Abstract
이 프로토콜은 동물이 학습과 기억 작업에 종사하는 동안 일시적으로 원격으로 분리 된 뇌 영역에서 신경 세포의 활동을 침묵하는 방법에 대해 설명합니다. 접근 방식은 결합 약물 유전학 (디자이너 - 수용체가-전용 활성화별로 디자이너 - 약) 행동 패러다임 (감각 컨디셔닝)와 학습의 다양한 형태를 구분하기 위해 설계되었습니다. 즉, 바이러스 - 매개 전달은 유전자 변형 억제 G 단백질 결합 수용체 설치류 뇌에서 분리 된 영역으로 (디자이너 수용체)를 표현하기 위해 사용된다. 디자이너 수용체 발현 수준이 높은 경우 3 주 후, 약물 제 (디자이너 약물) 사전 행동 특정 세션에 30 분을 전신적으로 투여된다. 약물은 디자이너 수용체 친 화성을 가지며, 따라서 디자이너 수용체를 발현 신경의 억제를 초래하지만, 그 생물학적으로 불활성이다. 뇌 영역 (2-5 시간 동안 침묵에 의존적 유지땡) 투여 량 및 투여 경로에. 행동 패러다임 종료 후 뇌 조직은 정확한 배치와 수용체 발현에 대해 평가된다. 이러한 접근 방법은 동작의 특정 구성 요소에 대한 각각의 뇌 영역의 기여를 결정하는 행동 패러다임의 번호에 걸쳐 사용할 수있는 특히 유용하다.
Introduction
행동 신경 과학 분야 내 흥분 도전 복잡한 행동 신경 기판을 결정하는 것이다. 그러한 고정 병변, 캐 뉼러를 통해 임시 임플란트 뇌 비활성화 및 optogenetics 같은 수많은 기술 복잡한 행동 부성분 이산 뇌 영역의 기여를 식별하기 위해 사용되어왔다. 이러한 접근 방식은 학습 기간 동안 지역 특이성에 대한 우리의 이해를 통보하면서, 각각의 기술은 한계가없는 것은 아니다. 특히, 영구적 병변은 일반적으로, 따라서 그 효과는 패러다임의 기간에 걸쳐 존재하는, 행동 시험 전에 실시하고 있습니다. 뇌 조직에 상당한 손상을 일으킬 수있는 단기 신경 inactivator (예를 들어, 테트로도톡신)의 프리젠 테이션을 포함하고 직전 행동 테스트에 대한 주체의 스트레스를 유도 할 수 삽관 연구. 또한, 삽관 통해 불 활성화를 둘러싼 조직의 영역에 한정되어캐 뉼러의 끝. optogenetics 특정 뇌 영역에서 활동의 시간적 제어를위한 유연성을 제공하면서 마지막으로, 그것은 비용 금지 및 기술적 요구하고있다.
이러한 제한은 약물 유전 학적 접근 (디자이너 - 수용체 - 전용 활성화별로 디자이너 - 마약, DREADDs) 1, 2를 사용하여 극복 할 수 있습니다. 약물 유전학의 개념은 복잡하면서 중요한 것은, 상기 기술의 실행은 간단하다. 변형 억제 G 단백질 결합 수용체에 대한 DNA 단편을 포함 독소 (예, NMDA, ibotenic 산) 이산 뇌 영역으로는,이 기술은 아데노 - 관련 바이러스 (AAV)를 주입하는 것을 포함의 주입을 포함하는 전통적인 정위 수술 방법과 유사하게 (hM4Di, 디자이너 수용체) 표준 실험실 설치류의 관심 영역으로는 (그림 1 참조). 바이러스 벡터는 형광 기자 (mcitrine)가 포함되어 있습니다. 에 통합되면세포에, 디자이너 수용체 (리포터 단백질) 최대한 ~ 삼주 후 주입을 표현하고 선택적으로 다른 생물학적으로 불활성 디자이너 약물의 전신 투여, 클로자핀-N- 옥사이드로 2-5 시간 동안 활성화 할 수 있습니다 (CNO) 1 , 3. 실험은 특정 뇌 영역에서 신경 활동을 정밀하게, 아직 원격 제어 시간을 부여하기 때문에, 약물 유전학은 여러 단계로 진행됩니다 행동 패러다임에 특히 잘 결합한다. 이 예에서, retrosplenial 피질의 기여 (RSC)은 자극 - 자극하는 학습이 파블로프 학습에서의 역할과 비교된다, 그러나 접근 방식의 조합은 뇌 영역에 기여하는 방법을 특정 식별을 추구 질문의 수에 적합하다 복잡한 행동.
본 프로토콜에 설명되지하면서 또한, 바이러스 및 형질 전환 방법은 세포 형 특이 DREADD 식 (2)를 달성하기 위해 사용될 수있다. 나는DREADD 접근 방식을 사용하는 경우의 고유 실험 조작, 실험 설계 및 후속 정량 분석의주의 깊은 고려의 약리학 및 / 또는 다른 유형을 포함하는 행동 패러다임이 필요합니다. DREADD 접근 방식에 새로운 실험자은 현재 DREADD 기술 2의 종합적인 검토라고합니다.
