Abstract
Este protocolo descreve como silenciar temporariamente e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os animais estão envolvidos em tarefas de aprendizagem e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptores-exclusivamente-Activated-a-Designer-Drogas) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que se destina a distinguir entre diferentes formas de aprendizagem. Especificamente, a entrega mediada por vírus é utilizado para expressar um receptor geneticamente modificado inibidora acoplado a proteína G (o Designer receptor) para uma região do cérebro discreta no roedor. Três semanas mais tarde, quando os níveis de expressão do receptor desenhador são elevados, um agente farmacológico (Designer fármaco) é administrado sistemicamente 30 min antes de uma sessão comportamental específica. A droga tem afinidade para o receptor de design e, portanto, resulta na inibição de neurónios que expressam o receptor do desenhador, mas caso contrário, é biologicamente inerte. A região do cérebro permanece silenciado por 2-5 hr (depenDing da dose e via de administração). Após a conclusão do paradigma comportamental, tecido do cérebro é avaliada para a colocação correcta e expressão do receptor. Esta abordagem é particularmente útil para determinar a contribuição de regiões cerebrais individuais para os componentes específicos do comportamento e pode ser usado em qualquer número de paradigmas comportamentais.
Introduction
Um emocionante desafio dentro do campo de neurociência comportamental é determinar os substratos neurais de comportamentos complexos. Um certo número de técnicas, tais como lesões permanentes, a inactivação do cérebro através de implantes temporários cânulas e Optogenetics foram utilizados para identificar as contribuições de regiões cerebrais discretas de subcomponentes de comportamentos complexos. Embora estas abordagens informar a nossa compreensão da especificidade regional durante a aprendizagem, cada técnica não é sem limitações. Especificamente, lesões permanentes são tipicamente conduzida antes do teste comportamental, assim os seus efeitos estão presentes ao longo da duração do paradigma. Canulação estudos que envolvem a apresentação de um inactivador neural de curto prazo (por exemplo, tetrodotoxina) pode produzir danos substanciais para o tecido cerebral e podem induzir o stress em indivíduos apenas antes do teste comportamental. Além disso, a inactivação por meio de punção é limitada à região de tecido que envolve oponta da cânula. Por último, enquanto optogenética oferece uma gama de flexibilidade para o controle temporal da actividade em regiões específicas do cérebro, que é o custo proibitivo e tecnicamente exigente.
Essas limitações podem ser superadas através de uma abordagem farmacogenética (designer-receptores activados Exclusivamente-a-Designer-Drogas, DREADDs) 1,2. Mais importante, embora o conceito de farmacogenética é sofisticada, a execução da técnica é simples. Similar aos métodos cirúrgicos estereotáxicas tradicionais que envolvem a infusão de uma toxina (por exemplo, o NMDA, ácido iboténico) em regiões cerebrais discretas, esta técnica envolve a infusão de um vírus adeno-associado (AAV) que contém um fragmento de ADN para um inibidor do receptor modificado acoplado a proteína G (hM4Di; o receptor designer) para a região de interesse de roedores laboratoriais padrão (ver Figura 1). O vector viral também contém um repórter fluorescente (mcitrine). Uma vez incorporados nopara as células, o desenhador do receptor (e proteína repórter) são maximamente expressa três semanas pós-infusão ~ e pode ser activada selectivamente para 2-5 horas por administração sistémica da droga desenhador de outra forma biologicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) 1 , 3. Porque o experimentador é dotado de controle temporal preciso, ainda remota sobre a atividade neural em regiões específicas do cérebro, farmacogenética combina muito bem com paradigmas comportamentais que são realizados em várias fases. Neste exemplo, a contribuição do córtex retrosplenial (RSC) ao estímulo-estímulo de aprendizagem é comparado com o seu papel na aprendizagem pavloviano, porém essa combinação de abordagens é bem adequado para qualquer número de questões que buscam identificar regiões do cérebro como específica contribuir para comportamento complexo.
Além disso, embora não descritos no presente protocolo, virais e abordagens transgénicas podem ser usadas para atingir células de tipo específico DREADD expressão 2. Como is inerente em paradigmas comportamentais que envolvem tipos farmacológicos e / ou outras das manipulações experimentais, uma análise cuidadosa do desenho experimental e análise quantitativa subsequente é necessário quando se utiliza a abordagem DREADD. Experimentadores novas para a abordagem DREADD são encaminhados para uma avaliação abrangente da tecnologia atual DREADD 2.
Cada dia, os organismos aprender sobre novos estímulos e eventos e seus relacionamentos entre si. Mesmo em um ambiente familiar, tais como casa, é rápido para detectar alterações nas relações entre estímulos, porque essas alterações podem ser preditivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (isto é, relacional) aprendizagem envolve a conjunção de vários estímulos e, tradicionalmente, tem sido associada com o hipocampo, que reside centralmente dentro do lobo temporal medial 4. No entanto, o hipocampo não existe nem actuar isoladamente; regiões corticais, tanto dentro como foralateral do lóbulo temporal medial fornecer informação sensorial crítica para a formação do hipocampo 5-7. Os estudos tradicionais permanentes lesão fornecem evidências convincentes para o envolvimento de um número de regiões corticais (por exemplo, os córtices retrospl�icos, postrhinal e entorrinal) na aprendizagem dependente do hipocampo, mas são limitados em sua capacidade de discernir o papel de uma determinada região durante as fases discretas de 8-10 aprendizagem.
O presente protocolo testa a hipótese de que a RSC é necessária para a aprendizagem estímulo-estímulo ao silenciar a RSC durante uma única fase de um 3-fase de pré-condicionamento sensorial paradigma 11,12. Resumidamente, os ratos recebem uma infusão de AAV que contém o receptor de design e ~ 3 semanas mais tarde são administrados a droga Designer (CNO) 30 minutos antes do início do teste de comportamento. No presente protocolo, os ratos experimentais receber CNO durante a primeira fase de testes (quando lear estímulo-estímuloning ocorre) e eles recebem veículo durante os próximos 2 fases de testes. Para controlar os efeitos involuntários de CNO no comportamento, infundir ratos com o receptor designer (hM4Di) e injetar com veículo em vez de CNO. Para dar conta de efeitos gerais de infusão viral e expressão do receptor, infundir um vírus de controle que não contém o receptor designer e administrar CNO.
Um número de diferentes serotipos de AAV são utilizadas para entregar material genético. Os actuais orientações NIH para a pesquisa envolvendo recombinante ou moléculas sintéticas que mantém AAV (todos os serotipos) e construções de AAV recombinantes ou sintéticos, em que o transgene não codifica um produto de gene ou potencialmente carcinogénicos ou uma molécula de toxina e são produzidos na ausência de um vírus auxiliar, exigem precauções BSL-1 (Apêndice B-1. Risco do Grupo 1 (RG1) agentes) 13. Uma série de avaliações referentes à estrutura de AAV, utilidade e segurança estão disponíveis 14,15. Notavelmente, embora, Devido a preocupações relativas a possíveis reprodutivos 16,17 e mecanismos potenciais cancerígenos 18-20 em roedores, algumas instituições exigem o uso de BSL-2 precauções quando se trabalha com AAV. Verifique a BSL apropriado antes de usar, consultando os comitês de supervisão em instituições individuais em que a investigação será conduzida, os Centros de Controle de Doenças e as Diretrizes do NIH para a pesquisa envolvendo moléculas de DNA recombinante 13 ao usar vetores virais para manipulação genética nos Estados Unidos. Protecção individual, de formação investigador, contenção vetor, descontaminação, eliminação de materiais descontaminados, e pós-injeção de animais requisitos habitacionais são especificados por estas orientações. Além disso, consultar e siga apropriado Institutional Animal Care e Use as orientações do comitê ou orientações do comitê de supervisão institucionais equivalentes para garantir o manuseio seguro, administração e alienação de AAV.
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Protocol
O uso de animais são aprovados pelo Oberlin College Animal Care Institucional e Use comissão e estão em conformidade com o Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 21.
1. Preparação para perfusão Viral
Nota: Este protocolo usa BSL-1 precauções. Ao empregar BSL-2 precauções, um jaleco descartáveis, luvas, sapato cobre, proteções oculares e um respirador de partículas (tipo N95) são obrigatórios. Todos os indivíduos manipulação BSL-2 compostos devem ser testados para caber um respirador de partículas por uma agência de saúde pública local. Consulte Lowery & Majewska (2010) 22 para obter detalhes adicionais sobre manuseio e armazenamento de vetores virais.
- Após a primeira utilização, alíquota e armazenar vírus não utilizado em 20 microtubos ul para evitar congelamento e descongelamento repetido.
- Preparar a superfície de trabalho através da remoção de quaisquer objectos desnecessários e esterilizar a superfície com etanol a 70%. Prepara-se uma 1Solução de água sanitária 0% de descontaminação de resíduos AAV. Coloque um copo cheio de solução de lixívia e uma seringa de 10 mL estéril, para a superfície de trabalho. Coloque o tubo de microcentrífuga com o AAV em um recipiente com gelo picado durante a configuração.
- Coloque o tubo de microcentrífuga com o vírus em uma morsa padrão. Carregar uma seringa de 10 mL com, pelo menos, 4 ul de AAV. Ter cuidado para não dobrar a ponta da seringa contra a parte inferior do tubo de microcentrífuga durante o carregamento. Certifique-se de que não existem bolhas de ar nos 4 ul de solução de AAV na seringa.
- Descarte o tubo de vírus vazio no copo contendo 10% de alvejante. Armazenar as porções não utilizadas do vírus, tal como especificado pelo fornecedor.
- Adicione água sanitária adicional de 10% para o recipiente de resíduos, e permitir que os resíduos que se sentar por 30 minutos antes de descartar os resíduos líquidos descontaminado.
- Elimine todos os equipamentos de proteção e resíduos de plástico em um recipiente de risco biológico como instruído por diretrizes institucionais. Decontaminate qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus usando 10% de alvejante.
2. Cirurgia
- Prepare a área cirúrgica através da colocação de papel absorvente banco sob o aparelho estereotáxico e em um espaço adjacente designada como uma área de manipulação de vírus específico.
- Coloque um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área de controle de vírus dedicado perto do aparelho cirúrgico.
- Induzir um nível constante de anestesia e preparar o rato para a cirurgia.
- Colocar o rato dentro de uma câmara de indução que contém uma mistura de gás isofluorano (gama de 1 a 3%) e de oxigénio (100% a cerca de 1 l / min) até que haja uma perda de consciência e falta de movimento intencional bruto. Manter a anestesia de isoflurano durante o procedimento cirúrgico.
- Após 6 anestesia profunda é atingida, raspar o rato a partir de entre os olhos para um pouco atrás das orelhas.
- Coloque o rato de volta para a câmara de indução para umadicional 1-3 min.
- Certifique-se de que o sistema de anestesia isoflurano está ligado ao cone de nariz da cirurgia estereotáxica. Abrir a torneira de passagem no tubo de isoflurano para iniciar o fluxo de isoflurano para o stereotax. Manter o isoflurano e oxigênio nos níveis acima especificados.
- Coloque o rato em um aparelho estereotáxico, assegurando a boca para a barra de mordida e garantir os bares de ouvido.
- Aplique lubrificante ocular para os olhos e betadine ao local cirúrgico antes da incisão.
- Adicione uma incisão na linha média 2,4 centímetros da pele na superfície dorsal do crânio começando cerca de 2 mm caudal para os olhos. Retrair a pele para expor o crânio. Periodicamente incutir 0,9% de solução salina estéril nas margens do sítio cirúrgico para evitar tecidos de secagem.
- Tecido membranoso claro desde o crânio até bregma e lambda são claramente visíveis.
- Certifique-se de que o crânio é nível medindo as coordenadas dorso-ventral embregma e a lambda. Ajuste o dispositivo estereotáxico de acordo até coordenadas dorso-ventral na bregma e lambda diferem por não mais de 0,04 mm.
- Neste momento, reduzir o gás isoflurano para entre 2 e 2,5%.
- Retorne a broca para bregma, Rezero as coordenadas e depois mover a broca para a desejada medial-lateral e ântero-posterior de coordenadas.
- Perfurar um furo na parte de coordenadas usando uma broca de 0,9 milímetros, uma vez que produz um orifício de tamanho apropriado para uma infusão de 28 g de uma seringa.
- Definir a bomba de infusão para distribuir o vírus, a uma taxa de 0,2 mL / min. Colocar a seringa no braço do dispositivo estereotáxico infusão e diminuir a seringa no desejado de coordenadas. Fornecer a quantidade desejada de vírus (gama 0,1-0,8 uL). Por exemplo, proporcionar 0,8 ul de AAV ao longo de 4 min.
Nota: realizar estudos piloto para determinar o volume ideal de infusão e a propagação típica de vírus em cada região de interesse.- Após a entrega do vírus é complete deixar a seringa no lugar durante 10 minutos para evitar o refluxo para o tracto da agulha. Lentamente levantar a seringa a uma taxa de cerca de 5 mm / min. Repita até que todas as coordenadas foram infundidos com AAV.
- Fechar a ferida usando grampos cirúrgicos e casaco a ferida com pomada antibiótica tópica.
- Siga as orientações institucionais para o manejo da dor pós-operatória.
- Colocar o rato em uma gaiola com cama, uma tampa e sinalização adequada e retornar o rato para a instalação para animais.
- Se trabalhar sob BSL-2 precauções, recolher roupas de cama para a quantidade de tempo (geralmente 48-72 horas) especificado por diretrizes institucionais. Coloque roupas de cama em um recipiente de resíduos de risco biológico.
- Elimine todos os materiais contaminados com AAV, tal como especificado pelas diretrizes para a sua eliminação segura.
3. Aparelho Comportamental
Nota: O aparelho de pré-condicionamento sensorial composto por um condicionamento operante padrão Chamber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) com um piso de grade de aço inoxidável, duas paredes laterais de acrílico e duas paredes de metal.
- Montar um 2,8 W luz sobre uma das paredes de alumínio para servir como a luz da casa e como o estímulo visual quando brilhou a 2 Hz. Montar um alto-falante na câmara para entregar os estímulos auditivos (a 10 seg, 1500 Hz, 78 dB e um tom puro 10 seg 78 dB de ruído branco).
- Use um comedouro para entregar 45 mg pelotas do alimento para o copo do alimento. Dentro do copo do alimento, fotocélulas infravermelhos detectar o tempo total gasto no copo do alimento antes, durante e após as apresentações dos estímulos e recompensas alimentares.
- Casa das câmaras em armários de atenuação de som (22 "W x 22" H x 16 "D) equipados com exaustores (~ 68 dB).
- Use um computador PC com software Med Associates para controlar a câmara operante e adquirir os dados. Durante as sessões Condicionado, recolher dados sobre o tempo total gasto com a cabeça no copo do alimento durante presentação do estímulo de luz (5 seg época) e durante a apresentação da recompensa alimentar (5 seg época). Durante a sessão de teste, recolher dados sobre o tempo total gasto no copo do alimento em resposta a apresentações dos estímulos auditivos (10 seg época início, quando os estímulos auditivos são terminadas).
4. Visão geral da Pré-condicionamento sensorial Paradigm
- Após a recuperação da cirurgia, gradualmente restringir comida os ratos a 85% do seu peso corporal alimentar livre. Consulte o pessoal veterinário para um paradigma de restrição alimentar adequado.
Nota: O 3-fase paradigma de pré-condicionamento sensorial está ilustrado na Figura 2. - Sessões de pré-condicionamento (fase 1; Diariamente sessões de treinamento mínimo de 64 conduzida por 4 dias consecutivos):
- Ratos presentes com 12 ensaios misturados que consistem em entrega de estímulos auditivos e visuais. Incluir intervalos inter-julgamento que média de 4,5 min (intervalo de 4,0 a 5,0 min) depois de cada umapresentação uditory.
- Em 6 dos ensaios, presente um tom (de estímulo pré-condicionado) para 10 seg, seguido imediatamente por uma apresentação de 5 segundos a luz intermitente de estímulo.
- Nos outros 6 ensaios, apresentar o ruído branco (estímulo não pareado) sozinho por 10 s.
- Sessões de condicionamento (Fase 2; diário sessões de treinamento mínimo de 64 realizados por 5 dias consecutivos):
- Presente ratos com oito ensaios que consistem de entrega do estímulo visual (a luz intermitente de estímulo) durante 5 segundos imediatamente seguido por entrega de dois pellets de alimentos 45 mg. Incluir intervalos inter-julgamento que média 7 min (intervalo de 6,0 a 8,0 min) depois de cada tentativa. Ocasionalmente ratos necessitam de mais de 5 sessões de condicionamento que aprender a associação comida leve.
- Teste de Sessão (Fase 3; uma única sessão de 78 min):
- Apresentar os ratos com 12 ensaios misturados que consistem de entrega dos estímulos auditivos sozinho. Incluir intervalos inter-julgamento que AVEraiva 4,5 min (intervalo de 4,0 a 5,0 min) após cada apresentação auditiva.
- Em 6 dos ensaios, apresentar o estímulo tom (o estímulo pré-condicionados) sozinho por 10 s.
- Nos outros 6 ensaios, apresentar o ruído branco (o estímulo não pareado) sozinho por 10 s.
- Contrabalançar os estímulos ao completar o estudo com uma segunda série de ratos que recebem o ruído branco como o estímulo pré-condicionado eo tom como o estímulo não pareado.
5. farmacológica e comportamental Procedimento
- Ligue a energia para o aparelho comportamental e carregar o código Med-PC para a sessão comportamental adequado. Fios e programar o aparelho comportamental de tal modo que os fãs que são montados nos armários de som atenuando ligar quando o poder está ligado.
- Para preparar um / ml solução 1 mg de clozapina N-óxido (CNO), pesar 5,0 mg de CNO em um tubo de 15 ml e adicionar 5 ml de água estéril ou 5 ml de 0,9% estéril saline. Vortex até que a solução é clara.
