Abstract
このプロトコルは、動物は、学習および記憶の作業に従事している間、一時的にリモート離散の脳領域での神経活動を沈黙させる方法について説明します。アプローチは、学習の異なる形態を区別するように設計されている行動パラダイム（感覚プリコンディショニング）と（デザイナー·受容体 - 排他的活性化·バイ·デザイナードラッグ）薬理遺伝学を組み合わせたものです。具体的には、ウイルス媒介送達は、齧歯類において脳の離散領域内に遺伝的に改変された抑制性Gタンパク質共役受容体（デザイナレセプター）を発現するために使用されます。デザイナーの受容体の発現レベルが高い場合3週間後、薬剤（デザイナー薬物）は、特定の行動の前のセッションに全身30分に投与されます。薬剤は、設計受容体に対する親和性を有し、したがって、設計者受容体を発現するニューロンの阻害をもたらすが、それ以外の生物学的に不活性です。脳の領域はdepen（2-5時間に沈黙のまま鼎）用量および投与経路に。行動パラダイムが完了すると、脳組織が正しい配置と受容体の発現のために評価されます。このアプローチは、動作の特定のコンポーネントに個々の脳領域の寄与を決定するために特に有用であり、行動パラダイムの任意の数の間で使用することができます。
Introduction
行動神経科学の分野内の刺激的な課題は、複雑な行動の神経基盤を決定することです。このような永久的な病変、カニューレインプラントを介して、一時的な脳の不活性化および光遺伝学などの多くの技術は、複雑な動作のサブコンポーネントに個別の脳領域の寄与を識別するために使用されてきました。これらのアプローチは、学習中に地域特異性の我々の理解を通知するが、各手法には限界がないわけではありません。具体的には、永久的な病変は、典型的には、ので、それらの影響は、パラダイムの期間全体に存在している、行動試験の前に実施されます。短期神経不活性化（ 例えば、テトロドトキシン）の提示を伴う挿管の研究は、脳組織に重大な障害を生成することができますし、直前の行動試験に被験者にストレスを誘導することができます。また、挿管を介して不活性化は、周囲の組織の領域に限定されていますカニューレの先端。光遺伝学は、特定の脳領域における活動の時間的制御のための柔軟性の範囲を提供しています最後に、それはコスト法外と技術的に厳しいです。
これらの制限は、薬理遺伝学的ア プローチ（デザイナ-受容体-排他的活性化·バイ·デザイナードラッグ、DREADDs）1,2を使用して克服することができます。薬理遺伝学の概念は洗練されながら重要なこと、技術の実行は簡単です。個別の脳領域への毒素の注入（ 例えば、NMDA、イボテン酸）を含む従来の定位外科的方法と同様に、この手法は、修正阻害Gタンパク質共役受容体のためのDNA断片を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）を注入することを含みます（hM4Di;デザイナー受容体）の標準的な実験用げっ歯類の関心領域には（ 図1参照します）。ウイルスベクターはまた、蛍光レポーター（mcitrine）が含まれています。に組み込まれたら細胞に、デザイナーの受容体（およびレポータータンパク質）は、最大で2〜3週間後に注入を発現し、選択的に他の方法で生物学的に不活性なデザイナーの薬剤の全身投与、クロザピン-N-オキシドにより2-5時間のために活性化することができます（CNO）1 、3。実験者は、特定の脳領域における神経活動を正確に、しかも遠隔時間的制御に恵まれているので、薬理遺伝学は、複数のフェーズで実施されている行動パラダイムで特によく兼ね備えています。この例では、retrosplenial皮質（RSC）の寄与がする刺激 - 刺激学習がパブロフ学習におけるその役割と比較され、アプローチのしかし、この組み合わせはに貢献どのように特定の脳の領域を識別しようとするのいずれかの質問の数に適しています複雑な挙動。
本プロトコールに記載されていないがまた、ウイルスおよびトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的DREADD式2を達成することができます。私のようにDREADDアプローチを採用した場合、薬理学的および/または実験操作の他のタイプを伴う行動パラダイムに内在するのは、実験計画とその後の定量分析を慎重に検討が必要です。 DREADDアプローチの新しい実験者は、現在のDREADD技術2の包括的見直しと呼ばれています。