매일, 생물은 새로운 자극과 이벤트와 서로의 관계에 대해 알아 봅니다. 도 친숙한 환경에서, 이러한 가정으로, 하나는 이러한 변경의 의미있는 사건 예측 될 수 있기 때문에 자극 사이의 관계의 변화를 검출하기 위해 빠른 것이다. 이러한 자극 - 자극 (즉, 관계형) 학습은 여러 자극들이 결합되어 포함 전통적으로 내측 측두엽 4에서 중앙 상주하는 해마와 관련이있다. 그러나, 해마 존재도 단독으로 작용하지 않는다; 내부와 외부 모두 대뇌 피질의 영역내측 측두엽의 측면은 해마 형성 5-7에 중요한 감각 정보를 제공합니다. 전통 영구적 병변 연구는 해마에 의존하는 학습 대뇌 피질의 영역 (예를 들어,, retrosplenial postrhinal 및 entorhinal 피질)의 수의 참여에 대한 강력한 증거를 제공하지만 이산 단계에서 특정 지역의 역할을 식별 할 수있는 능력에 제한이 8-10 학습.
본 프로토콜은 RSC는 3 상 감각 전처리 패러다임 (11, 12)의 단일 단계에서 RSC를 침묵에 의해 자극 - 자극 학습에 필요한 가설을 테스트합니다. 간단히 말해서, 쥐 디자이너 수용체를 포함하고 2 ~ 3 주 후에 행동 테스트를 시작하기 전에 디자이너 약물 (CNO) 30 분 관리되는 AAV의 주입을받을 수 있습니다. 본 프로토콜에서는, 실험 쥐 시험의 첫 번째 단계 (자극 - 자극 리어 동안 CNO를받을닝 발생)하고는 시험의 다음 2 단계에서 차량을받을 수 있습니다. 행동에 CNO의 부주의 효과를 제어하기 위해, 디자이너 수용체 (hM4Di)와 쥐를 주입 대신 CNO의 차량에 주입. 바이러스 주입 및 수용체 발현의 일반적인 효과를 설명하기 위해, 설계자 수용체를 포함하고 CNO를 관리하지 않는 제어 바이러스 달이다.
AAV의 상이한 혈청 형의 개수는 유전 물질을 전달하는 데 사용된다. 재조합 또는 합성 분자를 포함하는 연구 현재 NIH 지침 트랜스가 잠재적 종양 유전자 생성물 또는 독소 분자를 인코딩하지 않고의 부재하에 제조되는 것을 AAV (모든 혈청 형) 및 재조합 또는 합성 AAV 구조체를 유지 헬퍼 바이러스, BSL-1의주의 사항 (부록 B-1. 위험 그룹 1 (RG1) 에이전트) (13)을 필요로한다. AAV 구조, 유틸리티 및 안전에 관한 리뷰의 숫자는 14, 15 사용할 수 있습니다. 특히,하지만AAV 작업을 할 때, 설치류에서 가능한 생식 16, 17 및 잠재적 발암 메커니즘을 18 ~ 20에 관한 우려로 인해, 일부 기관은 BSL-2주의의 사용을 필요로한다. 연구는 질병 통제 및 미국의 유전자 조작에 바이러스 벡터를 사용하는 경우 재조합 DNA 분자 (13)를 포함하는 연구에 대한 NIH 가이드 라인, 센터를 실시한다 개별 기관의 감독위원회와 협의하여 사용하기 전에 해당 BSL을 확인합니다. 개인 보호, 연구자 훈련, 벡터 봉쇄, 오염 제거, 오염 제거 물질의 처분 및 사후 주입 동물 주택의 요구 사항은이 지침에 의해 지정됩니다. 또한, 상담 및 적절한 기관 동물 관리를 수행하고, 안전한 취급, 관리 및 AAV의 처분을 보장하기 위해위원회의 지침 또는 이와 동등한 기관 감독위원회 지침을 사용합니다.
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Protocol
동물의 사용은 오벌린 대학 기관 동물 관리에 의해 승인 및위원회를 사용하여 실험 동물 (21)의 관리에 대한 가이드에 따라 및 사용에있다.
바이러스 주입 1. 준비
참고 :이 프로토콜은 BSL-1의주의 사항을 사용합니다. BSL-2주의 사항, 일회용 실험실 코트, 장갑, 신발 커버, 눈 보호 및 미립자 호흡기를 (N95을 입력) 사용하는 경우 필요합니다. BSL-2 화합물을 취급 한 모든 개인은 지역 공공 보건 기관에 의해 미립자 인공 호흡기 테스트에 맞게해야합니다. 취급 및 바이러스 벡터의 저장에 대한 자세한 내용은 로리 & Majewska (2010 년) (22)을 참조하십시오.
- 20 μL의 microcentrifuge 튜브에서 처음 사용, 나누어지는 및 저장되지 않은 바이러스에 반복되는 동결 융해를 방지 할 수 있습니다.