- Se a CNO não se dissolve em solução ou se soluções mais concentradas de CNO são desejado adicionar um agente solubilizante, tal como DMSO 23. Especificamente, para preparar uma solução 1 mg / ml de CNO com 0,5% de DMSO, pesar 5,0 mg de CNO e adicionar 25 ul de DMSO para um tubo de 15 ml. Flick suavemente assegurar que o conteúdo permaneça na base do tubo. Quando a solução torna-se claro, adicionar 5 ml de água estéril ou 5 ml de solução salina estéril a 0,9%. Mais informações sobre a preparação de soluções de CNO estão disponíveis na página do recurso DREADD wiki 25.
- Prepara-se uma nova solução CNO cada dia em que é administrada.
- Injectar o CNO intraperitonealmente a uma dose de 1 mg / kg, aproximadamente, 30 minutos antes do teste comportamental. Por exemplo, injectar uma ratazana de 200 g, com 0,2 ml da solução de CNO 1 mg / ml. O curso dose e do tempo de administração CNO foram selecionados com base em relatórios publicados anteriormente 2,12.
- Injectar CNO 30 minutos antes de cada sessão de pré-condicionamento (Fase 1; total de 4 dias de injecções) administrar o veículo, mas antes de todas as sessões subsequentes comportamentais.
- Depois de 30 minutos, colocar os ratos dentro das câmaras de ensaio de comportamento e iniciar o código de computador para a sessão de comportamento apropriado.
- Após a conclusão da tarefa comportamental, retire imediatamente os ratos das câmaras e retornar os ratos para a colônia animal.
6. As análises dos dados comportamentais
Nota: A variável dependente para todas as sessões de comportamento é a quantidade de tempo que a cabeça do rato está dentro do copo do alimento, como detectado pela interrupção das fotocélulas infravermelhos no copo do alimento. Os dados (em segundos) são recolhidos e registados pelo software de computador.
- Não conduzir análises sobre os dados gerados durante a fase de pré-condicionamento.
- Para as sessões de condicionamento: analisar a cada um dos ratosbilidade de aprender a associação alimentos leves, comparando o comportamento copo do alimento durante a apresentação do estímulo visual entre os 5 sessões comportamentais. Especificamente, calcule o tempo médio gasto no copo do alimento durante a época luz 5 segundos para cada um dos oito ensaios / sessão (ou seja, uma média de oito ensaios que são cada 5 segundos de duração / rato). Compare controlo média e os valores experimentais para cada um dos cinco sessões por dia (ver Figura 3A).
- Analisar a motivação dos ratos para obter recompensa alimentar, comparando o comportamento copo do alimento durante a entrega da recompensa alimentar (5 seg época) entre os cinco sessões comportamentais usando o mesmo cálculo, conforme especificado para a 5 seg luz época acima. Estes valores irão ser consistentemente mais elevados do que aqueles adquiridos durante a apresentação do estímulo visual (ver Figura 3B).
- Para a sessão de testes: calcular um rácio de discriminação que descreve o comportamento copo do alimento dos ratos em resposta a presentations de cada estímulo auditivo.
- Especificamente, para cada rato, dividir o tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações do estímulo sensorial pré-condicionado (ou seja, o tom) pela soma do tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações da estímulo sensorial pré-condicionada (isto é, o tom de estímulo) mais a média do tempo total gasto no copo do alimento após cada uma das seis formas de apresentação do estímulo não emparelhado (isto é, o estímulo de ruído branco). Cada epoch é de 10 seg de duração.
Nota: A pontuação de discriminação de 0,5 ou superior demonstra que os ratos aprenderam as associações inerentes ao paradigma pré-condicionamento sensorial.
- Especificamente, para cada rato, dividir o tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações do estímulo sensorial pré-condicionado (ou seja, o tom) pela soma do tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações da estímulo sensorial pré-condicionada (isto é, o tom de estímulo) mais a média do tempo total gasto no copo do alimento após cada uma das seis formas de apresentação do estímulo não emparelhado (isto é, o estímulo de ruído branco). Cada epoch é de 10 seg de duração.
7. Verificação de AAV Colocação e Expressão
- Anestesiar e perfundir os ratos transcardialmente usando 4% de paraformaldeído. Devido à utilização de marcadores fluorescentes, não exceder um tempo pós-fixação de 2 horas a minimize perda de antigenicidade e para preservar o sinal fluorescente.
- Desidratar cérebros perfundidos, transferindo-os para um frasco de cérebro contendo 30 ml de uma solução de sacarose a 20% em solução salina de fosfato tamponada (1x) para um mínimo de 2 dias, ou até que o cérebro afunda para o fundo do frasco cérebro.
- Usar um micrótomo deslizante congelamento para fazer secções cerebrais coronais (20-40 um) ao longo de toda a extensão rostro-caudal da região de interesse.