毎日、生物は新たな刺激やイベントと相互にそれらの関係について学びます。でも使い慣れた環境では、そのような家庭のように、1は、これらの変更は、意味のあるイベントを予測することができるので、刺激間の関係の変化を検出するために迅速です。このような刺激-刺激（ すなわち、関係）学習は、複数の刺激の対等接続を必要とし、伝統的な内側頭葉4内の中央に置かれ、海馬、と関連しています。しかし、海馬が存在したり、単独では動作しません。内と外の両方の皮質領域内側側頭葉の側は海馬5-7に重要な感覚情報を提供しています。伝統的な永久的な損傷の研究は、海馬依存性学習における皮質領域（ 例えば、retrosplenial、postrhinalおよび嗅内皮質）の数の関与のための説得力のある証拠を提供するが、離散段階で特定の領域の役割を認識する能力が制限されています8-10を学びます。
本プロトコルは、RSCは、3相の感覚プレコンディショニングのパラダイム11,12の単相中にRSCをサイレンシングすることによって刺激刺激学習のために必要であるという仮説をテストします。簡単に言うと、ラットは、デザイナーの受容体を含有し、2〜3週間後に行動試験の開始前にデザイナーの薬（CNO）30分を投与されたAAVの注入を受けます。本プロトコルでは、実験的なラットは、テストの第一段階（刺激 - 刺激リア中CNOを受け取りますNingが発生する）、彼らはテストの次の2段階の間に車両を受けます。行動上のCNOの不注意の影響を制御するには、デザイナーの受容体（hM4Di）のラットを注入し、代わりにCNOの車両に注入します。ウイルス注入および受容体の発現の全体的な影響を考慮するために、デザイナーの受容体を含有し、CNOを投与しない対照ウイルスを注入。
AAVの種々の血清型の数は、遺伝物質を送達するために使用されます。組換えまたは合成分子が関与する研究のための現在のNIHガイドラインは、導入遺伝子が潜在的に腫瘍形成遺伝子産物または毒素分子のいずれかをコードしないとの非存在下で産生される、AAV（すべての血清型）および組換えまたは合成AAV構築物と主張しますヘルパーウイルスは、BSL-1注意事項（付録B-1。リスクグループ1（RG1）エージェント）13が必要です。 AAV構造、ユーティリティおよび安全性に関連するレビューの数は14,15利用できます。注目すべきは、しかしAAVで作業する場合、げっ歯類では可能な生殖16,17および潜在的な発がん性のメカニズム18-20に関連する問題のために、いくつかの機関は、BSL-2の予防策を使用する必要があります。米国では遺伝子操作のためのウイルスベクターを使用する場合に研究のための疾病管理センターおよびNIHガイドラインは組換えDNA分子13を伴う、研究を実施する個々の機関の監督委員会との協議により、使用前に適切なBSLを確認してください。個人用保護具、研究者の訓練、ベクトル封じ込め、除染、除染材料の廃棄、および注射後の動物収容要件は、これらのガイドラインで指定されています。また、相談して、適切な動物実験に続き、安全な取り扱い、管理、およびAAVの処分を確保するために、委員会のガイドラインまたは同等の機関監督委員会のガイドラインを使用してください。
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Protocol
動物の使用は、オベリン大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、ケアと実験動物の使用のためのガイド21に従っているされています。
ウイルス注入のための1.準備
注：このプロトコルは、BSL-1の予防策を使用しています。 BSL-2の予防措置を採用する場合、使い捨て白衣、手袋、靴カバー、目の保護と、微粒子レスピレーター（タイプN95）が必要です。 BSL-2の化合物を取り扱うすべての個人は、地元の公衆衛生当局により粒子状レスピレーターについて試験フィットする必要があります。ウイルスベクターの取り扱いおよび保存の詳細についてはローリー＆Majewska（2010）22を参照してください。
- 最初の使用時には、一定量と凍結融解の繰り返しを避けるために、20μlのマイクロ遠心チューブに使用されていないウイルスを保存します。
- 不要なオブジェクトを削除し、70％エタノールで表面を殺菌することにより、作業面を準備します。 1を準備AAVの廃棄物を除染するための0％漂白剤溶液。漂白剤溶液とワーク表面に滅菌10μlの注射器の完全なビーカーを置きます。セットアップ中に砕いた氷の入った容器内のAAVでマイクロチューブを置きます。
- 標準ベンチバイスにウイルスをマイクロ遠心チューブを置きます。 AAVの少なくとも4μlの10μlの注射器をロードします。ローディング中にマイクロチューブの底に対する注射器の先端を曲げないように注意してください。シリンジ内のAAV液4μlの中に気泡がないことを確認してください。
- 10％の漂白剤の入ったビーカーに、空のウイルス管廃棄してください。供給者によって指定されるように、ウイルスの未使用部分を格納します。
- 廃棄物容器にさらに10％の漂白剤を追加し、廃棄物の除染廃液を処分する前に30分間座ってすることができます。
- 施設の指針の指示に従ってバイオハザードコンテナ内のすべての保護具とプラスチック廃棄物を処分します。アールデコ10％の漂白剤を使用して、ウイルスに接触してきた任意の機器や表面をntaminate。
2.手術
- 定位固定装置の下に、専用のウイルス取扱い場所として指定され、隣接する空間に吸収性のベンチ紙を置くことによって、手術領域を準備します。
- 外科手術装置の近くに専用のウイルス処理領域に10％漂白剤廃棄用容器を置きます。
- 麻酔の安定したレベルを誘導し、手術のためにラットを準備します。
- 意識と総意図的運動の欠如の損失があるまで、イソフルランガス（1〜3％の範囲）と酸素（100％で約1リットル/分）の混合物を含有する誘導室にラットを置きます。外科的処置を通してイソフルラン麻酔を維持します。
- 6深い麻酔が達成された後、少し耳の後ろに目の間から、ラットを剃ります。
- 用の誘導室に戻したラットを置きます追加の1-3分。
- イソフルラン麻酔システムは、定位手術のノーズコーンに接続されていることを確認してください。 stereotaxにイソフルランの流れを開始するためにイソフルランチューブのコックを開きます。上記で指定したレベルでのイソフルランと酸素を維持します。
- 一口バーの上に口を確保し、耳のバーを固定することによって定位固定装置にラットを置きます。
- 前切開手術部位への目とベタジンに目の潤滑剤を塗布します。
- 目に尾約2mmを開始頭蓋骨の背側表面にスキン2.4センチ正中切開を行います。頭蓋骨を露出させるために皮膚を撤回。定期的に乾燥から組織を防止するために、手術部位の縁に滅菌0.9％滅菌生理食塩水を植え付けます。
- ブレグマとラムダまで頭蓋骨から明らかな膜状の組織がはっきりと見えます。
- 頭蓋骨に背腹座標を測定することにより、レベルであることを確認してくださいブレグマとラムダで。ブレグマとラムダで背腹座標がない以上0.04ミリメートルによって異なりまで応じて定位装置を調整します。
- このとき、2〜2.5％のイソフルランガスを削減します。
- 座標リゼロ、ブレグマにドリルを返しますし、目的の内側 - 外側にドリルを移動し、前後座標。
- それは28のG注入シリンジに適したサイズの穴を生成するように0.9ミリメートルのドリルビットを使用して座標で穴を開けます。
- 0.2μL/分の速度でウイルスを配信するために注入ポンプを設定します。定位装置の注入腕に注射器を置き、目的の座標にシリンジを下げます。ウイルスの所望量（0.8μLの範囲0.1）を提供します。例えば、4分かけてAAVの0.8μLを提供します。
注：理想的な注入量と関心の各領域におけるウイルスの典型的な広がりを決定するために、パイロット研究を行っています。- ウイルスの送達は共同したら針管内に逆流を防止するために、10分間の場所に注射器を残しmplete。ゆっくりと約5mm /分の速度で注射器を上げます。すべての座標は、AAVを注入されるまで繰り返します。
- 外科用ステープルとコート局所抗生物質軟膏で傷を使用して傷を閉じます。
- 術後疼痛管理のための機関のガイドラインに従ってください。
- 寝具、蓋と適切なsignageのあるケージにラットを置き、動物施設にラットを返します。
- BSL-2の予防措置の下で働いた場合は、施設のガイドラインで指定された時間（通常は48〜72時間）のためにベッドを収集します。バイオハザード廃棄物容器の中にベッドを配置します。
- 彼らの安全に処分するためのガイドラインで指定されたすべてのAAV-汚染物質廃棄してください。
3.行動装置
注：感覚前処理装置は、標準的なオペラント条件付けチャムで構成されていBERステンレス鋼格子床を有する（12 "の長さx 9.5"幅x 11.5 "H）、2プレキシガラス側壁と2金属壁。
- 2 Hzで点滅するとき、家の光のように視覚刺激として機能するアルミ壁の1つに2.8 Wの光をマウントします。聴覚刺激（10秒、1500 Hzで、78デシベル純音と10秒78デシベルホワイトノイズ）を提供するために、チャンバにスピーカーをマウントします。
- 食品カップに45mgの食物ペレットを提供するために食品のホッパーを使用してください。食品カップ内では、赤外光電セルは、刺激のプレゼンテーションや食品の報酬の間と後に、前の食品カップに費やされた合計時間を検出します。
- 音響減衰キャビネットの家は、チャンバ排気ファン（〜68デシベル）を装備（22 "W×22" H×16 "D）。
- オペラントチャンバーを制御し、データを取得するメッドアソシエイツのソフトウェアを搭載したPCのコンピュータを使用してください。コンディショニングセッション中、presenta中の食物カップにヘッドと過ごした合計時間に関するデータを収集光刺激（5秒エポック）の化と食品の報酬（5秒エポック）のプレゼンテーション中。テストセッション中に、聴覚刺激（聴覚刺激が終了した時点から10秒エポック）の発表に応じて、食品カップに費やされた合計時間のデータを収集。
感覚前処理パラダイムの4概要
- 手術から回復した後、徐々に食品は自由摂食体重の85％のラットを制限します。適切な食事制限パラダイムのための獣医のスタッフにご相談ください。
注：3相の感覚前処理パラダイムは、 図2に示されています。 - 前処理セッション（フェーズ1、4日連続渡って行っ毎日64分間のトレーニングセッション）：
- 聴覚と視覚刺激の送達から成り12混在試験で存在ラット。平均4.5分（範囲4.0から5.0分）、各Aの後のことを試行間間隔を含みますuditoryプレゼンテーション。
- 試験の6で、10秒間のトーン（前の刺激）を提示、点滅光刺激の5秒プレゼンテーションの直後。
- 他の6件の試験では、10秒間だけでは白色雑音（不対刺激）を提示。
- コンディショニングセッション（フェーズ2、5日連続渡って行っ毎日64分間のトレーニングセッション）：
- 5秒間視覚刺激（点滅光刺激）の配信で構成さ8件の試験で、本ラットは2 45mgの食品ペレットの送達によって、その直後。各試験の後に7分（範囲6.0から8.0分）を平均試行間の間隔が含まれます。時折ラットは、光食品関連を学ぶために5つ以上のコンディショニングセッションを必要とします。
- テストセッション（フェーズ3;単一の78分セッション）：
- 単独で聴覚刺激の送達から成り12混在試験でラットを提示します。 aveの試行間間隔を含みます各聴覚発表後の怒り4.5分（範囲4.0から5.0分）。
- 試験の6で、10秒間だけで音刺激（前刺激）を提示。
- 他の6件の試験では、10秒間だけでは白色雑音（不対刺激）を提示。
- 不対刺激としてプレコンディショニング刺激とトーンとしてホワイトノイズを受けたラットの第二のセットでの研究を完了することによって刺激を相殺します。
5.薬理学的および行動手順
- 行動装置の電源をオンにして、適切な行動のセッションのためにMED-PCコードをロードします。ワイヤとプログラム行動装置音響減衰キャビネットに搭載されているファンは、電源がオンになっているときにオンするように。
- クロザピンN-オキシド（CNO）の1 mg / mlの溶液を調製し、15ミリリットルコニカルチューブにCNO 5.0mgの重量を量るし、滅菌0.9％のSalIの5滅菌水のmlまたは5ミリリットルを追加しますNE。ソリューションまで渦は明らかです。
- CNOは、溶液中に溶解しない場合、またはCNOのより濃縮された溶液は、DMSO 23として、可溶化剤を加える必要な場合。具体的には、CNOの5.0 mgの秤量し、15ミリリットルコニカルチューブにDMSOの25μlを添加、0.5％DMSOでCNOの1 mg / mlの溶液を調製しました。内容は、チューブの底に残っていることを確実に静かにフリック。溶液が透明になった場合には、滅菌水5 mlまたは0.9％滅菌生理食塩水を5ml追加します。 CNOの溶液を調製するための詳細な手順は、DREADDウィキリソースページ25で利用可能です。
- それが投与され、毎日新しいCNO溶液を調製します。
- 1ミリグラムの用量で腹腔内にCNOを注入は、/約30分前行動試験にキロ。例えば、1mg / mlのCNOの溶液0.2mlで200gのラットに注入します。 CNO投与の用量および時間経過は、以前に公表された報告2,12に基づいて選択しました。
- （フェーズ1;注射の4日間の合計）は、各事前調整のセッションの前にCNO 30分を注入するが、後続のすべての行動のセッションの前に車を管理します。
- 30分後、行動試験室にラットを配置し、適切な行動のセッションのためのコンピュータコードを開始します。
- 行動タスクが完了すると、すぐに部屋からラットを削除し、動物コロニーにラットを返します。
行動データの分析6.
注：すべての行動のセッションの従属変数は、食品カップにおける赤外光電セルの中断によって検出されるように、ラットの頭が食物カップの内側にある時間です。 （秒での）データを収集し、コンピュータソフトウェアによって記録されます。
- 前処理段階の間に生成されたデータに解析行っていません。
- コンディショニングセッションの場合：各ラットのAを分析5行動セッションで視覚刺激の提示中の食物カップの挙動を比較することにより、光の食品関連を学ぶための性。具体的には、/セッション8件の試験（ すなわち、持続時間/ラットの各5秒である8回の平均値）のそれぞれについて、5秒の光エポック中の食物カップに費やされた平均時間を計算。平均対照と5毎日の各セッションのための実験値を（ 図3Aを参照）と比較します。
- 上記の5秒の光エポックのために指定されているのと同じ計算を使用して5行動セッション間で食品の報酬（5秒エポック）の配信中の食物カップの挙動を比較することにより、食品の報酬を得るために、ラットの動機を分析します。これらの値は、視覚刺激の提示の間に取得されたものよりも一貫して高くなります（ 図3B参照 ）。
- テストセッションの場合：PRESに応じて、ラットの食物カップの動作を示し判別率を算出各聴覚刺激のentations。
- 具体的には、各ラットについて、の6プレゼンテーションの各次の食品カップにかかった平均時間の合計によって感覚プレコンディショニング刺激（ すなわち、トーン）の6プレゼンテーションの各次の食品カップにかかった平均時間を分割感覚プレコンディショニング刺激（ すなわち、音刺激）と対になっていない刺激（ すなわち、白色雑音刺激）の6プレゼンテーションの各次の食品カップに費やされた合計時間の平均。各エポックは、持続時間が10秒です。
注：0.5またはそれ以上の識別スコアは、ラットは、感覚プレコンディショニングのパラダイムに固有の関連付けを学んだことを示しています。
- 具体的には、各ラットについて、の6プレゼンテーションの各次の食品カップにかかった平均時間の合計によって感覚プレコンディショニング刺激（ すなわち、トーン）の6プレゼンテーションの各次の食品カップにかかった平均時間を分割感覚プレコンディショニング刺激（ すなわち、音刺激）と対になっていない刺激（ すなわち、白色雑音刺激）の6プレゼンテーションの各次の食品カップに費やされた合計時間の平均。各エポックは、持続時間が10秒です。
AAVの配置や表現の7検証
- 4％パラホルムアルデヒドを使用して経ラットを麻酔し、灌流。これにより、蛍光標識の使用を、分の2時間の後の固定時間を越えません抗原性の損失をマイズし、蛍光シグナルを維持するために。
- 2日以上、または脳の脳のジャーの底に沈むまで、リン酸緩衝生理食塩水（1×）中の20％ショ糖溶液30mlを含む脳の瓶にそれらを転送することにより、脳灌流を脱水。
- 関心領域の全体rostrocaudal程度を通して冠状脳切片（20〜40μm）を作るために凍結滑走式ミクロトームを使用してください。
- デザイナー受容体および/ またはレポーター12の位置および発現を確認するためにタグ付けされた受容体またはレポータータンパク質に対して向けられた免疫組織化学を行っています。免疫組織化学染色プロトコルはDREADDウィキリソースページ25上に設けられています。
- 水性マウンティング培地の100〜200μLを使用してスーパーフロストプラススライドとカバーガラスの上にセクションをマウントします。
- AAVの配置およびタンパク質発現12,24を確認するために、脳組織の蛍光顕微鏡を実行します。
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Representative Results
行動結果
実験終了時には、地域固有の一時不活性化の有効性を定量的および定性的に評価されるべきです。本実施例では、3相の行動パラダイム（感覚プレコンディショニング）を含み、ここでは、CNO RSC中性刺激12間の結合の形成に必要であるという仮説を試験するためにプレコンディショニングセッション中RSCで神経活動を減衰させるために投与されました。重要なことに、実験者は、行動パラダイムまたは薬理遺伝学的アプローチは、ほとんどの行動パラダイムと結合することができるように、本明細書に記載の実験デザインに限定されるものではありません。
分析は、通常、前処理セッション（フェーズ1）の間に生成されたデータに対して実行されていないのに対し、それはラットはコンディショニングセッション（フェーズ2）の間の光食品関連を学んだかどうかを定量化することが重要です。 Fiの中で示されるようにグレの3A、実験（EXPT）とコントロール（Ctrlキー）の両方のラットは、ラットは、視覚刺激（光）と食品の報酬との間にパブロフの関連を取得したことを示す光刺激（ 図3A）のプレゼンテーション中に増加食品カップの動作を実証します。また、両方のグループは、報酬を得るために同等の意欲を示す食品の報酬（ 図3B）のプレゼンテーション中に増加食品カップの動作を実証します。聴覚刺激は、他の刺激の非存在下で提示されているときに重要なテストセッション中、コントロールラットは、実験ラット（ 図3C）とは有意に異なる識別スコアを有します。グラフの目視検査は、対照ラットの平均判別率は、それらの食物カップと比較し（前処理中）光と対になった聴覚刺激のプレゼンテーションに応答して、より大きな食物カップ挙動を示す、0.5以上であることが明らかになりました（プレコンディショニングの間に）不対であった聴覚刺激のプレゼンテーションに応じて行動。対照的に、実験ラットは偶然の上にある差スコアを実証することができません。したがって、 図3Cは、コントロールではなく、実験ラットは、感覚プレコンディショニング効果を示したことを示しています。
AAVの配置の検証
行動試験の完了時に、正しい配置とデザイナー受容体の発現のために、ラットの脳組織を分析します。受容体タグ（ 例えば、抗HA一次抗体）、または蛍光レポーター（緑色蛍光タンパク質（GFP）に対する抗体により検出され、この例では、mcitrine）に対する一次抗体を用いて免疫組織化学12,25を実施します 。ラットの脳を通る冠状断面の概略は、 図4Aに示されている。 図4（b）は、レポーターのprotの堅牢な蛍光免疫検出を示していますEIN RSCで周辺地域には検出されなかった蛍光標識を有する代表的な実験ラットにおける図4C - Dは、（実験でEXPTをレポータータンパク質の代表的な蛍光標識を説明する。ラットはデザイナーの受容体遺伝子とmcitrine遺伝子を含むAAV構築物を注入しました）とコントロール（Ctrlキー、ラットはそれぞれ、GFP遺伝子が、配列がないデザイナーの受容体に対する）のラットを含む同様のAAV構築物を注入しました。受容体レベルは、最小値、および最大の代表的な式24のように表示することができます。標識は、関心領域の外側の領域で検出された場合には、行動分析からこれらのデータを除外する。
図1：AAV構築物の模式図 HSYN-HA-hM4D（GI）の図は-IRES-mCitrine AAVは関数expに使用されます。RESS RSCニューロンにおける神経細胞の特定のシナプシンプロモーター（HSYN）の下で抑制デザイナー受容体（hM4Di）。免疫蛍光レポーター（HAタグおよび/またはmcitrine）は、それぞれ、タンパク質およびレポーターの発現を可視化するために使用することができます。 HSYN、人間シナプシンプロモーター;ニューロンで式を指定します。 HA、赤血球凝集素タグ。このタグは、設計者の受容体に融合し、受容体の発現を検出することができるエピトープタグとして機能します。 hM4Di、デザイナー抑制性Gタンパク質共役受容体の遺伝子。 IRES、内部リボソーム進入部位;記者（mcitrine）は、翻訳することができます。 mcitrine、GFPの変異体であるが、光退色に対してより耐性である蛍光レポーター。
図2：感覚プレコンディショニングのパラダイムの概略図（A）前処理、SESの間。イオンは、12混合試験が提示されます。 10秒が点滅家の光刺激（5秒間2ヘルツ）の直後のための試験の6時には、聴覚刺激が提示されています。他の6試験中に、第二の聴覚刺激が視覚刺激せずに提示されています。 （B）コンディショニングセッション中に、以前にペアリング視覚刺激は、食品の報酬とペアになっています。テストセッション中（C）、視覚刺激や食品の非存在下で2聴覚刺激の12混在発表がある。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3：（A）光と（B）食品エポックデュ中に応答行動の結果の平均食品カップコンディショニングセッション（フェーズ2）を鳴らします。データは、反復測定分散分析を用いて分析しました。 （C）テストセッション（フェーズ3）の間に差別比を。点線は、各聴覚刺激に応答馴化食物カップの等量（ すなわち、感覚前処理）データの独立したサンプルのt検定を用いて分析したことを示します。 EXPT;抑制性Gタンパク質共役受容体のデザイナー（hM4Di）と蛍光レポーター（mcitrine）のDNA配列のためのDNA配列を含むAAVコンストラクトを注入実験用ラット（N = 17）。 Ctrlキー;コントロールラット（N = 6）hM4Diを注入し、投与車両は対照ラットと組み合わせた（n = 4）デザイナーの受容体を含まないAAVウイルスを注入し、それがCNOを投与しました。対照群は、互いに有意（P> 0.05）と差がなかったです。エラーバーは±SEMを表します。
図4：タンパク質発現の組織学的検証（A）ラット脳を通る冠状断面でRSCの位置を模式的に示します。抑制性Gタンパク質共役受容体のデザイナー（hM4Di）と蛍光レポーターのDNA配列（のためのDNA配列を含むAAV構築物を注入した実験ラット（EXPT）の免疫組織化学的に標識されたラットの脳組織の（B）代表的な画像mcitrine）。 mcitrineは、緑色蛍光タンパク質の高フェード耐性変異体です。 （C）蛍光レポーター標識（mcitrine）の場所を示す実験ラットからの代表的な画像。 （D）コントロールラット（CTRL）からの代表的な画像は、蛍光レポーター（強化GFP）のためのDNA配列を含むAAVコンストラクトを注入します。スケールバー：B、500ミクロン; CおよびD、10081; M この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、特定の脳領域は、多相複雑な学習課題にどのように寄与するかを調べるために、薬理遺伝学的アプローチ（DREADD）を適用する方法について説明します。一時的と遠隔学習のフェーズに個別の脳領域における神経活動を沈黙させる能力により、アプローチのこの組み合わせは、学習のより微妙またはマスクされた形態を含む行動の広い範囲を調査するためのプラットフォームを提供します。この手順で説明した例では、retrosplenial皮質（RSC）でデザイナー受容体を発現する対照ラット及びラットを3相の行動タスク12で試験しました。タスクの第一段階は、刺激の2間の刺激 - 刺激の関連付けを買収するラットを制御仮定して、複数の中性刺激の提示を含んでいました。作業仮説は、RSCが30分前行動試験の開始まで4コンディショニング日、のそれぞれに、このように、刺激 - 刺激学習のために必要であるということですING、対照および実験ラットは、デザイナーの薬（CNO）またはビヒクルのいずれかの全身投与を与えられました。デザイナーの受容体に結合すると、CNO、その受容体が発現しているニューロンの活性を低下させます。 RSCが学習に影響を与えるために仮定されていない行動コンディショニングとテストの残りのフェーズでは、CNOは投与しなかったため、神経活動が阻害されませんでした。
プロトコル内の重要なステップ
AAVの化合物の安全な取り扱い：薬理遺伝学的アプローチに関与の外科的処置には、より技術的に厳しい単純な定位注入よりも、しかし、いくつかの機関でのAAVの使用は、実験者は、BSL-2の注意事項に準拠している必要がありません。それは研究者が疾病管理センター、資金提供機関、家庭機関とその研究プログラムに固有の他の監視委員会によって確立されたガイドラインに従うことが重要です。目に関する情報のAAVのE安全な取り扱いは、13容易に入手可能です。
デザイナーの薬の調製および投与：CNO、デザイナーの薬は、デザイナーの受容体に結合し、神経活動をサイレンシングが、1,3そうでなければ、生物学的に不活性です。取引先からのCNOの出荷は一貫して変化することができます。化合物は、容器の側面に付着していない粉末として届きます。
考慮すべき重要な対照群：代わりにCNOの車両注射で実験ラット（ すなわち、デザイナーの受容体を発現するもの）の異なるセットを注入、前行動試験のデザイナー薬剤の非特異的効果のために制御することができます。また、デザイナーの受容体の非特異的効果のために蛍光レポーターではなく、変更されたデザイナーの受容体を含むコントロールウイルスを注入されたラット群を含む制御し、デザイナーの薬物とこれらのラットを注入（ すなわち、CNO） 。 Ensuグループ間で相殺することにより、適切な実験デザインを再。
構築物の発現の確認：デザイナー受容体の発現および検出を最大化するために多くの方法があります。点滴の前に、ウイルス力価が10 12粒子/ ml付近であることを確認します。多くの場合、蛍光レポーターの可視化は低く、従って、それは、免疫組織化学は、レポーター（単数または複数）に対する抗体を用いて関心領域に対して行われることが推奨ウイルス構築物25に含まれています。この例では、抗GFP免疫反応性が強いシグナルを提供する（ 図4（b） - D）。重要なことに、なぜなら、蛍光標識の性質、2時間の固定時間の長さを制限します。
技術の利点
ウイルス構築物は、定位手術を介して脳に送達された後、薬理遺伝学的アプローチは、一時的なinactiを可能にしますデザイナーの薬の低侵襲性の全身注射による別個の領域における脳活動のvation。薬物投与は、連続した数日または数週間12,24,26全体に発生し、行動タスクのために有利で ある、繰り返し発生する可能性があります。また、証拠は、デザイナーの薬（CNO）が運動行動や食欲27,28と干渉しないことを示しています。一時的な不活性化の他の方法に固有のストレスを回避しつつ、この方法は、時間の短い期間（2~5時間）のために神経活動を減衰させる機会を提供します。具体的には、カニューレ研究において、一時的な不活性化は、恒久的に頭蓋骨に取り付けられるカニューレを介して神経毒を送達することによって達成されます。このアプローチは、破片の明確なカニューレを維持し、保護することは困難であるという点で制限されています。また、不活動を誘導するために、動物を行動試験の直前に（カニューレを介して毒素を投与するために）広く扱われている、WHIchが動物にストレスを課し、また、カニューレは頭蓋骨から外れることができる可能性が高くなります。 CNOの効果は比較的短期間であるため、（例えば、永久的病変または遺伝子操作したマウスでは、次の観察されたもののような）長期的代償機構の可能性は29,30を最小限に抑えています。
テクニックの制限
DREADDは非侵襲的に神経活動を減衰させる比較的新しい方法です。このような実験者は、独立して、神経サイレンシングがそれらの製造で発生することを確認するために傾斜させてもよいように。検証は、電気生理学的手法を用いて行うことができるが、これらの実験は、時間がかかり、コストがかかり、特定の専門知識を必要とします。 chemogenetic技術は光遺伝学よりも低コストでありながら、また、アプローチは、TTXなどの薬剤との伝統的な不活性化よりも高価です。 DREADD手法の別の制限は、infusありますウイルス構築物のイオンは、関心領域内のニューロンの100％の感染をもたらし、また、ニューロンの活性の100％の減少にCNOリード線を介して不活性化しないん。最後に、いくつかのAAV血清型を逆行実験結果2の解釈を複雑にすることができる搬送することができます。
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Acknowledgments
我々は、このプロトコルが部分的に誘導される原稿への貢献のためにロビンソンら 12の作者に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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