- 불필요한 오브젝트를 제거하고 70 % 에탄올로 표면을 살균하여 작업 표면을 준비한다. 1 준비AAV 폐기물 오염 제거 0 % 표백제 솔루션입니다. 작업 표면에 표백제 용액과 멸균 10 μL 주사기의 전체 비커를 놓습니다. 셋업 동안 짓 눌린 얼음 용기에 AAV와의 microcentrifuge 튜브를 놓습니다.
- 표준 벤치 부사장으로 바이러스의 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. AAV의 최소 4 μL와 10 μL 주사기를로드합니다. 로드하는 동안 microcentrifuge 관의 바닥에 대한 주사기의 끝이 구부러지지 않도록주의하십시오. 주사기에 AAV 솔루션의 4 μL에 기포가 없는지 확인합니다.
- 10 % 표백제가 들어있는 비커에 빈 바이러스 튜브 폐기하십시오. 공급 업체에 의해 지정된 바이러스의 사용되지 않는 부분을 저장합니다.
- 폐기물 용기에 추가로 10 %의 표백제를 추가하고 폐기물 정화 액체 폐기물을 처분하기 전에 30 분 동안 앉아 할 수 있습니다.
- 제도적 지침의 지시에 따라 생물 학적 용기에 모든 보호 장비 및 플라스틱 폐기물 폐기하십시오. 데코10 % 표백제를 사용하여 바이러스와 접촉에 온 모든 장비 또는 표면을 ntaminate.
2. 수술
- 정위 장치에서와 전용 바이러스 처리 지역으로 지정 인접한 공간에 흡수 벤치 용지를 배치하여 수술 영역을 준비합니다.
- 수술 장치 근처 전용 바이러스 처리 영역에 10 % 표백제 폐기물 용기를 놓습니다.
- 마취의 꾸준한 수준을 유도하고 수술을 위해 쥐를 준비합니다.
- 의식 총 목적 운동 부족 손실이있을 때까지 이소 플루 란 가스 (1-3%의 범위) 및 산소 (100 %, 약 1 L / 분)의 혼합물을 함유 유도 챔버에 쥐를 놓는다. 수술을 통해 이소 플루 란 마취를 유지한다.
- 6 깊은 마취가 달성되면, 약간 귀 뒤쪽에 눈 사이에서 쥐를 면도.
- 대한 유도 챔버에 다시 쥐를 놓습니다추가로 1-3 분.
- 이소 플루 란 마취 시스템이 정위 수술의 코 콘에 연결되어 있는지 확인합니다. stereotax에 이소 플루 란의 흐름을 시작 이소 플루 란 튜브의 마개를 엽니 다. 위에서 지정한 수준에서 이소 플루 란과 산소를 유지한다.
- 물린 줄에 입을 확보하고 귀 막대를 확보하여 정위 장치에서 쥐를 놓습니다.
- 절개하기 전에 수술 부위에 눈 눈에 윤활제 및 betadine을 적용합니다.
- 눈에 꼬리 약 2mm를 시작 두개골의 등쪽 표면에 피부의 2.4 CM의 중간 선 절개를합니다. 두개골을 노출 피부를 후퇴. 주기적으로 건조되는 것을 방지하기 위해 조직의 수술 부위 마진 멸균 0.9 % 멸균 식염수를 주입.
- 브레 그마 및 람다까지 두개골에서 삭제 막성 조직은 명확하게 볼 수 있습니다.
- 두개골의 지느러미 - 복부 좌표를 측정하여 수준인지 확인브레 그마 및 람다에서. 브레 그마 및 람다에서 지느러미 - 복부 좌표 이하 0.04 mm의 차이까지 따라 정위 장치를 조정합니다.
- 이 때, 2 % 내지 2.5 이소 플루 란 가스를 줄일 수 있습니다.
- 좌표 rezero, 브레 그마에 드릴을 돌려 다음 원하는 중간 - 측면에 드릴을 이동하고 전후방 좌표입니다.
- 홀에서 드릴이 28 G 주입 주사기위한 적절한 크기로 구멍을 만들어 0.9 mm의 드릴 비트를 사용하여 좌표.
- 0.2 μL / 분의 속도로 바이러스를 전달하는 주입 펌프를 설정한다. 정위 장치의 주입 팔에 주사기를 놓고 좌표 원하는에 주사기를 내립니다. 바이러스의 원하는 양을 전달 (0.1 μL 0.8 범위). 예를 들어, 4 분에 걸쳐 AAV의 0.8 μl를 제공합니다.
참고 : 이상적인 주입 볼륨과 관심의 각 지역에서 바이러스의 전형적인 확산을 결정하기 위해 파일럿 연구를 실시하고 있습니다.- 바이러스의 전달은 공동되면10 분 바늘 관으로 역류를 방지하기 위해 제자리에 mplete 주사기를 떠난다. 천천히 약 5mm / 분의 속도로 주사기를 올린다. 모든 좌표가 AAV 주입 될 때까지 반복합니다.
