת pharmacogenetic הם לא יותר תובעניים מבחינה טכנית מאשר עירוי stereotaxic פשוט, לעומת זאת, השימוש בAAV בכמה מוסדות דורש שהנסיינים לדבוק-2 מנהלת הליגה אמצעי זהירות. זה קריטי, כי חוקרים פעלו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המרכז לבקרת מחלות, סוכנויות מימון, מוסדות בית ווועדות פיקוח אחרים ספציפיות לתכנית המחקר שלהם. מידע על הטיפול בטוח דואר של AAVs נגיש בקלות 13.

הכנה וניהול של תרופת המעצב: CNO, סם פיצוציות, נקשר לקולטן המעצב ומשתיקות פעילות עצבית אך היא אחרת אינרטי מבחינה ביולוגית 1,3. משלוחים של CNO מהספקים יכולים להשתנות בעקביות. המתחם אמור להגיע כאבקה שאינו דבקה בצדדים של המכל.

קבוצות שליטה חשובות לשקול: כדי לשלוט על השפעות הלא ספציפיות של סם הפיצוציות, לפני בדיקות התנהגותיות, להחדיר קבוצה של חולדות ניסויים שונות (כלומר, אלה שמבטאים את הקולטן המעצב) עם זריקות רכב במקום CNO. בנוסף, כדי לשלוט על השפעות הלא ספציפיות של קולט המעצב כולל קבוצה של חולדות שהם חדורים בוירוס שליטה המכיל כתב ניאון אבל לא קולט המעצב שונה ולהזריק חולדות אלה עם הסמים המעצב (כלומר, CNO) . Ensuמחדש עיצוב ניסיון נאות על ידי לאזן בין קבוצות.

אימות ביטוי למבנה: יש מספר דרכים למקסם את הביטוי והגילוי של הקולטן המעצב. לפני העירוי, לוודא שtitre ויראלי הוא ליד 10 12 מיליליטר / חלקיקים. לעתים קרובות הדמיה של כתב הניאון היא נמוכה ולכן, מומלצת שאימונוהיסטוכימיה להתבצע על האזור של עניין באמצעות נוגדנים מכוונים נגד הכתב (ים) כלול במבנה הנגיפי 25. בדוגמא זו, immunoreactivity אנטי-GFP מספק אות חזקה (איורים 4 ב - ד). חשוב לציין, בגלל האופי של תוויות ניאון, להגביל את משך זמן קיבעון לשעה 2.

יתרונות של הטכניקות

ברגע שהמבנה הנגיפי נמסר למוח באמצעות ניתוח stereotaxic, גישת pharmacogenetic מאפשרת לinacti הזמניvation של פעילות המוח באזורים נפרדים באמצעות הזרקה מערכתית פולשנית של סם הפיצוציות. מתן תרופה יכול להתרחש שוב ושוב, וזה יתרון עבור משימות התנהגותיות המתרחשות על פני ימים או שבועות 12,24,26 רצופים. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שתרופת המעצב (CNO) לא מפריעה התנהגות של תנועה או תיאבון 27,28. לכן, השיטה מספקת את ההזדמנות כדי להחליש פעילות עצבית לתקופה קצרה של זמן (2-5 שעות), תוך הימנעות גורמי הלחץ טמון בשיטות אחרות של איון זמני. באופן ספציפי, במחקרי cannulation, איון זמני מושגת על ידי משלוח של עצבי באמצעות cannulae שאופן קבוע מודבקים לגולגולת. גישה זו היא מוגבלת שבשמירה על הצינורית ברורה של פסולת ומוגנת היא מאתגרת. יתר על כן, כדי לגרום לחוסר פעילות, חיות מטופלות בהרחבה (לנהל את רעלן באמצעות cannulae) רק לפני בדיקות התנהגותיות, WHIפרק מטיל לחץ על בעלי החיים וגם מגדיל את הסבירות שcannulae יכול לעקור מהגולגולת. בגלל ההשפעות של CNO הן קצר יחסית טווח, את האפשרות של מנגנוני פיצוי לטווח ארוך (כגון אלו שנצפו בעקבות נגעים קבועים או בעכברים מהונדסים גנטי) הן מזערית 29,30.

מגבלות של הטכניקות

DREADD היא שיטה חדשה יחסית של הלא פולשני מרכך פעילות עצבית. כהנסיינים כזה יכול להיות נוטה לאמת באופן עצמאי שההשתקה עצבית מתרחשת בהכנתם. אימות יכולה להתבצע באמצעות גישות אלקטרו, אבל הניסויים הללו הם זמן רב, יקרים ודורשים מומחיות ספציפית. בנוסף, בעוד שטכניקות chemogenetic הן פחות יקרות מאשר optogenetics, הגישה היא יקרה יותר מאשר איון מסורתי עם סוכנים תרופתיים כגון TTX. מגבלה נוספת של גישת DREADD היא infus שיון של בונה ויראלי לא לגרום לזיהום 100% מתאי העצב באזור של עניין, ולא עושה איון באמצעות CNO להוביל להפחתה של 100% של פעילות עצבית. לבסוף, כמה קפסיד AAV יכול להיות מועבר retrogradely שיכול לסבך את הפרשנות של תוצאות ניסויים 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים לחברים של רובינסון ואח '. 12 על תרומתם לכתב היד שממנו הפרוטוקול זה נגזר באופן חלקי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Male, Long Evans Rats, 55-60 days old Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution: This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-oxide R&D Systems 4936-10 Designer drug
Rat Cage lid (polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion
Filter paper (replacement) Alternative Design FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table top vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Biohazard trash bags Staples 113444 Medline biohazard liners
Biohazard trash can Amazon.com United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle
Isoflurane, 100 ml Patterson Veterinary Supply Inc. 07-890-8540 Anesthetic
Dual small animal stereotaxic with digital display readout console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia mask (rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated syringe pump with micro4 controller David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine skin cleanser Perdue Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple antiobiotic ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube vet ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite rigid table-top boom stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 G 10 μl syringe Hamilton 80308-701SN Surgical equipment
Extra tall MDF sound attenuating cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22' W x 22" H x 16" D
Extra tall modular test chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless steel grid floor Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular pellet dispenser Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet receptacle, cup type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head entry detector for rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage speaker for rat chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable audio generator Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart ctrl 8 input/16 output package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large table-top cabinet and power supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI interface package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard: carcinogen, weigh in hood
Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies 3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies 2956S Histology reagent
Anti-rabbit IgG Cell Signaling Technologies 4412S Histology supplies
Superfrost plus slides VWR international 483111-703 Histology supplies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Tags

התנהגות גיליון 100 Pharmacogenetics התנהגות מדעי מוח איון עצבי זמני נפשית מראש חושי מכרסמים קליפה וירוס adeno הקשורים DREADDs למידה ניתוח stereotaxic
שיטה להשתקה מרחוק עצבית פעילות במכרסמים בשלבים בדידים של למידה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robinson, S., Adelman, J. S. AMore

Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter