Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Denver Papillae Protokol for objektiv analyse af fungiforme Papillae

doi: 10.3791/52860 Published: June 8, 2015

Summary

Her præsenterer vi en protokol til måling af fungiforme papilla tæthed fra digitale fotografier. Denne metode bygger prioritering og objektive karakteristiske målinger i den oprindelige beskrivende arbejde fungiforme papiller af Miller & Reedy (1990).

Abstract

Målet med Denver Papillae protokollen er at bruge en dikotomisk nøgle til at definere og prioritere de karakteristika fungiforme papiller (FP) for at sikre en ensartet scoring mellem holdrekorder. Denne protokol bygger ud af et behov, der er opstået fra de sidste to årtiers smag forskning ved hjælp af FP som en proxy for smag pore tæthed. FP tæthed har historisk blevet analyseret ved hjælp af Miller & Reedy i 1990 beskrivelser af deres morfologi: rund, farves lysere, store og forhøjet. I dette arbejde, forfatterne advaret, at strengere definitioner af FP morfologi behov for at blive skitseret. På trods af denne opfordring til handling, har opfølgende litteratur været knappe, med de fleste undersøgelser fortsætter med at citere Miller & Reedy oprindelige arbejde. Derfor har FP tæthed rapporter været meget varierende, og kombineret med små stikprøvestørrelser, kan bidrage til de afvigende konklusioner om den rolle, som FP i smag følsomhed. De Genetics af Taste Lab udforsket denne tilsyneladende Inconkonsistens i optælling og fandt, at Scorers individuelt var prioritere vigtigheden af ​​disse egenskaber forskelligt og havde ingen vejledning til, når en papilla havde nogle, men ikke alle, af de rapporterede kvaliteter FP. Resultatet af denne subjektivitet er meget varierende FP tællinger af samme tungen billede. Denver Papillae protokol er blevet udviklet til at afhjælpe denne konsekvens ved brug af en nøgle dikotomisk at yderligere definerer og prioriterer betydningen af ​​de karakteristika, fremført af Miller & Reedy. Den foreslåede metode kan bidrage til at skabe en standard måde at kvantificere FP for forskere inden for smag og ernæringsmæssige undersøgelser.

Introduction

Papiller er de synlige bump på tungen overflade. Der er fire typer af papiller: fungiforme (FP), foliate, circumvallate og filiform. Mens trådformede papiller er spredt over overfladen af ​​tungen, er bægerformede kun lokaliseret på bagsiden af ​​tungen, og foliate findes på siderne. I modsætning hertil er FP placeret mod forsiden af ​​tungen. FP, foliate, og circumvallate papiller betragtes gustatoriske, fordi de har potentiale til at indeholde smagsløg mens filiform ikke. Smagsløg er klynger af celler der er ansvarlige for detektion af kemiske smagsstoffer og transducere stimuli i en gustatoriske signal i hjernen. Spyt og mad molekyler indgår smagsløgene gennem åbninger kaldet smag porer, hvor smag molekyler derefter har potentiale for at aktivere smag celler.

Interessant, der er store individuelle forskelle i smag opløbet tæthed, som først observeret i en histologisk undersøgelse af tungerfra 18 kadavere (Miller, 1988) 1. Smagsløg selv ikke er synlige på tungen overflade, men smag porer er synlige, når du bruger ordentlig forstørrelse, belysning, og farvningsteknikker der førte Miller & Reedy (1990) at udvikle en metode til at identificere smag porer og fungiforme papiller hjælp videomicroscopy i levende mennesker 2. En række laboratorier har ændret deres oprindelige videomicroscopy teknik med anvendelse af stadig fotografering og lidt eller ingen forstørrelse. Men da fungiforme papiller er meget lettere at visualisere end er porer ved hjælp af disse sidstnævnte teknikker, laboratorier vendt til tælling fungiforme papiller i stedet for smag porer. Dermed antages det, at fungiforme papilla massefylde er en rimelig proxy foranstaltning til smag pore massefylde, selvom mange fungiforme papiller ikke indeholder smag porer eller smag knopper 3; ikke kun er FP mere synlige og tilgængelige end circumvallate og foliate papiller, men deres image capture er mindre timig tidskrævende end smag pore analyse gennem den alternative metode videomicroscopy 2,4. I 1990, Miller & Reedy anvendte denne teknik til at finde, at smag pore tætheder er korreleret med FP densiteter 3, som blev yderligere bekræftet i Bartoshuk et al. 5 Ud over denne anatomiske forhold, Miller & Reedy fandt også, at de 8 individer i den øvre halvdelen af smagen poretæthed distributionen også bedømt saccharose, NaCl, og propylthiouracil (PROP) som betydeligt mere intens end gjorde de andre 8 personer 3. Efterfølgende arbejde af Bartoshuk et al. (1994) observeret en korrelation mellem suprathreshold PROP smag intensitet og fungiforme papilla tæthed, samt smag pore massefylde, i 42 forsøgspersoner 5. Denne bekvemme metode førte til indflydelsesrige undersøgelser rapporterer, at individer, hvis tunger har mange papiller fremkalde en stærkere reaktion på mange smagsstoffer, herunder den bitre smagsstoffer phenylthiocarbamide (PTC) og PROP 6,7.

PTC og PROP er veldokumenterede smagsstoffer ofte anvendes på grund af den klare sammenhæng mellem en persons smag følsomhed fænotype og deres genotype. Befolkningsgrupper undersøgelser har vist, at mennesker, der har den homozygote recessive diplotype af genet, TAS2R38, har en betydeligt lavere følsomhed til prop end bærere af den dominerende eller heterozygot variant af genet 8-10. Denne arvelige fænomen blev først rapporteret i 1932, da Arthur L. Fox annoncerede sin opdagelse af "smag blindhed" til PTC 11. Blandt folk i stand til at smage disse bitre forbindelser, intensiteten af smag rapporterede kan variere alt fra lidt ubehagelig til excruciatingly bitter 6. At tage højde for varians, der ikke kan forklares af TAS2R38 blev teorien lagt frem, at det kunne tilskrives tætheden af FP på tungen 4.

Som smag forskning skred frem, field var opdelt i to skoler til at tænke omkring denne teori om den rolle, FP og bitter smag følsomhed. Selvom mange undersøgelser bekræftede det oprindelige krav, at FP massefylde er en faktor i PROP følsomheder 4,6,12,13, har der været en lille, men vigtig begivenhed, der har fundet beviser at tilbagevise det, rapportering en manglende evne til at replikere rolle 10, 14,15,16. Delwiche et al. (2001) advarede om, at tendensen er meget varierende; FP tæthed ikke ensartet højde for forskelle i bitterhed følsomhed på tværs af fag, og var kun påviselig for personer med mindst moderat følsomhed til prop 7. Foruden anvendelsen af den mindre strengt definerede Miller & Reedy metode til at kvantificere FP, er det vigtigt at bemærke, at med undtagelse af Beaver Dam Afkom Study 15 udført af Fischer et al., De fleste af de ovennævnte undersøgelser havde lille prøve størrelser, som også kan bidrage til inkonsistente resultater vedrørenderolle FP i smag.

Kort beskrevet i Miller & Reedy skelsættende metode papir (1990), forfatterne farves tunger blå at kvantificere FP fordi FP forbliver lyserød mens trådformede papiller absorberer farvestoffet og blåt. De er klassificeret FP som "afrundede lyserøde strukturer omkring 0,5 mm i diameter" 2. Mens forfatterne opmærksom på, at før du bruger denne metode til videre analysearbejde, FP egenskaber skal mere strengt definerede og konkluderede, at variationen allerede bemærket i litteraturen "kunne tilskrives forskellige underlagt befolkninger, forskellige metoder og forskellige efterforskere" 2, deres forskning har ført til de almindeligt anerkendte egenskaber, som FP er runde 17,18, stor 2, pink eller bejdset lighter 2, og forhøjet 4. Taget for pålydende, disse egenskaber synes meget ligetil. I Genetics of Taste Lab (fik Lab eller Lab), anvendelsen af ​​den opfyldthod blev kompliceret af regnskabsførerne individuelle forsøg på at kvalificere og prioritere vigtigheden af ​​de ovennævnte karakteristika, når nogle, men ikke alle, af de egenskaber var til stede. Disse komplikationer omfattede små papiller, der dukkede pink midt i meget større papiller; hele tungen absorberer det blå farvestof dermed fjerne klassifikation baseret på farvevariation; aflange papiller i stedet for runde; og tunger har nogen variation i højde, som alle bidrog til regnskabsførerne rapportering bredt varierede FP tællinger af det samme billede.