- 수술 스테이플와 코트 국소 항생제 연고와 상처를 사용하여 상처를 닫습니다.
- 수술 후 통증 관리를위한 기관의 지침을 따르십시오.
- 침구, 뚜껑과 적절한 간판과 새장에 쥐를 놓고 동물 시설에 쥐를 반환합니다.
- BSL-2주의에서 작업하는 경우, 기관의 지침에 의해 지정된 시간 (일반적으로 48 ~ 72 시간)을 위해 침대를 수집합니다. 생물 학적 폐기물 용기에 침구를 놓습니다.
- 자신의 안전한 폐기를위한 가이드 라인에 의해 지정된 모든 AAV-오염 물질 폐기하십시오.
3. 행동 장치
참고 : 감각 전처리 장치는 표준 적 조건화의 참으로 구성BER 스테인레스 스틸 그리드 바닥 (12 "의 (L) X 9.5"폭 x 11.5 "H), 2 플렉시 유리 측벽 2 금속 벽.
- 2 Hz에서 번쩍 때 시각적 자극 집 등의 역할을 할 수있는 알루미늄 벽 중 하나와 같은 2.8 W 빛을 탑재합니다. 청각 자극을 제공하기 위해 챔버에 스피커를 장착합니다 (10 초, 1500 Hz에서, 78dB 순수한 음색과 10 초 78dB 화이트 노이즈).
- 식품 컵에 45 mg의 음식 알약을 제공하기 위해 식품 호퍼를 사용합니다. 식품 컵 내에서, 적외선 광전지는 동안 및 자극 및 식품 보상의 프리젠 테이션 후, 전에 음식 컵에 소요 된 총 시간을 감지합니다.
- 하우스 배기 팬이 장착 사운드 감쇠 캐비닛의 챔버 (22 "폭 x 22"높이 x 16 "D) (~ 68dB).
- 데이터를 조작 적 챔버를 제어하고 취득 메드 어소 소프트웨어가 설치된 PC의 컴퓨터를 사용하십시오. 냉방 세션 동안 presenta 동안 음식물 컵 헤드와 소요 된 총 시간에 대한 데이터를 수집빛 자극 (5 초 시대)의 기 및 음식 보상 (5 초 시대)의 프리젠 테이션시. 테스트 세션 동안 (청각 자극이 종료 10 초 에포크 시작) 청각 자극의 프레 젠 테이션에 대한 응답으로 음식 컵에 소요 된 총 시간에 대한 데이터를 수집합니다.
감각 전처리 패러다임 4. 개요
- 수술 회복 후, 서서히 식품은 자유 섭식 체중의 85 %로 제한 쥐. 적절한 음식 제한 패러다임에 대한 수의학 직원에게 문의하십시오.
주 : 3 상 감각 전처리 패러다임은도 2에 도시되어있다. - 전처리 세션은 (1 단계, 매일 64 분 훈련은 4 일 연속에 걸쳐 실시)
- 청각과 시각적 자극의 전달 구성 12 혼합 실험과 현재 쥐. 간 시험 간격을 포함 각 후 평균 4.5 분 (범위 4.0 분 5.0) 그uditory 프리젠 테이션.
- 10 초 동안 시험, 현재 톤 (미리 조정 자극)의 6 일, 깜박이는 빛 자극의 5 초 발표 바로 다음에.
- 다른 6 시험에서 10 초 동안 혼자 화이트 노이즈 (짝 자극)을 제시한다.
- 컨디셔닝 세션 (2 단계 5 일간에 걸쳐 실시 매일 64 분 교육 세션) :
- 5 초 동안 시각적 자극 (깜박이는 빛의 자극)의 전달로 구성되어 8 시련과 현재 쥐이 45 mg의 음식 펠렛의 배달 바로 다음에. 간 시험 간격을 포함 각 시험 후 평균 7 분 (범위 6.0 분, 8.0)가. 때때로 쥐 빛 음식의 관계를 배울 수 5 개 이상 조절 세션을 필요로한다.
- 테스트 세션 (3 단계, 하나의 78 분 세션) :
- 혼자 청각 자극의 전달 구성 12 혼합 실험과 쥐를 제시. 집결지 간 시험 간격 포함분노 4.5 분 (범위 4.0 분 5.0) 각 청각 발표 후.
- 시련의 6에서 10 초 동안 만 톤 자극 (미리 조정 자극)을 제시한다.
- 다른 6 시험에서 10 초 동안 혼자 화이트 노이즈 (짝 자극)을 제시한다.
- 컨디셔닝 자극과 백색 잡음과 짝 자극과 톤을받을 쥐의 두 번째 세트와 연구를 완료하여 자극을 상쇄.
5. 약리 및 행동 절차
- 행동 장치에 전원을 켜고 적절한 행동 세션의 MED-PC의 코드를로드합니다. 와이어 및 프로그램 행동 장치 소음 감쇄 캐비닛에 장착 된 팬은 전원이 켜져있을 때를 켜도록.