- Realizar imunohistoquímica dirigidos contra o receptor com etiquetas ou a proteína repórter para determinar a localização e a expressão do receptor de design e / ou repórter 12. Um protocolo de coloração imuno-histoquímica é fornecido na página de recursos DREADD wiki 25.
- Monte as secções em lâminas SuperFrost-plus e lamela usando 100-200 mL de um meio de montagem aquoso.
- Realizar a microscopia de fluorescência em tecido cerebral para verificar o posicionamento de AAV e a expressão da proteína 12,24.
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Representative Results
Os resultados comportamentais
Após a conclusão da experiência, a eficácia da inactivação temporária específica da região deve ser avaliada quantitativamente e qualitativamente. O presente exemplo envolve uma fase paradigma comportamental-3 (pré-condicionamento sensorial), em que a CNO foi administrada para atenuar a actividade neural no RSC durante as sessões de pré-condicionamento para testar a hipótese de que o CER é necessário para a formação de associações entre estímulos neutro 12. Importante, experimentadores não estão limitados ao paradigma comportamental ou delineamento experimental aqui descrito como a abordagem farmacogenética pode ser acoplado com a maioria dos paradigmas comportamentais.
Considerando que as análises não são tipicamente realizadas em dados gerados durante as sessões de pré-condicionamento (Fase 1), é importante para se quantificar os ratos aprenderam a associação luz comida durante as sessões de condicionamento (fase 2). Como se mostra na Fifigura 3A, tanto experimentais (Expt) e Control (Ctrl) ratos demonstram crescente comportamento copo do alimento durante as apresentações do estímulo luminoso (Figura 3A), indicando que os ratos adquiriu uma associação pavloviana entre o estímulo visual (luz) ea recompensa alimentar. Além disso, ambos os grupos demonstram crescente comportamento copo do alimento durante a apresentação da recompensa alimentar (Figura 3B), indicando a motivação equivalente a obter uma recompensa. Durante a sessão de teste crítico, quando os estímulos auditivos são apresentados na ausência de outros estímulos, os ratos de controlo têm uma pontuação discriminação que é significativamente diferente de ratos experimentais (Figura 3C). A inspecção visual do gráfico revela que a proporção média de discriminação de ratos de controlo é maior do que 0,5, o que indica uma maior copo comportamento alimentar em resposta à apresentação do estímulo auditivo que foi emparelhado com a luz (durante a pré-condicionamento), em comparação com a sua taça alimentoscomportamento em resposta a apresentações do estímulo auditivo que foi desemparelhados (durante a Pré-condicionamento). Em contraste, os ratos experimentais não conseguem demonstrar uma pontuação de diferença que é acima do acaso. Assim, Figura 3C demonstra que controle, mas não ratos experimentais mostraram o efeito de pré-condicionamento sensorial.
Verificação de Colocação AAV
Após a conclusão do teste comportamental, analisar o tecido cerebral de ratos para a colocação e expressão do receptor de projetista correta. Conduta 12,25 imunohistoquímica usando anticorpos primários dirigidos contra um receptor de marcação (por exemplo, um anticorpo primário anti-HA) ou o repórter fluorescente (neste exemplo, mcitrine que é detectada por um anticorpo a Proteína Fluorescente Verde (GFP)). Um diagrama esquemático de uma secção coronal através do cérebro de rato é mostrada na Figura 4A. A Figura 4B ilustra a imunodetecção fluorescente robusta do prot repórter. ein na RSC em um rato experimental representativa sem a etiqueta fluorescente detectada em regiões vizinhas Figuras 4C - D ilustram marcação fluorescente representante de proteínas repórter em experimental (Experimento; ratos foram infundidos com uma construção de AAV contendo o gene do receptor de designer eo gene mcitrine ) e de controlo (Ctrl; ratos foram infundidos com uma construção semelhante de AAV contendo o gene da GFP, mas não para o receptor de sequência designer) ratos, respectivamente. Níveis de receptores também podem ser exibidos como mínimo, representativo e expressão máxima 24. Se for detectada a rotulagem em regiões fora da área de interesse, excluir esses dados das análises de comportamento.
Figura 1:. Diagrama esquemático da construção de AAV Um diagrama do hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV usado para express o receptor desenhista inibitória (hM4Di) sob um promotor de sinapsina neuronal específica (hSyn) em neurônios RSC. Repórteres imunofluorescente (HA-tag e / ou mcitrine) pode ser utilizado para visualizar a expressão da proteína repórter e, respectivamente. hSyn, promotor de sinapsina humana; especifica expressão nos neurônios. HA, tag hemaglutinina; esta etiqueta é fundido com o receptor de designer e serve como um marcador de epítopo permite a detecção de expressão do receptor. hM4Di, o gene para o receptor acoplado desenhador inibidora da proteína G. IRES, entrada site ribossoma; permite que o repórter (mcitrine) a ser traduzido. mcitrine, um repórter fluorescente que é uma variante da GFP, mas é mais resistente a fotobranqueamento.
