Abstract
Este protocolo describe cómo temporalmente y de forma remota silenciar la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras que los animales están involucrados en tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Diseñador-Receptores-exclusiva-Activado por Designer-Drogas) con un paradigma de comportamiento (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre diferentes formas de aprendizaje. Específicamente, la entrega mediada por virus se utiliza para expresar un receptor de proteína G inhibitoria modificado genéticamente acoplado (el diseñador del receptor) en una región del cerebro discreta en el roedor. Tres semanas más tarde, cuando los niveles de expresión del receptor de diseñador son altos, un agente farmacológico (el diseñador de Drogas) se administra sistémicamente 30 min antes de una sesión de comportamiento específico. El fármaco tiene afinidad por el receptor diseñador y por lo tanto resulta en la inhibición de las neuronas que expresan el receptor diseñador, pero es de otra manera biológicamente inerte. La región del cerebro permanece silenciada durante 2-5 horas (Depending de la dosis y vía de administración). Al finalizar el paradigma de comportamiento, el tejido cerebral se evaluó para la colocación correcta y la expresión del receptor. Este enfoque es particularmente útil para determinar la contribución de las regiones cerebrales individuales a componentes específicos de comportamiento y puede ser utilizado a través de cualquier número de paradigmas de comportamiento.
Introduction
Un reto apasionante en el campo de la neurociencia conductual es determinar los sustratos neurales de comportamientos complejos. Un número de técnicas tales como lesiones permanentes, la inactivación cerebral temporal a través de cánulas e implantes optogenética se han empleado para identificar las contribuciones de regiones discretas del cerebro a subcomponentes de comportamientos complejos. Si bien estos enfoques informan a nuestra comprensión de la especificidad regional durante el aprendizaje, cada técnica no es sin limitaciones. Específicamente, las lesiones permanentes suelen realizarse antes de las pruebas de comportamiento, por lo tanto sus efectos están presentes durante toda la duración del paradigma. Estudios de canulación que implican la presentación de un inactivador neural a corto plazo (por ejemplo, la tetrodotoxina) puede producir un daño sustancial al tejido cerebral y pueden inducir estrés en sujetos justo antes de las pruebas de comportamiento. Además, la inactivación a través de la canulación se limita a la región de tejido que rodea lapunta de la cánula. Por último, mientras que la optogenética ofrece una gama de flexibilidad para el control temporal de la actividad en regiones específicas del cerebro, es un costo prohibitivo y técnicamente exigente.
Estas limitaciones pueden ser superadas mediante un enfoque de farmacogenética (diseño-Receptores-exclusiva-Activado por Diseñador-Drogas, DREADDs) 1,2. Es importante destacar que, mientras que el concepto de la farmacogenética es sofisticada, la ejecución de la técnica es sencilla. Similar a los métodos quirúrgicos estereotáxicas tradicionales que implican la infusión de la toxina (por ejemplo, NMDA, ácido iboténico) en regiones discretas del cerebro, esta técnica implica la infusión de un virus adeno-asociado (AAV) que contiene un fragmento de ADN para un receptor de proteína G inhibitoria modificado acoplado (hM4Di; el receptor de diseñador) en la región de interés de los roedores de laboratorio estándares (véase la Figura 1). El vector viral también contiene un indicador fluorescente (mcitrine). Una vez incorporado ena las células, el receptor de diseñador (y proteína indicadora) se expresan al máximo ~ 3 semanas después de la infusión y se pueden activar selectivamente para 2-5 hr por la administración sistémica de la droga de diseño de otra manera biológicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) 1 , 3. Debido a que el experimentador está dotado de control temporal preciso, todavía remoto a través de la actividad neural en regiones específicas del cerebro, la farmacogenética combina particularmente bien con los paradigmas de comportamiento que se llevan a cabo en múltiples fases. En este ejemplo, la contribución de la corteza retroesplenial (RSC) al estímulo-estímulo de aprendizaje se compara con su papel en el aprendizaje pavloviano, sin embargo esta combinación de enfoques se adapta bien a cualquier número de preguntas que tratan de identificar la forma específica las regiones del cerebro contribuyen a comportamiento complejo.
Además, mientras que no se describe en el presente protocolo, los enfoques virales y transgénicos se pueden utilizar para lograr tipo de células específicas DREADD expresión 2. Como is inherente a paradigmas conductuales que implican tipos farmacológicos y / o de otro tipo de manipulaciones experimentales, una cuidadosa consideración de diseño experimental y el análisis cuantitativo posterior se requiere cuando se emplea el enfoque DREADD. Los experimentadores nuevos al enfoque DREADD se hace referencia a una revisión exhaustiva de la tecnología actual DREADD 2.