- 클로자핀 N 옥사이드 (CNO)의 1 ㎎ / ㎖ 용액을 조제, 15ml의 원뿔형 튜브에 CNO 5.0 ㎎ 무게 멸균 0.9 % 멸균 SalI을 5 ml의 물 또는 5를 가하여NE. 솔루션까지 소용돌이는 분명하다.
- CNO는 용액에 용해되지 않는 경우 또는 CNO 더 농축 용액은 예컨대 DMSO (23), 용해 보조제를 추가 원하는 경우. 특히, 0.5 % DMSO와 CNO의 1 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 CNO 5.0 mg의 무게 15 ML 원뿔 튜브에 DMSO의 25 μl를 추가 할 수 있습니다. 톡 부드럽게 내용이 튜브의 바닥에 남아 보장한다. 맑은 용액이 될 때, 멸균 된 물을 5 ml 멸균 수 또는 0.9 % 식염수 5 mL를 추가한다. CNO의 솔루션을 준비하기위한 자세한 지침은 DREADD 위키 자원 25 페이지에서 사용할 수 있습니다.
- 이 관리되는 매일 새로운 CNO 솔루션을 준비합니다.
- 1 mg을 투여 량으로 복강 내 주사를 CNO은 / 약 30 분 전에 행동 시험에 kg. 예를 들어, 1 ㎎ / ㎖ CNO 용액 0.2 mL를 200g 주입 쥐. CNO 관리의 투여 량과 시간 과정은 이전에 게시 된 보고서 2,12을 기준으로 선정되었다.
- (1 단계, 주사 4 일 총) 각 전처리 세션에 앞서 CNO 30 분을 주입하지만, 이후의 모든 행동 세션 이전에 차량을 관리 할 수 있습니다.
- 30 분 후, 행동 시험 챔버로 쥐를 배치하고 적절한 행동 세션에 대한 컴퓨터 코드를 개시.
- 행동 작업이 완료되면, 바로 챔버에서 래트를 제거한 동물 콜로니에 쥐를 반환한다.
행동 데이터의 분석 (6)
참고 : 모든 행동 세션의 종속 변수는 음식 컵에 적외선 광전지의 중단에 의해 검출 된 쥐의 머리가 음식 컵 안에있는 시간의 양입니다. (단위는 sec)의 데이터를 수집하여 컴퓨터 소프트웨어에 의해 기록된다.
- 조회하지 마십시오 전처리 단계에서 생성 된 데이터를 분석합니다.
- 조절 세션의 각 쥐 '를 분석부 합성은 5 행동 세션에서 시각적 자극의 프레젠테이션 중에 음식 컵 동작을 비교하여 빛 음식의 관계를 배울 수 있습니다. 특히, / 세션 (8) 시험의 각 5 초 광 시대 동안 음식 컵에 소요 된 평균 시간을 계산한다 (즉, 지속 시간 / 쥐의 각 5 초입니다 (8) 시험의 평균). 평균 제어 및 5 일 각 세션에 대한 실험 값을 (그림 3A 참조) 비교.
- 상기 5 초 광 에포크에 대해 지정된 것과 동일한 계산을 이용 5 행동 세션에서 음식 보상 (5 초 에폭)의 운반 중에 식품 컵 거동을 비교함으로써 음식 보상을 얻기 위해 쥐 '동기를 분석한다. 이 값은 시각적 자극의 프레젠테이션 중에 획득 한 것보다 지속적으로 더 높을 것이다 (그림 3B 참조).
- 테스트 세션의 경우 : 대가에 응답 래트 '음식 컵 동작을 설명 판정 비율을 계산할각각의 청각 자극의 entations.
- 특히, 각각의 쥐를 들어, 6 프리젠 테이션을 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요되는 평균 시간의 합으로 감각 컨디셔닝 자극의 6 프리젠 테이션 (즉, 톤)의 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요 된 평균 시간을 분할 감각 컨디셔닝 자극 (즉, 톤 자극) 플러스 짝 자극 (즉, 백색 잡음 자극)의 6 프리젠 테이션을 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요 된 총 시간의 평균. 각 시대는 지속 시간이 10 초입니다.
주 : 0.5 이상의 차별 점수가 쥐 감각 전처리 패러다임에 내재 된 연결을 배운 보여줍니다.
- 특히, 각각의 쥐를 들어, 6 프리젠 테이션을 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요되는 평균 시간의 합으로 감각 컨디셔닝 자극의 6 프리젠 테이션 (즉, 톤)의 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요 된 평균 시간을 분할 감각 컨디셔닝 자극 (즉, 톤 자극) 플러스 짝 자극 (즉, 백색 잡음 자극)의 6 프리젠 테이션을 각각 다음과 같은 음식을 컵에 소요 된 총 시간의 평균. 각 시대는 지속 시간이 10 초입니다.
AAV 배치와 표현의 7. 확인
- 마취로 transcardially 및 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 래트를 관류. 인해 형광 라벨의 사용 min으로 2 시간의 후 - 정착 시간을 초과하지imize 손실 항원의 형광 신호를 보존 할 수 있습니다.