Disse variationer i analyse førte os til at gennemgå litteraturen for at lokalisere den subjektivitet, identificere eventuelle undtagelser til de almindeligt accepterede FP egenskaber og i sidste ende udtænke en protokol til præcist og objektivt at definere og score FP.

Først FP form beskrevet i litteraturen som en afrundet, svamp-lignende struktur 17,18. Dog bemærkelsesværdig undtagelseioner blev også nævnt. Miller understregede, at udtrykket "fungiforme" er misvisende, og at mange FP ikke paddehatformet men kan variere meget i størrelse og morfologi 18. Melis et al. (2013) også beskrevet flere papiller, der blev betragtet som "forvrænget", hvor FP diameter i én retning var mindst to standardafvigelser længere end i en anden retning 19. Desuden Cheng & Robinson fandt, at når der angiver FP ved farvning, de lå fra flad top til aflange i udseende 20. Noterer sig de ovennævnte undtagelser, også karakterisering af en FP bliver rund og champignon-formede vises indsnævre en definition.

For det andet, er FP farve beskrives som "lyserøde cirkler mod en blå baggrund" 7 efter farvning tungen med blå farvestof. Selvom farvning lighter var den mest konsekvente kriterium FP hele litteraturen var det stadig ikke en ensartet kvalifikationskamp. Cheng & ; Robinson observeret, at FP ikke altid let farvet, hvilket gør vanskelige identifikation og usikker 20. Det ser da, at tunger absorberer farvestof forskelligt, og mens kontrasten er tilsyneladende på mange tunger, nogle bliver helt blå uden skelnen, mens andre straks miste nogen spor af blåt farvestof 21.

Den tredje egenskab, FP størrelse, var temmelig konsekvent blandt papirer, der spænder fra 0,5 mm til 0,97 mm 6,18. I litteraturen bemærkede Miller at der var to størrelsesområder af papiller på den dorsale forreste af tungen. Papiller med større diametre primært fungiforme og koniske papiller, mens papiller med en mindre diameter var hovedsagelig filiform 18. Dog med undtagelse af Beaver Dam Offspring Study 21, størrelse syntes ikke at afgøre, om en struktur er en FP i litteraturen, men var fastsat papiller allerede er klassificeret som "fungiforme".

_content "> Endelig er elevation opført som den fjerde RP karakteristiske 4 selvom Miller påpegede, at skelnen mellem filiform og fungiforme papiller er vanskeligt, når du bruger dette kriterium nær margin på tungen. Han gav to eksempler på FP, der varierede meget i højden, ene er 0,8 mm i højden, mens en anden var mindre end 0,1 mm i højden, men stadig havde to smag porer, der var klart observeret 18. Denne iagttagelse blev også fulgt op og bekræftet af Shahbake et al. 4

Disse definitioner og deres indberettede undtagelser viser, at feltet smag længe har erkendt inkonsekvens i karakterisere FP og manglerne ved den almindeligt anvendte protokol fra Miller & Reedy. Faktisk Miller & Reedy formanede feltet til yderligere at definere funktionerne i FP 2. Vi antager, at holdrekorder var at give forskellig vægt på de egenskaber og prioritere deres betydning forskelligt, når papillae undladt at opfylde alle kriterier, såsom når en papilla var stor og champignon formet, men farves blå. Det blev begrundet, at efterforskere fra de tidligere offentliggjorte undersøgelser sandsynligvis gjorde det samme som, når de kombineres med små stikprøvestørrelser, kan forklare de forskellige resultater, der kommer fra brug af denne metode.

Den taiwanske Lab behandlet dette hul i FP metodik ved at udvikle en retningslinje, der definerer hver egenskab ved hjælp af objektive målinger og prioriterer de egenskaber, at angive, hvilke forrang i analysen. Denne metode er den Denver Papillae Protocol (DPP), en dikotomisk nøgle med klare og tydelige kendetegn for FP for at sikre nøjagtige og gentagelige tællinger fra digitale fotografier af tungen. DPP er en foreslået metode til at standardisere den tidligere anvendte Miller & Reedy metode, og dermed fjerne individuelle fortolkning og sikre mere konsistente resultater, når man analyserer FP tæthed. Derved kan DPP anvendes til mere trygt determine rolle FP i smag.