Cada día, los organismos aprenden acerca de nuevos estímulos y eventos y sus relaciones entre sí. Incluso en un ambiente familiar, tales como el hogar, uno es rápida para detectar alteraciones en las relaciones entre los estímulos debido a que estos cambios pueden ser predictivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (es decir, relacional) aprendizaje implica la conjunción de múltiples estímulos y tradicionalmente se ha asociado con el hipocampo, que reside centralmente dentro del lóbulo temporal medial 4. Sin embargo, no existe el hipocampo ni actuar de manera aislada; regiones corticales, tanto dentro como fueralado del lóbulo temporal medial proporcionar información sensorial crítica para la formación del hipocampo 5-7. Los estudios tradicionales de lesiones permanentes proporcionan evidencia convincente para la participación de un número de regiones corticales (por ejemplo, las cortezas retrosplenial, postrhinal y entorrinal) en el aprendizaje dependiente del hipocampo, pero están limitados en su capacidad de discernir el papel de una región en particular durante las fases discretas de aprendizaje 8-10.
El presente protocolo pone a prueba la hipótesis de que la RSC es necesaria para el aprendizaje estímulo-estímulo por silenciar a la RSC en una sola fase de un 3-fase paradigma precondicionamiento sensorial 11,12. Brevemente, las ratas reciben infusiones de un AAV que contiene el receptor diseñador y ~ 3 semanas más tarde se administró el fármaco de diseño (CNO) 30 min antes del inicio de las pruebas de comportamiento. En el presente protocolo, las ratas experimentales reciben CNO durante la primera fase de pruebas (cuando lear estímulo-estímuloción se produce) y reciben vehículo durante los próximos 2 fases de pruebas. Para controlar los efectos involuntarios de CNO en el comportamiento, infundir ratas con el receptor de diseñador (hM4Di) e inyectar con vehículo en lugar de CNO. Para tener en cuenta los efectos generales de infusión viral y la expresión del receptor, infundir un virus de control que no contiene el receptor de diseñador y administrar CNO.
Un número de diferentes serotipos de AAV se utilizan para entregar material genético. Las directrices actuales de los NIH para la investigación con recombinante o moléculas sintéticas que mantiene AAV (todos los serotipos) y constructos de AAV recombinantes o sintéticos, en la que el transgén no codifica ya sea un producto génico potencialmente tumorigénicos o una molécula de toxina y se producen en la ausencia de una virus auxiliar, requiere BSL-1 Precauciones (Grupo Apéndice B-1. Riesgo 1 (RG1) Agentes) 13. Un número de comentarios relativos a la estructura de AAV, utilidad y seguridad están disponibles 14,15. Cabe destacar que, aunque, Debido a las preocupaciones relativas a posibles 16,17 y potenciales mecanismos carcinogénicos reproductivos 18-20 en roedores, algunas instituciones requieren el uso de BSL-2 precauciones cuando se trabaja con AAV. Verifique la BSL apropiado antes de su uso mediante la consulta con los comités de supervisión de las instituciones individuales en los que la investigación se llevó a cabo, los Centros para el Control de Enfermedades y las directrices del NIH para investigaciones con ADN recombinante Moléculas 13 cuando se usan vectores virales para la manipulación de genes en los Estados Unidos. De protección personal, de formación investigadora, vector de contención, descontaminación, eliminación de materiales descontaminados, y después de la inyección de animales necesidades de vivienda son especificados por estas directrices. Además, consulte y siga apropiada Institucional Cuidado de Animales y utilizar las directrices del comité o directrices del comité de supervisión institucionales equivalentes para asegurar la manipulación, administración y disposición de AAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El uso de animales son aprobados por el Oberlin College Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión y están de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 21.
1. Preparación para la Infusión Viral
Nota: Este protocolo utiliza BSL-1 precauciones. Cuando se emplea BSL-2 precauciones, una bata de laboratorio desechable, guantes, cubiertas para zapatos, protecciones oculares y un respirador de partículas (tipo N95) son obligatorios. Todos los individuos de manipulación BSL-2 compuestos deben ser probados para encajar un respirador de partículas por una agencia de salud pública local. Consulte Lowery y Majewska (2010) 22 para obtener más detalles sobre la manipulación y el almacenamiento de los vectores virales.
- Tras el primer uso, alícuota y almacenar virus sin utilizar en 20 tubos de microcentrífuga mu l para evitar la congelación y descongelación repetida.
- Preparar la superficie de trabajo mediante la eliminación de los objetos innecesarios y la esterilización de la superficie con etanol al 70%. Preparar un 1Solución de lejía al 0% para la descontaminación de los residuos de AAV. Coloque un vaso lleno de la solución de lejía y una estéril 10 l jeringa sobre la superficie de trabajo. Coloque el tubo de microcentrífuga con el AAV en un recipiente con hielo picado durante la puesta en marcha.
- Coloque el tubo de microcentrífuga con el virus en un tornillo de banco estándar. Cargar una jeringa de 10 l con al menos 4 l de AAV. Tener cuidado de no doblar la punta de la jeringa contra la parte inferior del tubo de microcentrífuga durante la carga. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en los 4 l de solución de AAV en la jeringa.
- Deseche el tubo de virus vacío en el vaso que contiene 10% de lejía. Almacene las partes no utilizadas del virus como lo especifica el proveedor.
- Añadir adicional de 10% de lejía al contenedor de residuos, y permitir que los residuos que se siente durante 30 minutos antes de disponer los residuos líquidos descontaminado.
- Deseche todo el equipo de protección y los residuos de plástico en un contenedor de riesgo biológico según las instrucciones de las directrices institucionales. Decontaminate cualquier equipo o superficies que estuvieron en contacto con el virus utilizando 10% de lejía.
2. Cirugía
- Prepare el área quirúrgica mediante la colocación de papel absorbente banco bajo el aparato estereotáxico y en un espacio adyacente designada como un área dedicada manipulación de virus.
- Coloque un contenedor de residuos de lejía al 10% en el área de manipulación de virus dedicado cerca del aparato quirúrgico.
- Provocar un nivel constante de anestesia y preparar la rata para la cirugía.
- Coloque la rata en una cámara de inducción que contiene una mezcla de gas isoflurano (intervalo de 1 a 3%) y oxígeno (100% a aproximadamente 1 L / min) hasta que haya una pérdida de la conciencia y la falta de movimiento intencionado bruto. Mantener la anestesia con isoflurano en todo el procedimiento quirúrgico.
- Después se alcanza 6 anestesia profunda, afeitarse la rata de entre los ojos o ligeramente detrás de las orejas.
- Coloque la rata de nuevo en la cámara de inducción para un1-3 min adicional.
- Asegúrese de que el sistema de anestesia con isoflurano está conectado al cono de la nariz de la cirugía estereotáxica. Abra la llave de paso en la tubería de isoflurano para comenzar el flujo de isoflurano al stereotax. Mantener el isoflurano y oxígeno a los niveles especificados anteriormente.
- Coloque la rata en un aparato estereotáxico asegurando la boca sobre la barra bocado y asegurar las barras de oído.
- Aplicar lubricante ocular para los ojos y betadine al sitio quirúrgico antes de la incisión.
- Haga una incisión en la línea media 2,4 cm de la piel en la superficie dorsal del cráneo comenzando aproximadamente 2 mm caudales a los ojos. Retirar la piel para exponer el cráneo. Periódicamente inculcar 0,9% de solución salina estéril estéril en los márgenes de la zona quirúrgica para evitar que los tejidos de secado.
- Tejido membranoso claro desde el cráneo hasta bregma y lambda son claramente visibles.
- Asegúrese de que el cráneo es de nivel mediante la medición de las coordenadas dorsal-ventral enbregma y en lambda. Ajuste el dispositivo estereotáxica en consecuencia hasta coordenadas dorsal-ventral en bregma y lambda difieren en no más de 0,04 mm.
- En este momento, reducir el gas isoflurano a entre 2 y 2,5%.
- Devuelva el taladro para bregma, REZERO las coordenadas y luego mover el taladro para el medio-lateral deseada y anterior-posterior de coordenadas.
- Perforar un agujero en la parte de coordenadas utilizando una broca de 0,9 mm, ya que produce un agujero de tamaño apropiado para una jeringa de infusión 28 G.
- Establecer la bomba de infusión para entregar virus a una tasa de 0,2 l / min. Coloque la jeringa en el brazo de infusión del dispositivo estereotáxico y bajar la jeringa en la coordenada deseada. Entregar la cantidad deseada de virus (oscilar 0,1 a 0,8 l). Por ejemplo, entregar 0,8 l de AAV durante 4 min.
Nota: realizar estudios piloto para determinar el volumen de infusión ideal y la propagación típico de virus en cada región de interés.- Después de la entrega de virus es complete abandonan la jeringa en su lugar durante 10 min para evitar el reflujo en el tracto de la aguja. Lentamente levante la jeringa a una velocidad de alrededor de 5 mm / min. Repita hasta que todas las coordenadas se han infundido con AAV.
- Cierre la herida con grapas quirúrgicas y recubrir la herida con ungüento antibiótico tópico.
- Siga las directrices institucionales para el manejo del dolor postoperatorio.
- Coloque la rata en una jaula con ropa de cama, una tapa y señalización adecuada y volver a la rata a la instalación para animales.
- Si trabaja bajo BSL-2 precauciones, recoger ropa de cama para la cantidad de tiempo (por lo general 48 a 72 h) especificado por las directrices institucionales. Coloque la ropa de cama en un envase para peligros biológicos.
- Deseche todos los materiales de AAV-contaminada como se especifica en las directrices para su eliminación segura.
3. Aparato Behavioral
Nota: El aparato precondicionamiento sensorial consiste en un condicionamiento operante cham estándarber (12 "L x 9.5" W x 11.5 "H) con un suelo de rejilla de acero inoxidable, 2 paredes laterales de plexiglás y 2 paredes metálicas.