- 이일 최소 또는 뇌 뇌 병의 바닥에 가라까지 인산염 완충 식염수 (1X)의 20 % 자당 용액 30 ㎖를 함유하는 뇌 항아리로 전송하여 관류 뇌 탈수.
- 관심 영역의 전체 rostrocaudal 범위에 걸쳐 관상 뇌 부분 (20 ~ 40 μm의)를 만들기 위해 동결 슬라이딩 마이크로톰을 사용합니다.
- 디자이너 수용체 및 / 또는 기자 (12)의 위치와 발현을 확인하기 위해 태그 수용체 또는 리포터 단백질에 대한 면역 조직 화학 감독을 실시한다. 면역 조직 화학 염색 프로토콜은 DREADD 위키 리소스 페이지 (25)에 제공된다.
- 수성 장착 매체의 100 ~ 200 μl를 사용 superfrost 플러스 슬라이드와 커버 슬립 위에 섹션을 탑재합니다.
- AAV 배치 및 단백질 발현 12, 24을 확인하기 위해 뇌 조직에 형광 현미경을 수행합니다.
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Representative Results
행동 결과
실험이 완료되면 특정 지역 임시 불 활성화 효과는 정량적 및 정 성적으로 평가되어야한다. 본 예에서는 CNO이 RSC 중립 자극 (12) 간의 연결의 형성에 필요한 가설을 테스트하기 위해 전처리 세션 동안 RSC에서 신경 활동을 감쇠 투여되는 3 상 행동 패러다임 (감각 전처리)를 포함한다. 중요한 것은, 실험자는 행동 패러다임 또는 약물 유전 학적 접근이 가장 행동 패러다임과 결합 될 수있는 본원에 기재된 실험 설계에 한정되지 않는다.
분석은 일반적으로 전처리 세션 (1 단계) 중에 발생하는 데이터에 대해 수행되지 않는 반면에, 그것은 쥐 컨디셔닝 세션 (2 단계) 동안 빛 식품 협회 배운 여부를 정량화하는 것이 중요하다. 인터넷에 도시 된 바와 같이gure의 3A, 모두 실험 (EXPT) 및 제어 (CTRL) 쥐 쥐가 시각적 인 자극 (빛)과 음식 보상 사이의 파블로프 연관을 획득 한 것을 나타내는 빛 자극 (그림 3A)의 프리젠 테이션을하는 동안 음식 컵 행동을 증가 보여줍니다. 게다가, 두 그룹은 보상을 얻기 위해 동등한 의욕을 나타내는 음식 보상 (도 3b)의 프레젠테이션 중에 음식 컵 동작을 증가 보여준다. 청각 자극이 다른 자극의 부재하에 제공하는 경우 중요한 검사 세션 중에, 대조군 실험 쥐 (도 3c)와 크게 다르다 판정 점수를 갖는다. 그래프의 육안 검사를 대조군의 평균 차별 비가 음식 컵에 비하여 (전처리시) 광 페어링 된 청각 자극의 프리젠 테이션에 응답하여, 더 많은 음식물 컵 동작을 나타내는 0.5보다 큰 것을 알(전처리시) 비공유 된 청각 자극의 프레 젠 테이션에 응답하여 동작. 반면, 실험 쥐 기회 이상 차이 스코어를 입증하지 못한다. 따라서,도 3c는 제어가 아니라 실험 쥐 감각 전처리 효과를 나타냈다 것을 보여준다.
AAV 배치의 검증
행동 검사의 완료시, 정확한 위치 및 디자이너 수용체의 발현을위한 쥐 뇌 조직을 분석한다. 실시 면역 수용체 태그 (예, 항 HA 차 항체) 또는 형광 리포터 대항하여 12,25 일차 항체 (이 예에서는, 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 항체에 의해 검출된다 mcitrine). 래트의 뇌를 통한 관상 단면의 개략도는도 4a에 도시되어있다.도 4b는 리포터 PROT의 강력한 면역 형광을 도시. 주변 지역에서 감지 된 형광 레이블을 대표하는 실험 쥐에서 RSC에서 EIN도 4C - D 실험 (EXPT에서 기자 단백질의 대표 형광 라벨을 설명, 쥐가 디자이너 수용체 유전자를 포함하는 AAV 구조 및 mcitrine 유전자를 주입했다 ) 및 제어 (CTRL 랫트 각각 GFP 유전자하지만 디자이너 수용체 서열 없음) 래트를 함유 유사한 AAV 구조체 주입 하였다. 수용체 수준은 최소 최대 대표 식 24과 같이 표시 될 수있다. 표지는 관심 영역의 외부 영역에서 검출된다면, 행동 분석에서 그 데이터를 배제.