Tungen billeder taget af de emner blev analyseret af borgerens videnskabsmænd (holdrekorder) af Lab, der er de sande emnerne for denne undersøgelse. Lab kerne af borger forskere består af medlemmer fra lokalsamfundet spænder i alder (år) fra 16 til midten af ​​80'erne. En summativ evalueringsrapport bestilt af museet i 2012 beskriver borgerens forskere som havende en stærk interesse i videnskab og med to tredjedele har tjent en universitetsuddannelse i en videnskabelig disciplin 22. Kandidat borger forskere er i øjeblikket rekrutteres via mund til mund, skal fuldføre et interview proces med veteran frivillige på museet, og gennemgå en prøveperiode i museets permanente sundhed udstilling, Ekspedition Health, før de har mulighed for at søge en stilling i Lab. Når accepteret i Lab, borger forskerne gennemgå en 12-ugers træning til at blive certificeret til at tilmelde menneskes. Efter denne certificering, er de i stand til at tage undervisningsmoduler om forskellige teknikker i Lab (f.eks papiller tælling, DNA-ekstraktion), og følgende yderligere certificeringer og regelmæssige kvalitetskontrol foranstaltninger, disse borger forskere har mulighed for at deltage aktivt i dataanalyse. Citizen forskerne frivilligt deres tid og ikke er kompenseret for deres bidrag til museet.

Protocol

Billederne scoret i denne undersøgelse blev indsamlet som del af en større smag undersøgelse foretaget i Genetics af Taste Lab på Denver Museum of Nature & Science (museet) 10. Emner af større undersøgelse var museumsgæster (n = 1.195) i alderen 18-93. Mens emner kom fra seks af de syv kontinenter, deltagerne var primært af europæisk afstamning. Hver motivets data blev indsamlet i en 30 min lab session. Den vestlige Institutional Review Board godkendt protokollen, informeret skriftligt samtykke blev givet, og fag meldte deres tid og blev ikke kompenseret for deres deltagelse i undersøgelsen.

1. Dataindsamling

  1. Billedoverførsel
    1. Vis emner et fotografi af, hvordan man kan stille sig selv (figur 1), og hvad det optagede billede vil se ud.
      Figur 1 Figur 1: Billedoverførsel Pose.
    2. Direkte emner at tørre deres tunge med et papir håndklæde og lade tungen stikker ud fra munden.
    3. Påfør ca. 3 ml blå fødevarer farvestof ved en 1:36 fusions spidsen af ​​tungen ved anvendelse af en steril, rayon applikator med en 1-inch spids. Har emner tilbage tunge til deres mund og synke til fjernelse af overskydende farvestof.
    4. Have fag udgør selv som vist i figur 1, med deres hagen på deres hænder og albuer skjules på en tabel til stabilitet. Direkte emner at udvide deres modersmål en behagelig afstand, og fastgør den forsigtigt mellem deres tænder.
    5. Klæbe en 2,5 cm stykke filtrerpapir med en diameter på 10 mm cirkulær udskæring slået i det til spidsen af den forreste af den venstre side af tungen ved siden af midterlinjen (se figur 1).
    6. Tag mindst tre nærbilleder af tungen, capturing hele 10 mm cirkulær udskæring at sikre visualisering af alle FP inden for dette område. Brug makro fastsættelse af en høj kvalitet, digital punkt og skyd kamera fastgjort til et stativ for stabilitet.
      1. Ind i det omfang, at hele udskæring er fotograferet mens stadig inden for kameraets anbefalede zoomområdet. Sikre, at planet af kameralinsen er parallel med planet af tungen, og at udskæringen vises cirkulære i fotografiet i stedet for aflange. Gennemgå billeder for at sikre, at de er af høj kvalitet og nyttig for at tælle.
  2. Billede Valg og forberedelse
    1. Uploade billeder til computeren.
    2. Af billederne er taget af det samme emne tunge, kun vælge én for yderligere analyse baseret på klar definition mellem strukturer på tungen på højeste zoom og den mindste forvrænget vinkel, så tungen er bred og flad mod kameraet.
    3. Åbn den valgte rå billede i open source, såftware, ImageJ. Klik på "Plugins", og i rullemenuen scroll til "Analyser" og klik på "Cell Counter". Når cellen tælleren åbnes, skal du klikke på "Initialiser" for at knytte billedet til cellen tæller.
      Bemærk: Her skal du bruge ImageJ 1,45 sek med 32-bit Java 1.6.0_10 version.
      1. Brug en standard forstørrelse på 50% for sammenhæng mellem holdrekorder og til brug i efterfølgende trin at score FP. Flyt billedet til venstre side af skærmen ved siden af ​​cellen tæller. Dette billede vil blive omtalt som Copy A (se figur 2, venstre side af skærmen).
  3. Åbn en anden kopi af rå billede (kopi B) til måling diametre af papiller kvantificeres. Zoom ind og ud efter behov for at præference for den enkelte målscorer hele scoring processen. Flytte denne kopi til højre side af skærmen, så de to kopier er ikke ved et uheld forvirret. (Se figur 2, højre afskærm)
  4. Klik på linje værktøj. Ved hjælp af B-eksemplaret, zoom ind så meget som nødvendigt præcist at tegne en diameter over 10 mm inderkreds af filtrerpapiret i enhver vinkel, og klik på "Analyze" og "Set Scale". Udfyld "kendte Distance" at være "10 . "Bekræft skalaen er korrekt ved at måle en alternativ vinkel og sikre området diameter er mellem 9,8 til 10,2 mm. Hvis det ikke er, skal du gentage dette trin.