- Montar una luz de 2,8 W en una de las paredes de aluminio para servir como la luz de la casa y como estímulo visual cuando brilló a 2 Hz. Montar un altavoz en la cámara para ofrecer los estímulos auditivos (a 10 seg, 1500 Hz, 78 dB tono puro y un dB de ruido blanco 10 seg 78).
- Utilice una tolva de alimentos para entregar 45 bolitas de comida mg en la copa de los alimentos. Dentro de la taza de comida, fotocélulas de infrarrojos detectan el tiempo total empleado en la taza de alimentos antes, durante y después de las presentaciones de los estímulos y recompensas de comida.
- Casa de las cámaras en los gabinetes de atenuar el sonido (22 "W x 22" H x 16 "D) equipadas con ventiladores de escape (~ 68 dB).
- Utilice un ordenador PC con el software Med Associates para controlar la cámara operante y adquirir los datos. Durante las sesiones acondicionado, recoger datos sobre el tiempo total dedicado a la cabeza en la taza de alimentos durante Presentación de la (s época 5) estímulo de luz y durante la presentación de la recompensa de comida (5 seg época). Durante la sesión de prueba, recoger datos sobre el tiempo total empleado en la taza de alimentos en respuesta a las presentaciones de los estímulos auditivos (10 seg época principio, cuando se terminan los estímulos auditivos).
4. Descripción de la sensorial Precondicionamiento Paradigma
- Después de la recuperación de la cirugía, de manera gradual alimentos restringir las ratas a 85% de su peso corporal libre de alimentación. Consulte con el personal veterinario para un paradigma de la restricción de alimentos apropiados.
Nota: El 3-fase paradigma precondicionamiento sensorial se ilustra en la Figura 2. - Precondicionamiento Sesiones (1 Fase; diarias sesiones de entrenamiento 64 min a cabo a través de 4 días consecutivos):
- Ratas presentes con 12 ensayos entremezclados que consisten en la entrega de estímulos auditivos y visuales. Incluya intervalos inter-ensayo que media 4,5 minutos (rango 4,0 a 5,0 min) después de cada unapresentación uditory.
- El 6 de los ensayos, un tono de actualidad (estímulo preacondicionada) durante 10 s, seguido inmediatamente por una presentación de 5 segundos del estímulo luz intermitente.
- En los otros 6 ensayos, presentar el ruido blanco (estímulo no apareado) solo por 10 seg.
- Sesiones acondicionado (Fase 2; Daily sesiones de entrenamiento de 64 minutos realizadas en los 5 días consecutivos):
- Ratas presentes con 8 ensayos que consisten en la entrega del estímulo visual (el estímulo luz intermitente) durante 5 segundos seguidos inmediatamente por la entrega de dos bolitas de comida 45 mg. Incluya intervalos inter-ensayo que la media 7 min (rango 6,0 a 8,0 min) después de cada ensayo. De vez en cuando las ratas requieren más de 5 sesiones de acondicionamiento para aprender la asociación comida ligera.
- Prueba de Sesión (Fase 3; una sola sesión de 78 minutos):
- Presentar las ratas con 12 ensayos entremezclados que consisten en la entrega de los estímulos auditivos solos. Incluya intervalos inter-ensayo que AVErabia 4,5 min (rango 4,0 a 5,0 min) después de cada presentación auditiva.
- En 6 de los ensayos, presentar el estímulo de tono (el estímulo preacondicionado) solo por 10 seg.
- En los otros 6 ensayos, presentar el ruido blanco (el estímulo desapareado) solo por 10 seg.
- Contrarrestar los estímulos al completar el estudio con un segundo conjunto de ratas que reciben el ruido blanco como el estímulo preacondicionado y el tono como el estímulo no apareado.
5. farmacológico y conductual Procedimiento
- Encienda la alimentación del aparato de comportamiento y cargar el código en PC Med para la sesión del comportamiento apropiado. El aparato de comportamiento de alambre y el programa de tal manera que los aficionados que se montan en los gabinetes de atenuación de sonido se encienden cuando la alimentación está encendida.
- Para preparar una solución de 1 mg / ml de la clozapina N-óxido (CNO), pesan 5,0 mg de CNO en un tubo cónico de 15 ml y añadir 5 ml de agua estéril o 5 ml de 0,9% estéril saline. Vortex hasta que la solución es clara.
- Si CNO no se disuelve en la solución o si se desean soluciones más concentradas de CNO añadir un agente solubilizante, tal como DMSO 23. Específicamente, para preparar una solución 1 mg / ml de CNO con 0,5% de DMSO, pesan 5,0 mg de CNO y añadir 25 l de DMSO a un tubo cónico de 15 ml. Flick garantizar suavemente que los contenidos permanecen en la base del tubo. Cuando la solución se vuelve clara, añadir 5 ml de agua estéril o 5 ml de solución salina estéril al 0,9%. Otras instrucciones para la preparación de soluciones de CNO están disponibles en la página de recursos DREADD wiki 25.