그림 1 :. AAV 구조의 개략도 hSyn-HA-hM4D (GI)의 그림은 AAV 특급하는 데 사용 - mCitrine이 -IRESRESS RSC 신경 세포에서 신경 세포의 특정 synapsin 프로모터 (hSyn)에서 억제 디자이너 수용체 (hM4Di). 면역 형광 리포터 (HA 태그 및 / 또는 mcitrine)는 각각 리포터 단백질의 발현을 시각화 할 수있다. hSyn, 인간의 synapsin 프로모터; 신경 세포에서 발현을 지정합니다. HA, hemagluttinin 태그; 이 태그는 디자이너 수용체 융합 수용체 발현의 검출을 가능 에피토프 태그로서 작용한다. hM4Di, 디자이너 억제 G 단백질 결합 수용체에 대한 유전자. IRES, 내부 리보솜 진입 사이트; 기자 (mcitrine)을 번역 할 수 있습니다. mcitrine, GFP의 변형이지만 photobleaching에 더 저항성 형광 기자.
그림 2 : 감각 전처리 패러다임의 개략도 () 전처리 SESS 동안.이온은 12 혼합 시험이되게됩니다. 10 초 점멸 집 광 자극 (5 초 동안 2 Hz에서) 바로 다음의 시험 6시, 청각 자극이 제시된다. 기타 (6) 시험하는 동안, 두 번째 청각 자극은 시각 자극을받지 않고있다. 컨디셔닝 세션 동안 (B)는, 이전에 페어링 시각적 자극은 식품 보상와 결합된다. 테스트 세션 동안 (C), 시각적 자극 또는 식품의 부재에있는 두 개의 청각 자극의 12 상호 혼합 프리젠 테이션이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. () 동안 응답 행동 결과 평균 식품 컵 빛과 (B) 식품 시대가 뒤컨디셔닝 세션 (2 단계) 반지. 데이터는 반복 측정을 분산 분석을 사용하여 분석 하였다. 테스트 세션 (3 단계) 중 (C) 차별 비율. 점선은 각각의 청각 자극에 반응 조절 식품 컵의 동일한 양 (즉, 아무 감각 전처리) 데이터는 독립 표본 t 검정을 이용하여 분석 하였다을 나타냅니다. EXPT; 실험 쥐 (N = 17)를 억제 G 단백질 결합 수용체의 디자이너 (hM4Di) 및 형광 리포터 (mcitrine)에 대한 DNA 서열을위한 DNA 서열을 함유 AAV 구조체 주입. Ctrl 키; 대조군 (N = 6) hM4Di 주입 투여 비히클은 대조군과 결합 (N = 4) 디자이너 수용체를 포함하지 않는 AAV 바이러스를 주입하고 그 CNO을 투여 하였다. 컨트롤 그룹은 크게 서로 (P> 0.05)에서 차이가 없었다. 오차 막대는 ± SEM을 나타낸다.
도 4 : 단백질 발현의 조직 학적 검증 (A) 쥐의 뇌를 통한 관상 부에서 RSC의 위치를 나타내는 개략도.. (B) 억제 G 단백질 결합 디자이너 수용체에 대한 DNA 서열 (hM4Di) 및 형광 리포터를위한 DNA 서열 (함유 AAV 구조체 주입 한 실험 쥐 (EXPT)로부터 면역 표지 된 쥐의 뇌 조직의 대표적인 이미지 mcitrine). mcitrine 녹색 형광 단백질의 높은 페이드 내성 변종이다. (C) 형광성 리포터 라벨 (mcitrine)의 위치를 나타내는 실험 쥐에서 대표 화상. (D) 형광 리포터 대한 DNA 서열을 함유 AAV 구조체 주입 제어 쥐 (CTRL)로부터 대표 화상 (GFP 향상). 스케일 바 : B, 500 μm의; C와 D, (100)(81);. M 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 특정 뇌 영역이 다단계 복잡한 학습 과제에 기여하는 방법을 조사하기 위해 약물 유전 학적 접근 (DREADD)를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 일시적으로 원격 학습 단계에 걸쳐 이산 뇌 영역에서의 신경 활성을 침묵하는 기능, 방법의 조합 학습의 미묘한 차이 또는 마스크 형태를 포함 행동의 넓은 범위를 조사 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 이 프로토콜에 설명 된 예에서, retrosplenial 피질 (RSC)에서 디자이너 수용체를 발현 래트 쥐가 3 상 행동 태스크 (12)에서 시험을 제어 하였다. 작업의 첫 번째 단계는 자극의 두 사이의 자극 - 자극 연결을 취득 할 쥐를 제어 가정 여러 중립 자극의 프레 젠 테이션을하고있었습니다. 작업 가설 RSC 30 분 전에 행동 시험 개시 4 일 컨디셔닝, 각각, 즉, 자극 자극치 학습에 필요하다는 것이다ING, 제어 및 실험 쥐 디자이너 약물 (CNO) 또는 차량 중의 전신 투여를 받았다. 디자이너 수용체에 결합 할 때, CNO 그 수용체가 발현하는 신경 세포의 활성을 감소시킨다. RSC는 학습에 영향을 가정되지 않은 행동 조절 및 시험의 나머지 단계에서, CNO 투여되지 않았고, 따라서 신경 활동을 방해하지 않았다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
AAV 화합물의 안전한 취급 : 약물 유전 학적 접근에 관련된 수술은 더 이상 기술적으로 까다로운 단순 정위 주입보다, 그러나 일부 기관에서 AAV의 사용은 실험자은 BSL-2주의 사항을 준수해야합니다. 이 연구자는 질병 관리 센터, 자금 지원 기관, 홈 기관 및 연구 프로그램에 특정 다른 감독위원회가 설정 한 지침을 준수하는 것이 중요합니다. 일에 대한 정보AAVs의 전자 안전 취급 13 쉽게 사용할 수 있습니다.