Figur 2
Figur 2: Kopier A og Copy B. Kopi A (til venstre) er knyttet til den celle counter vindue og forbliver på 50% forstørrelse for konsistens fra målscorer til målscorer, mens B-eksemplaret (højre) kan zoomet for præference for den enkelte.

2. Scoring FP Brug af Denver Papillae protokollen dikotomisk Key

  1. For hver kandidat papilla, skal du bruge følgende dikotomisk nøgle (trin 2,2-2,5) angivelse af de kriterier, at afgøre, om det er en FP. Se figur 3 for en visuel af papiller, der er klassificeret som FP og for dem, der afvises på hvert trin i processen.
    Figur 3 Figur 3: FP vs Afvist Papillae. Figur 3a er en tunge med flere kvalificerende FP mens 3b-3e har kredset områder, der overtræder hver regel. (3b) område er amorf; (3c) papiller er for små; 3d) papilla er blå i forhold til dem omgiver det, (3e) papilla er forsænket i forhold til dem omkring det.
  2. Shape
    1. Undersøg, om kandidaten papilla er amorf (formløs). Ved 50% zoom se, om der er en almindeligt anerkendt geometrisk form (oval, terningformet, rund).
    2. Hvis der er en geometrisk form (se figur 3a), gå videre til trin 2.3.
    3. Hvis there er nogen geometrisk form (se figur 3b), gå til cellen counter vindue og klik på "Type 1." On copy A (50% zoom), klik kandidaten papilla at markere den som amorfe og ikke en FP. Ved at klikke på typer 1-4 i dette og efterfølgende trin giver holdrekorder at vide, de har behandlet alle kandidatlande papiller og kategoriserer som regel blev krænket, da afvisning af en struktur, der vil hjælpe i diskussionen i trin 2.7.2.
  3. Farve
    1. Se eksemplaret ved 50% zoom og afgøre, om der er nogen farve differentiering over overfladen af ​​tungen. Hvis det er tilfældet, skal du fortsætte til næste 2.3.2. Hvis ikke, skal du ikke bruge farve som en afgørende faktor; flytte til trin 2.4.
    2. Undersøg, om kandidaten papilla er lettere end vævet eller papiller omgiver det (se figur 3a). Hvis nogen del af kandidaten papilla er forblevet pink eller bejdset lettere, gå til trin 2.4.
    3. Hvis kandidaten papilla er blå og de omkringliggende papiller erlighter (se figur 3c), gå til cellen counter vindue og klik på "Type 2" på cellen tæller. På eksemplar A, skal du klikke kandidaten for at markere som alt for blå og ikke en FP.
  4. Størrelse
    1. Ved hjælp af B-eksemplaret, zoome ind på den afstand, hvor man mageligt kan se omridset af kandidat papilla.
    2. Klik på linje værktøj og måle på tværs af længste dimension af kandidat papilla. Klik på "Analyser" og derefter "foranstaltning". Hvis den målte længde er 0,5 mm eller derover (se figur 3a), gå til trin 2.5.
    3. Hvis den målte længde er 0,499 mm eller derunder, måle en gang mere for at sikre nøjagtighed. Hvis det stadig er 0,499 mm eller mindre (se F igur 3d), klik på "Type 3" på den celle counter vindue og på eksemplar A, skal du klikke kandidaten papilla at markere det som alt for lille og ikke en FP.
  5. Recession
    1. Ved hjælp af eksemplaret, vurdere, om kandidaten papilla er enten ensartet hanight med resten af ​​tungen eller forhøjet. Hvis papilla er i en sprække, bestemme højden sammenlignet med de andre strukturer i spalten, ikke overfladen af ​​tungen. Hvis papilla er lavere end papiller omgiver det (se figur 3e), skal du bruge "Type 4" og på eksemplar A, skal du klikke kandidaten papilla at markere den som forsænket og ikke en FP.
    2. Hvis kandidaten papilla er enten af ensartet højde med resten af tungen eller forhøjet (se figur 3a), skal du bruge "Type 5" til at klikke det og markere, at dette er en FP. Denne type 5 i alt er den rå FP score. Luk ikke kopierne på dette punkt, da ImageJ ikke gemme scores på cellens counter eller de farvede mærker fra typer 1-5 på eksemplar A.
  6. Saving Copy A
    1. Skriv ned i notesbog rå FP score.
    2. På cellen counter vinduet, skal du klikke på "Eksporter billede." Gem med den ønskede navngivning system laboratoriet. Dette vil tillade åbningen af ​​copy A i fremtiden at fastholde de farvede mærker fra typer 1-5. Det vil ikke redde rå FP score.
  7. Kvalitetskontrol
    1. Score hvert foto af to individuelle holdrekorder og sammenligne 7.
    2. Hvis den højere FP rå score er inden for 10% af den nedre FP rå score gennemsnittet af to scoringer sammen til en konsensus FP score. Hvis de to FP rå scoringer afvige mere end 10%, skal du trække begge scoret billeder på skærmen.
      1. Brug counter typer 1-4 til støtte i diskussion af uoverensstemmelser og giver en endelig konsensus score. Hvis der ikke kan opnås enighed under debatten, tage en pause fra scoring. På et senere tidspunkt, rescore billedet og diskutere. Hvis der ikke kan opnås enighed endnu, træk i en tredje målscorer. Bed dem om at score det billede og dialog med de to andre.