- Preparar una nueva solución CNO cada día que se administra.
- Inyectar el CNO por vía intraperitoneal a una dosis de 1 mg / kg aproximadamente 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento. Por ejemplo, inyectar un 200 g rata con 0,2 ml de la solución de 1 mg / ml CNO. El curso de la dosis y tiempo de administración CNO fueron seleccionados sobre la base de los informes publicados previamente 2,12.
- Inyectar CNO 30 min antes de cada sesión de preacondicionamiento (Fase 1, total de 4 días de inyecciones) pero administrar el vehículo antes de todas las sesiones de comportamiento posteriores.
- Después de 30 min, colocar las ratas en las cámaras de las pruebas de comportamiento e iniciar el código de ordenador para la sesión de comportamiento apropiado.
- Sobre la terminación de la tarea de comportamiento, retire inmediatamente las ratas de las cámaras y volver a las ratas a la colonia animal.
6. Análisis de la Conducta de datos
Nota: La variable dependiente para todas las sesiones de comportamiento es la cantidad de tiempo que la cabeza de la rata es el interior de la taza del alimento tal como se detecta por la interrupción de las fotocélulas de infrarrojos en la taza del alimento. Los datos (en segundos) se recogen y registran por el software de ordenador.
- No realizar los análisis en los datos generados durante la fase de acondicionamiento previo.
- Para las sesiones de acondicionamiento: analizar una de cada uno ratasbilidad de aprender la asociación comida ligera comparando el comportamiento de taza de alimentos durante la presentación del estímulo visual a través de las 5 sesiones de comportamiento. En concreto, se calcula el tiempo medio de permanencia en la taza de alimentos durante la época de luz 5 segundos para cada uno de 8 ensayos / sesión (es decir, un promedio de 8 ensayos que son cada 5 segundos de duración / rata). Comparar el control promedio y los valores experimentales para cada uno de 5 sesiones diarias (ver Figura 3A).
- Analizar la motivación de las ratas para obtener recompensa de comida comparando el comportamiento de taza de alimentos durante la entrega del premio de comida (5 seg época) a través de las 5 sesiones de comportamiento utilizando el mismo cálculo como se especifica para la época luz 5 seg arriba. Estos valores serán siempre superiores a las adquiridas durante la presentación del estímulo visual (véase la Figura 3B).
- Para la sesión de prueba: calcular una relación de discriminación que describe el comportamiento de la taza del alimento de las ratas en respuesta a pressentaciones de cada estímulo auditivo.
- En concreto, para cada rata, se divide el tiempo medio de permanencia en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo preacondicionada sensorial (es decir, el tono) por la suma del tiempo medio de permanencia en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo sensorial preacondicionada (es decir, el estímulo de tono) más el promedio del tiempo total empleado en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo no emparejado (es decir, el estímulo de ruido blanco). Cada época es 10 seg de duración.
Nota: Una puntuación de la discriminación de 0.5 o mayor demuestra que las ratas aprendieron las asociaciones inherentes al paradigma precondicionamiento sensorial.
- En concreto, para cada rata, se divide el tiempo medio de permanencia en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo preacondicionada sensorial (es decir, el tono) por la suma del tiempo medio de permanencia en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo sensorial preacondicionada (es decir, el estímulo de tono) más el promedio del tiempo total empleado en la taza después de cada comida de 6 presentaciones del estímulo no emparejado (es decir, el estímulo de ruido blanco). Cada época es 10 seg de duración.
7. Verificación de AAV Colocación y Expresión
- Anestesiar y perfundir las ratas transcardially utilizando paraformaldehído al 4%. Debido al uso de marcadores fluorescentes, no exceda un momento posterior a la fijación de 2 horas a minmizar pérdida de antigenicidad y para preservar la señal fluorescente.
- Deshidratar cerebros perfundidos mediante la transferencia de ellos en un frasco de cerebro que contiene 30 ml de una solución de sacarosa al 20% en solución salina tamponada con fosfato (1x) durante un mínimo de 2 días o hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo de la jarra cerebro.
- Use un micrótomo de deslizamiento congelación para hacer secciones del cerebro coronal (20-40 micras) a lo largo de toda la extensión rostrocaudal de la región de interés.
- Llevar a cabo la inmunohistoquímica dirigido contra el receptor etiquetado o la proteína indicadora para determinar la ubicación y la expresión del receptor diseñador y / o reportero 12. Un protocolo de tinción inmunohistoquímica se proporciona en la página de recursos DREADD wiki 25.
- Montar las secciones en portaobjetos y cubreobjetos-Superfrost además utilizando 100-200 l de un medio de montaje acuoso.