디자이너 약물의 제조 및 관리 : CNO, 디자이너 약물은, 디자이너 수용체에 결합하여 신경 활동을 침묵하지만 그렇지 않으면 생물학적 1,3 불활성이다. 공급 업체 CNO의 선적 일관성에 따라 다를 수 있습니다. 화합물은 용기의 측면에 부착되지 않은 분말로서 도달한다.
이전 행동 테스트로, 디자이너 약물의 비 특정 효과를 제어하기 위해 실험 쥐의 다른 세트를 주입 (즉, 디자이너 수용체 발현 것) 대신에 CNO의 차량 주사와를 : 중요 대조군 고려해야한다. 또한, 설계자 수용체의 비특이적 효과 형광 리포터 아니라 개질 디자이너 수용체를 포함하는 제어 바이러스 주입되는 쥐의 그룹을 포함 제어하고 디자이너 약물이 쥐를 주입 (즉, CNO) . Ensu그룹 전체 상쇄하여 적절한 실험 설계를 다시.
구조물의 발현을 확인 : 디자이너 수용체의 발현 및 검출을 최대화하는 방법은 많이있다. 주입하기 전에 바이러스 역가가 10 ~ 12 입자 / ㎖ 근처에 있는지 확인하십시오. 종종, 형광 리포터의 시각화가 낮고, 따라서, 이는 면역은 리포터 (들)에 대한 항체를 이용하여 관심 영역에 대해 수행 될 것을 권장 바이러스 구조체 (25)에 포함된다. 이 예에서, 항 면역 GFP는 강력한 신호를 제공한다 (도 4B - D). 중요한 때문에 형광 라벨의 특성, 2 시간에 정착 시간의 길이를 제한한다.
기술들의 장점
바이러스 구조가 정위 수술을 통해 뇌에 전달되면, 약물 유전 학적 접근을 가능하게 임시 inacti디자이너 약물의 최소 침습 전신 주입에 의해 분리 된 영역에서 뇌 활동의 vation. 약물 투여는 연속적인 일 또는 주 12,24,26에 걸쳐 발생하는 행동 작업에 유리하다, 반복적으로 발생할 수 있습니다. 또한, 증거는 디자이너 약물 (CNO)의 전위의 행동이나 식욕 27,28 방해하지 않음을 나타냅니다. 따라서, 상기 방법은 임시 불 활성화하는 다른 방법에 고유 스트레스를 피하면서, 시간 (2-5 시간)의 짧은 기간 동안 신경 활동을 감쇠 할 수있는 기회를 제공한다. 구체적 삽관 연구에서, 임시 불활 영구적 두개골에 부착되는 캐 뉼러를 통해 신경독의 전달에 의해 달성된다. 이 방법은 이물질이 명확하고 보호 캐 뉼러를 유지하는 것이 어려운 것을 제한됩니다. 또한, 활동을 유도하기 위해, 동물 행동 실험에 직전 (캐 뉼러를 통해 독소를 관리하는) 광범위하게 처리, WHI채널은 동물에 스트레스를 부과하고 또한 캐 뉼러는 두개골에서 이동시키다 수있는 가능성이 높아집니다. CNO의 효과가 상대적으로 짧은 기간이기 때문에, (예컨대 영구 병변이 관찰 된 것과 같은 유전자 조작 또는 생쥐) 장기 보상 메커니즘 29,30 가능성을 최소화된다.
기술의 한계
DREADD 비 침습적 신경 세포의 활동을 감쇠의 비교적 새로운 방법입니다. 이러한 실험자이 독립적으로 확인하는 경향 수있는 바와 같이 그 신경 침묵은 준비 발생합니다. 검증은 전기 생리 접근 방식을 사용하여 수행하지만,이 실험은 비용이 많이 드는 시간이 소요되고 특정 전문 지식을 필요로 할 수 있습니다. chemogenetic optogenetics 기법보다 비용이 덜 드는 반면 또한, 이러한 접근법은 TTX 같은 약리학 제제 전통적인 불활보다 더 비싸다. DREADD 접근 방식의 또 다른 한계는 그 infus입니다바이러스 성 구조의 이온은 관심의 영역에서 뉴런의 100 % 감염 발생,도 신경 활동의 100 % 감소 CNO 리드를 통해 불 활성화를 수행하지 않습니다. 마지막으로, 일부 AAV 혈청 형은 역행 실험 결과 2의 해석을 복잡하게 할 수있는 운반 할 수있다.
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Acknowledgments
우리는이 프로토콜이 부분적으로 파생 된 원고에 대한 그들의 공헌 로빈슨 등. (12)의 저자 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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