3. Uddannelse Scorers at bruge DPP

  1. Baggrund om Træning
    1. Har to holdrekorder tæller en række billeder,udføre individuelt og regelmæssigt giver for at sikre, at de ved hjælp af de samme kriterier. Først når de enkelte tællinger var konsekvent inden for 10% af hinanden for hver af de billeder, når scorede var den metode (færdiggjort ovenfor) godtages, og betegnes DPP.
    2. Vælg 15 officielle billeder og 15 uddannelse billeder (Supplemental Figur 2-17) i rækkefølge for at score. Hvis et billede blev anset utallige under udvælgelsen, springe billedet og vælg næste sekventielle billede.
      Bemærk: Disse billeder varierer i kvalitet og størrelse som de blev valgt, mens Lab stadig mastering den korrekte fotografering teknik. En af de valgte billeder blev anset utallige gennem denne primære stemmeoptællingen, men blev efterladt i at sikre, at holdrekorder kunne gøre, at opkald, når det er nødvendigt. Derfor er der 16 billeder givet til praktikanter dog kun 15 scorede billeder.
    3. Ved hjælp af DPP, har de ovennævnte holdrekorder tælle 15 uddannelse billeder og skabe en konsensusscore for hver.
    4. Giv praktikanter de 15 officielle billeder, og bede om at scor Miller & Reedy at skabe en baseline. Optag scoringer. Gennemføre en gruppe uddannelse, som fulgte trin 3.2. Når trin 3.2 blev afsluttet, har regnskabsførerne score de 15 officielle billeder igen og registrere deres scoringer.
  2. Træning Efterfølgende Scorers på DPP
    1. Giv uddannelse holdrekorder den første træning billedet og demonstrere DPP for et par papiller på dette billede. Diskuter begrundelse for at vælge eller afvise hver papilla som FP. Tillad praktikanter til at fortsætte med at øve scoring for resten af denne foto og konferere med konsensus nummer (for GOT Labs konsensus nummer og type 1-5 markører, se supplerende figur 1). Til dette billede drøfte eventuelle uoverensstemmelser uanset de 10% for at sikre forståelsen af ​​DPP.
    2. Giv efterfølgende holdrekorder anden uddannelse billedet og få dem scor DPP.
    3. Hvis praktikanten rå FP score er inden for tiprocent af den etablerede konsensus tælle fra afsnit 3.1.3., tillade praktikant til at flytte til det næste billede, og gentag trin.
    4. Hvis scoren er uden for ti procent rækkevidde, bruge praktikantens farvede mærker, der repræsenterer typer 1-5 til at forstå og identificere inkonsekvens og derefter tage fat afvigende forståelse af DPP.
    5. Giv praktikanten mulighed for at rescore billedet, og bekræfte den nye score en gang mere. Hvis det lykkes, praktikant flytter ind på det næste billede, indtil alle billeder er afsluttet.