- Realizar microscopía de fluorescencia en el tejido cerebral para verificar la colocación de AAV y expresión de proteínas 12,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultados de la Conducta
Al finalizar el experimento, la eficacia de la inactivación temporal específica de la región debe evaluarse cuantitativamente y cualitativamente. El presente ejemplo consiste en un paradigma 3-fase conductual (precondicionamiento sensorial), en el que se administró CNO para atenuar la actividad neuronal en la RSC durante las sesiones de preacondicionamiento para probar la hipótesis de que la RSC es necesario para la formación de asociaciones entre estímulos neutral 12. Es importante destacar que, los experimentadores no se limitan a el paradigma de comportamiento o diseño experimental descrito en el presente documento como el enfoque de farmacogenética se puede acoplar con la mayoría de los paradigmas de comportamiento.
Considerando que los análisis no se realizan normalmente en los datos generados durante las sesiones de preacondicionamiento (Fase 1), es importante cuantificar si las ratas aprendieron la asociación comida ligera durante las sesiones acondicionado (Fase 2). Como se muestra en Fi3A figura, tanto experimentales (Exp) y Control (Ctrl) ratas demuestran el aumento de la conducta de taza de alimentos durante las presentaciones del estímulo luminoso (Figura 3) que indican que las ratas adquieren una asociación pavloviana entre el estímulo visual (luz) y el premio de comida. Además, ambos grupos demuestran el aumento de comportamiento taza del alimento durante la presentación de la recompensa de comida (Figura 3B) que indica la motivación equivalente a obtener recompensa. Durante la sesión de prueba crítica, cuando los estímulos auditivos se presentan en la ausencia de otros estímulos, las ratas de control tienen una puntuación de discriminación que es significativamente diferente de ratas experimentales (Figura 3C). La inspección visual del gráfico revela que la relación media discriminación de las ratas de control es superior a 0,5, lo que indica un mayor comportamiento de la taza del alimento en respuesta a presentaciones del estímulo auditivo que fue emparejado con la luz (durante Precondicionamiento) en comparación con su taza de la comidacomportamiento en respuesta a presentaciones del estímulo auditivo que se desapareado (durante el preacondicionamiento). En contraste, las ratas experimentales no demuestran una puntuación diferencia de que está por encima de la casualidad. Por lo tanto, la figura 3C demuestra que el control pero no las ratas experimentales mostraron el efecto precondicionamiento sensorial.
Verificación de la Colocación de AAV
A la finalización de las pruebas de comportamiento, analizar el tejido cerebral de rata para la colocación y la expresión del receptor diseñador correcta. Conducta inmunohistoquímica 12,25 utilizando anticuerpos primarios dirigidos contra una etiqueta receptor (por ejemplo, un anticuerpo primario anti-HA) o el reportero fluorescente (en este ejemplo, mcitrine que es detectada por un anticuerpo para la proteína fluorescente verde (GFP)). A esquemática de una sección coronal a través del cerebro de rata se muestra en la figura 4A. La Figura 4B ilustra la inmunodetección fluorescente robusta de la prot reportero. ein en la RSC en una rata experimental representante sin etiqueta fluorescente detectada en las regiones que rodean las figuras 4C - D ilustran marcaje fluorescente representante de proteínas reportero en experimental (Exp; ratas fueron infundidos con una construcción de AAV que contiene el gen del receptor de diseñador y el gen mcitrine ) y control (Ctrl; ratas fueron infundidos con una construcción de AAV similar que contiene el gen de GFP, pero no de secuencia para el receptor diseñador) ratas, respectivamente. Los niveles del receptor también se pueden mostrar como mínimo, representativa y expresión máxima 24. Si se detecta etiquetado en regiones fuera de la zona de interés, excluir a aquellos datos de los análisis de comportamiento.
Figura 1:. Diagrama esquemático de la construcción de AAV Un diagrama de la hsyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine AAV utiliza para expO prima el receptor diseñador inhibitoria (hM4Di) bajo un promotor sinapsina específica neuronal (hsyn) en las neuronas de RSC. Reporteros de inmunofluorescencia (HA-tag y / o mcitrine) se pueden utilizar para visualizar la expresión de la proteína y el reportero, respectivamente. hsyn, promotor sinapsina humana; especifica la expresión en las neuronas. HA, etiqueta de hemaglutinina; esta etiqueta se fusiona con el receptor diseñador y sirve como un epítopo etiqueta que permite la detección de la expresión del receptor. hM4Di, el gen para el receptor acoplado inhibidora diseñador G-proteína. IRES, sitio de entrada del ribosoma interno; permite que el reportero (mcitrine) a traducir. mcitrine, un reportero fluorescente que es una variante de GFP pero es más resistente a photobleaching.