Figura 2: Diagrama esquemático do paradigma pré-condicionamento sensorial (A) Durante o pré-condicionamento sess.íons, 12 ensaios misturados são apresentados. Durante seis dos ensaios, um estímulo auditivo é apresentado por 10 s, seguido imediatamente por um piscar de estímulo casa de luz (2 Hz, durante 5 seg). Durante os outros 6 ensaios, um segundo estímulo auditivo é apresentada sem um estímulo visual. (B) Durante as sessões de condicionamento, o estímulo visual anteriormente emparelhado está emparelhado com recompensa alimentar. (C) Durante a sessão de teste, há 12 apresentações misturados dos dois estímulos auditivos na ausência de estímulos visuais ou alimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Resultados comportamentais Média copo do alimento de responder durante a (A) Luz e (b) épocas Food dutocar as sessões Condicionado (fase 2). Os dados foram analisados por meio de medidas repetidas análise de variância. ratios (C) discriminação durante a sessão de Test (Fase 3). A linha a tracejado indica quantidades iguais de ar copo do alimento que respondem a cada estímulo auditivo (isto é, sem pré-condicionamento sensorial) Os dados foram analisados utilizando amostras independentes t-teste. Expt; ratos experimentais (n = 17) com infusão de uma construção de AAV contendo a sequência de DNA para o receptor inibidor de proteína G acoplado Designer (hM4Di) e a sequência de ADN para um repórter fluorescente (mcitrine). Ctrl; os ratos de controlo (n = 6) com infusão de veículo administrado hM4Di e combinados com os ratos de controlo (n = 4) infundidos com um vírus de AAV que não contém o receptor designer e que foram administrados CNO. Os grupos de controlo não diferiram significativamente umas das outras (p> 0,05). As barras de erro representam ± SEM.
Figura 4: verificação histológica da expressão da proteína (A) um esquema que ilustra a localização da RSC em uma secção coronal através do cérebro de rato.. (B) Imagens representativas de tecido de cérebro de rato imuno-histoquimicamente marcado de um rato experimental (Exp) que foi infundido com uma construção de AAV contendo a sequência de DNA para o receptor desenhador acoplado à proteína G inibidora (hM4Di) e a sequência de ADN para um repórter fluorescente ( mcitrine). mcitrine é uma variante altamente resistente ao desbotamento da proteína verde fluorescente. (C) Imagem representativa de um rato experimental que ilustra a localização do marcador repórter fluorescente (mcitrine). (D) Imagem representativa de um rato de controlo (Ctrl) com infusão de uma construção de AAV contendo a sequência de ADN para um repórter fluorescente (GFP melhorado). Barras de escala: B, 500 mm; C e D, 10081;. M Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve como aplicar uma abordagem farmacogenética (DREADD) para investigar como uma região específica do cérebro contribui para uma tarefa de aprendizagem complexo multi-fase. Com a capacidade de silenciar temporariamente e remotamente a atividade neural em regiões cerebrais distintas em toda as fases de aprendizagem, essa combinação de abordagens fornece uma plataforma para investigar uma ampla gama de comportamentos, incluindo formas mais sutis ou mascarados de aprendizagem. No exemplo descrito neste protocolo, ratos de controlo e ratos que expressam o receptor do desenhador no córtex retroesplenial (RSC) foram testados em uma tarefa comportamental 3-fase 12. A primeira fase da tarefa envolvida apresentação de múltiplos estímulos neutros com a suposição de que controlam ratos iria adquirir uma associação estímulo-estímulo entre dois dos estímulos. A hipótese de trabalho é que RSC é necessária para a aprendizagem estímulo-estímulo, assim, em cada um dos 4 dias de condicionamento, 30 minutos antes do início do teste comportamentaling, controle e ratos experimentais receberam a administração sistêmica de qualquer droga designer (CNO) ou veículo. Quando ligado ao receptor desenhador, CNO reduz a actividade de neurónios em que o receptor que é expresso. Durante as fases restantes do condicionamento comportamental e testes, quando a RSC não é a hipótese de influenciar a aprendizagem, a CNO não foi administrada e, portanto, a atividade neural não foi perturbado.