Representative Results

Her er et repræsentativt fotografi scoret af to individuelle scores ved brug af almindeligt anvendte Miller & Reedy metode til FP identifikation baseret på marken standarder for runde, store, pink eller farves lysere, og forhøjet, og derefter den samme fotografi scoret af to holdrekorder bruger DPP. De viste tællinger er repræsentative for den høje varians, ved anvendelse af oprindelige metode sammenlignet med den lavere varians hjælp DPP.

Figur 4

Figur 4:. Miller & Reedy Kvantificering vs DPP Kvantificering Billedet til venstre er repræsentativt for to holdrekorder 'tæller ved hjælp af Miller & Reedy Method. Billedet til højre viser to holdrekorder 'tæller bruger DPP. Rød er målscorer 1, Gul er målscorer 2, Green er holdrekorder 1 & 2.

Statistisk pålidelighed DPP er tidligere studeret ved hjælp af en blandet lineær model til vurdering af variabilitet 10. Kort fortalt til at generere data til at vurdere, hvilken rolle DPP spiller i konsistens scoringer blev femten billeder scorede to gange. I det første parti af scoringer, DPP naive holdrekorder brugte Miller & Reedy metode 2. Regnskabsførerne blev derefter uddannet til at bruge DPP og billederne blev individuelt rescored uden det endelige konsensus trin beskrevet i afsnit 2.7 beskriver Quality Control (figur 5). FP score datasæt blev derefter anvendt i den blandede model til at vurdere de kombinerede forskelle på grund protokol (figur 6), inden-målscorer variabilitet og samspillet mellem de to. Denne model viste en signifikant forskel i scoring ved brug af Miller & Reedy metode sammenlignet med DPP (p-værdi <1 x 10 -6) med DPP fører til en højere antallet med 6,99 (SE = 0,99); 5,2% af variationen i partituret skyldtes uddannelse, 25,9% på grund af målscorer, og de resterende grundvariabiliteten specifikke for billedet 10. Dernæst at generere data til at bestemme inden-målscorer variabilitet, blev en serie af tredive billeder i tilfældig rækkefølge scoret af 11 individer. Ukendt for regnskabsførerne, denne serie af billeder, omfattede tre billeder, der blev gentaget. Vi observerede en drastisk forskel i score variabilitet sammenligne forskellige billeder versusrepeated billeder.

Figur 5
Figur 5:. DPP-Naïve vs Indlæg DPP Training Paneler giver boxplots af korrekturlæser scores for 15 billeder før og efter Denver Papillae Protocol uddannelse. For hver boxplot, en udfyldt cirkel angiver middelværdien hvorimod en åben cirkel angiver en outlier.

Figur 6
Figur 6:. Ændring i Scorer Variance Den grå repræsenterer than varians for individuelle holdrekorder før DPP uddannelse. Sort er den samme målscorer indlæg DPP uddannelse.

Discussion

Ved hjælp af DPP, variansen inden billedet tæller tværs uafhængige holdrekorder og inden-sekretærbordet tæller faldt betydeligt. Mens denne metode gør visuelle FP density analyse uden videomicroscopy mindre subjektive, skal det bemærkes, at denne metode kun scores FP. DPP kan ikke garantere, at strukturerne er klassificeret som FP har smag porer og er derfor smagspapillerne eller at de tæller er reflekterende af ægte smag opløbet tæthed 20,23 .Den karakter af denne metode er, at den fastslår pålidelighed gennem konsekvens og præcision; imidlertid kan det påvirke resulterer i en konsistent retning. For at teste nøjagtighed i forhold til andre metoder ved anvendelse af et sandt mål for smag bud densitet (f.eks videomicroscopy) ville strække sig uden for rammerne af denne study.However ved at betegne morfologien af FP strengere og skabe en dichotomous nøgle, denne metode adresser Miller & Reedy anklage for det felt, mere karakterisering af FPder skal gøres for at få konsensus om deres morfologi og kvantificering 2. Derudover har de tilkendegivet, at denne karakteristik kan "afklare nogle af forskellene mellem emner og forklare nogle af de forskellige resultater blandt efterforskere 2." Ved at give en ensartet metode til kvantificering, mange af uoverensstemmelser om den rolle, som FP i smag og ernæ- relateret forskning kan afhjælpes.