Figura 2: Diagrama esquemático del paradigma precondicionamiento sensorial (A) Durante el preacondicionamiento sess.iones, se presentan 12 ensayos entremezclados. Durante 6 de los ensayos, un estímulo auditivo se presenta durante 10 segundos seguido inmediatamente por un estímulo luminoso casa intermitente (2 Hz, durante 5 segundos). Durante los otros 6 ensayos, un segundo estímulo auditivo se presenta sin un estímulo visual. (B) Durante las sesiones acondicionado, el estímulo visual emparejado anteriormente se empareja con la recompensa de los alimentos. (C) Durante la sesión de prueba, hay 12 presentaciones entremezclados de los dos estímulos auditivos en ausencia de estímulos visuales o alimentos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Resultados conductuales media taza de comida de responder durante el (A) Luz y (B) épocas de comida dutocar las sesiones acondicionado (Fase 2). Los datos fueron analizados usando medidas repetidas análisis de la varianza. ratios (C) Discriminación durante la sesión de prueba (Fase 3). La línea de puntos indica la misma cantidad de la taza del alimento acondicionado que respondieron a cada estímulo auditivo (es decir, sin preacondicionamiento sensorial) Los datos fueron analizados utilizando muestras independientes t-test. Exp; ratas experimentales (n = 17) infundidos con un constructo de AAV que contiene la secuencia de ADN para el receptor inhibidor de proteína G acoplada diseñador (hM4Di) y la secuencia de ADN para un reportero fluorescente (mcitrine). Ctrl; ratas control (n = 6) infundido con hM4Di y el vehículo se administra combinado con las ratas control (n = 4) Con una infusión de un virus AAV que no contiene el receptor de diseñador y que se administraron CNO. Los grupos de control no difirieron significativamente entre sí (p> 0,05). Las barras de error indican ± SEM.
Figura 4: verificación histológica de expresión de la proteína (A) Un diagrama esquemático que ilustra la ubicación de la RSC en una sección coronal a través del cerebro de rata.. (B) Imágenes representativas de tejido cerebral de rata inmunohistoquímicamente marcado de una rata experimental (Expt) que se infunde con un constructo de AAV que contiene la secuencia de ADN para el receptor diseñador acoplado a la proteína G inhibitoria (hM4Di) y la secuencia de ADN para un reportero fluorescente ( mcitrine). mcitrine es una variante altamente resistente a la decoloración de la proteína fluorescente verde. (C) Imagen representativa de una rata experimental que ilustra la ubicación de la etiqueta fluorescente reportero (mcitrine). (D) Imagen Representante de una rata control (Ctrl) infundido con una construcción de AAV que contiene la secuencia de ADN de un reportero fluorescente (GFP mejorada). Las barras de escala: B, 500 micras; C y D, 10081;. M Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo se describe cómo aplicar un enfoque de farmacogenética (DREADD) para investigar cómo una región específica del cerebro contribuye a una tarea de aprendizaje compleja de múltiples fases. Con la capacidad de silenciar temporalmente y de forma remota la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro a través de las fases de aprendizaje, esta combinación de enfoques ofrece una plataforma para investigar una amplia gama de comportamientos, incluyendo las formas más matizadas o enmascarados de aprendizaje. En el ejemplo descrito en este protocolo, el control de ratas y ratones que expresan el receptor de diseño en la corteza retroesplenial (RSC) se probaron en una tarea conductual 3 fases 12. La primera fase de la tarea involucró la presentación de múltiples estímulos neutros, con el supuesto de que controlan ratas adquiriría una asociación estímulo-estímulo entre dos de los estímulos. La hipótesis de trabajo es que RSC es necesaria para el aprendizaje estímulo-estímulo, por lo tanto, en cada uno de 4 días de acondicionamiento, 30 min antes del inicio de la prueba de comportamientoING, control y ratas experimentales se les dio la administración sistémica de cualquiera de la droga de diseño (CNO) o vehículo. Cuando se une al receptor de diseñador, CNO reduce la actividad de las neuronas en las que se expresa ese receptor. Durante las fases restantes de acondicionamiento y las pruebas de comportamiento, cuando la RSC no es la hipótesis de influir en el aprendizaje, CNO no fue administrado y por lo tanto la actividad neuronal no fue perturbada.
Pasos críticos en el Protocolo
Manipulación segura de compuestos AAV: Los procedimientos quirúrgicos que participan en el enfoque de farmacogenética no son más exigentes técnicamente que una simple infusión estereotáxica, sin embargo, el uso de AAV en algunas instituciones requiere que los experimentadores se adhieren a BSL-2 precauciones. Es fundamental que los investigadores siguen los lineamientos establecidos por los Centros para el Control de Enfermedades, agencias de financiamiento, instituciones de origen y otros comités de vigilancia específicos de su programa de investigación. Información sobre ªmanejo seguro e de AAV está fácilmente disponible 13.
Preparación y administración de la droga de diseño: CNO, la droga de diseño, se une al receptor de diseñador y silencios actividad neuronal, pero es otra forma biológicamente inerte 1,3. Los envíos de CNO de los proveedores pueden variar en consistencia. El compuesto debe llegar como un polvo que no se adhiere a los lados del recipiente.