Passos críticos dentro do Protocolo
Manuseio seguro de compostos de AAV: Os procedimentos cirúrgicos envolvidos na abordagem farmacogenética não são tecnicamente mais exigente do que uma infusão estereotáxica simples, no entanto, o uso de AAV em algumas instituições exige que experimentadores aderir a BSL-2 precauções. É fundamental que os investigadores seguem as diretrizes estabelecidas pelos Centros de Controle de Doenças, agências de fomento, instituições de origem e de outras comissões de supervisão específicas para o seu programa de investigação. Informações sobre the manipulação segura de AAVs está prontamente disponível 13.
Preparação e administração da droga designer: CNO, a droga desenhista, liga-se ao receptor designer e silencia atividade neural mas de resto é biologicamente inerte 1,3. Os embarques de CNO de fornecedores podem variar em consistência. O composto deve chegar como um pó que não é aderida aos lados do recipiente.
Grupos de controlo importantes a considerar: Para controlar os efeitos não específicos da droga desenhista, antes do teste comportamental, infundir um conjunto diferente de ratos experimentais (ou seja, aqueles que expressam o receptor designer) com injeções de veículo em vez de CNO. Além disso, para controlar os efeitos não-específicos do receptor desenhador incluem um grupo de ratos que são infundidos com um vírus de controlo que contém um repórter fluorescente, mas não o receptor desenhador modificado e injectar estes ratos com a droga de design (isto é, CNO) . Ensure delineamento experimental adequado contrabalançando entre os grupos.
Verificando a expressão da construção: Há um número de maneiras de maximizar a expressão e detecção do receptor do desenhador. Antes da perfusão, verifique se o título viral está próximo 10 12 partículas / ml. Muitas vezes, a visualização do repórter fluorescente é baixa e, portanto, é recomendável que a imunohistoquímica ser realizado na região de interesse, utilizando anticorpos dirigidos contra o repórter (s) incluído na construção viral 25. Neste exemplo, a imunorreactividade de anti-GFP fornece um sinal robusto (Figuras 4B - D). É importante, por causa da natureza de marcadores fluorescentes, limitar o comprimento de tempo de fixação a 2 horas.
Vantagens das técnicas
Uma vez que a construção virai foi entregue ao cérebro por meio de cirurgia estereotáxica, a abordagem farmacogenética permite a inacti temporáriação da actividade do cérebro em regiões discretas por meio de uma injecção sistémica minimamente invasivo da droga desenhador. A administração do medicamento pode ocorrer várias vezes, o que é vantajoso para as tarefas comportamentais que ocorrem em dias sucessivos ou semanas 12,24,26. Além disso, as evidências indicam que a droga designer (CNO) não interfere com o comportamento locomotor ou apetite 27,28. Assim, o método proporciona a oportunidade para atenuar a actividade neuronal durante um curto período de tempo (2-5 horas), evitando ao mesmo tempo os estressores inerentes em outros métodos de inactivação temporária. Especificamente, em estudos de canulação, a inactivação temporária é conseguido por entrega de neurotoxinas através de cânulas que estão permanentemente fixadas no crânio. Esta abordagem é limitada pelo facto de manter a cânula livre de detritos e protegida é um desafio. Além disso, para induzir a inactividade, os animais são tratados extensivamente (para administrar a toxina através das cânulas) imediatamente antes do ensaio comportamental, WHICH impõe pressão sobre o animal e também aumenta a probabilidade de que as cânulas pode desalojar do crânio. Dado que os efeitos de CNO são de duração relativamente curta, a possibilidade de mecanismos compensatórios longo prazo (tais como os observados após lesões permanentes ou em ratinhos geneticamente modificados) são minimizados 29,30.
Limitações das técnicas
DREADD é um método relativamente novo de forma não invasiva atenuando a atividade neuronal. Como tal, os experimentadores podem estar inclinados a verificar de forma independente que silenciamento neuronal ocorre na sua preparação. A verificação pode ser realizada utilizando abordagens electrofisiológicas, mas estas experiências são demorados, dispendiosos e requerem conhecimento específico. Além disso, enquanto que as técnicas chemogenetic são menos dispendiosos do que Optogenetics, a abordagem é mais caro do que o tradicional inactivação com agentes farmacológicos, tais como a TTX. Outra limitação da abordagem DREADD é que infusião das construções virais não resulta em 100% de infecção de neurónios na região de interesse, nem a inactivação por meio de CNO levar à redução de 100% da actividade neuronal. Por fim, alguns serotipos do AAV pode ser transportado retrogradamente o que pode complicar a interpretação dos resultados experimentais 2.
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Acknowledgments
Agradecemos aos autores de Robinson et al. 12, para suas contribuições para o manuscrito do qual este protocolo é parcialmente derivado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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