Grupos de control importantes a considerar: Para controlar los efectos no específicos de la droga de diseño, antes de la prueba de comportamiento, infunden un conjunto diferente de ratas experimentales (es decir, las que expresan el receptor de diseñador) con inyecciones de vehículos en lugar de CNO. Además, para controlar para efectos no específicos del receptor de diseñador incluyen un grupo de ratas a las que se infunden con un virus de control que contiene un indicador fluorescente pero no el receptor diseñador modificado e inyectar estas ratas con la droga de diseño (es decir, CNO) . Ensure diseño experimental adecuado por parte de contrapeso entre los grupos.
Verificación de la expresión de la construcción: Hay un número de maneras de maximizar la expresión y la detección del receptor de diseñador. Antes de la infusión, compruebe que el título viral está cerca de 10 12 partículas / ml. A menudo, la visualización de la reportero fluorescente es baja y por lo tanto, se recomienda que la inmunohistoquímica se realiza en la región de interés usando anticuerpos dirigidos contra el reportero (s) incluido en el constructo viral 25. En este ejemplo, la inmunorreactividad anti-GFP proporciona una señal robusta (figuras 4B - D). Es importante destacar que, debido a la naturaleza de las etiquetas fluorescentes, limitar la longitud de tiempo de fijación a 2 hr.
Ventajas de las técnicas
Una vez que el constructo viral ha sido entregado al cerebro a través de la cirugía estereotáxica, el enfoque de farmacogenética permite la inacti temporalvación de la actividad cerebral en regiones discretas por medio de una inyección sistémica mínimamente invasiva de la droga de diseño. La administración del fármaco puede ocurrir varias veces, lo que es ventajoso para tareas de comportamiento que se producen a través de días o semanas 12,24,26 sucesivas. Por otra parte, la evidencia indica que la droga de diseño (CNO) no interfiere con el comportamiento del aparato locomotor o el apetito 27,28. Por lo tanto, el método proporciona la oportunidad de atenuar la actividad neuronal durante un corto período de tiempo (2-5 horas), evitando al mismo tiempo los factores estresantes inherentes a otros métodos de inactivación temporal. Específicamente, en los estudios de canulación, la inactivación temporal se consigue mediante la entrega de neurotoxinas a través de cánulas que están fijados de forma permanente al cráneo. Este enfoque está limitado en que el mantenimiento de la cánula libre de escombros y protegido es un reto. Además, para inducir la inactividad, los animales se manejan ampliamente (para administrar la toxina a través de las cánulas) justo antes de las pruebas de comportamiento, WHIch impone el estrés en el animal y también aumenta la probabilidad de que las cánulas puede desalojar de la calavera. Debido a los efectos de la CNO son relativamente a corto plazo, la posibilidad de mecanismos de compensación a largo plazo (como los que se observan después de lesiones permanentes o en ratones diseñados genéticamente) se minimizan 29,30.
Limitaciones de las Técnicas
DREADD es un método relativamente nuevo de forma no invasiva la atenuación de la actividad neuronal. Como tales experimentadores pueden sentirse inclinados a verificar de forma independiente que el silenciamiento neuronal ocurre en su preparación. La verificación puede llevarse a cabo utilizando métodos electrofisiológicos, pero estos experimentos son mucho tiempo, costoso y requiere conocimientos específicos. Además, mientras que las técnicas chemogenetic son menos costosos que la optogenética, el enfoque es más caro que la inactivación tradicional con agentes farmacológicos tales como TTX. Otra limitación del enfoque DREADD es que infusion de las construcciones virales no da como resultado 100% de infección de las neuronas en la región de interés, ni a través de la inactivación CNO plomo a la reducción de 100% de la actividad neuronal. Por último, algunos serotipos de AAV pueden ser transportados retrogradely que puede complicar la interpretación de los resultados experimentales 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Agradecemos a los autores de Robinson et al. 12 por sus contribuciones al manuscrito del que se deriva parcialmente este protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Male, Long Evans Rats, 55-60 days old | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer drug |
| Rat Cage lid (polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hr post infusion |
| Filter paper (replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table top vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Biohazard trash bags | Staples | 113444 | Medline biohazard liners |
| Biohazard trash can | Amazon.com | United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | |
| Isoflurane, 100 ml | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual small animal stereotaxic with digital display readout console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture ear bars, set of 2 (rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia mask (rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated syringe pump with micro4 controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable ceramic blade clipper kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine skin cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple antiobiotic ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube vet ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite rigid table-top boom stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 G 10 μl syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22' W x 22" H x 16" D |
| Extra tall modular test chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless steel grid floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular pellet dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet receptacle, cup type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head entry detector for rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage speaker for rat chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable audio generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart ctrl 8 input/16 output package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large table-top cabinet and power supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI interface package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core computer pkg with X Pro 19" monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
- Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
- Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
- Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
- Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
- Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
- Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
- Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
- Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
- Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
- Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
- NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
- Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
- Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
- Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
- Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
- National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
- Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
- Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
- wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
- Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
- Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
- Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
- Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
- Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).