Den dikotome nøgle kan justeres for de forskellige billedoptagelse teknikker. Den kendte distance for måleskala kan nemt indstilles til diameteren anvendes i hvert laboratorium og recession kan tilbagediskonteres, hvis Saran wrap eller glas blev placeret over tungen for billedoptagelse. I GOT Lab, blev det konstateret, at den neutrale tungen forudsat de bedste definition af papiller. Dette kan være på grund af mængden af ​​lys i Lab som forårsagede Saran wrap eller glas til at reflektere lys tilbage i kameraet skabe en blænding, foretaget æslersment vanskelig. Nogle labs har sagt, at de finder farvestoffet mere udfordrende at tælle, men den taiwanske Lab fundet en fortyndet blå mad farvestof i en koncentration på 1:36 forudsat den ideelle kontrast mellem fungiforme og filiform papiller på størstedelen af ​​tunger.

Oprettelsen af ​​et dikotomisk nøgle til FP karakterisering vil give mulighed for forskere i forskellige laboratorier ved hjælp af en bred vifte af billedoptagelse metoder, til konsekvent at analysere strukturer på tungen og har tillid til rapporteringen af ​​deres resultater. Endelig kan brugen af ​​en dikotomisk nøgle har formål i andre områder af videnskabelig metode, hvor kvaliteter af strukturer eller genstande leverer inkonsistente numre fra studiet til undersøgelsen.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret delvist af Science Education Partnership Award (SEPA) R25 RR025066 mellem 2008-2012 fra National Institutes of Health og National Center for Research Resources. Tak til kolleger på området for tankevækkende diskussion af litteraturen, vores resultater og feedback om brugen af ​​DPP i forskellige laboratorie scenarier smag: John Hayes, Sue Coldwell, Paul Breslin, Carla Schubert. Tak også til ledelse på Denver Museum of Nature & Science og personale til støtte for borgernes videnskab inden for Genetik af Taste Lab inden Expedition Health. Endelig tak til alle vores frivillige borger forskere for deres tid og engagement til at udvikle og anvende denne protokol, herunder: Bjørn Aragon, Mike Archer, Su Ataman, Michael Bagley, A'nette Bertrand, Diana Boyles, Wendy Covert, Sasha Dooley , Patty Drever, Jessica Ern, Laura Harmacek, Sean Hibbard, Joyce Hutchens, Matt Joo, Leta Keane, Willem Leenhouts, Stephania Lukjan, Ashley Matthews, Mike Mauser, Stephanie Miller, Hallie Morgan-Rodriguez, Griffin Scherma, Alyssa Schickedanz, Terri Simon, Dylan Thomas, Rudy Torres, Tyler Wilson, Diane Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10.3 megapixels) and P500 (12.1 megapixels) Nikon http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/ neither model appears to be available on the website any longer
Paper Hand Towels Kleenex https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, I. J. Human taste bud density across adult age groups. J Gerontol. 43, (1), B26-B30 (1988).
  2. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Quantification of fungiform papillae and taste pores in living human subjects. Chem Senses. 15, (3), 281-294 (1990).
  3. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Variations in Human Taste Bud Density and Taste Intensity Perception. Physiol Behav. 47, (6), 1213-1219 (1990).
  4. Shahbake, M., Hutchinson, I., Laing, D. G., Jinks, A. L. Rapid quantitative assessment of fungiform papillae density in the human tongue. Brain Res. 1052, (2), 196-201 (2005).
  5. Bartoshuk, L. M., Duffy, V. B., Miller, I. J. PTC/PROP tasting: anatomy, psychophysics, and sex effects. Physiol Behav. 56, (6), 1165-1171 (1994).
  6. Essick, G. K., Chopra, A., Guest, S., McGlone, F. Lingual tactile acuity, taste perception, and the density and diameter of fungiform papillae in female subjects. Physiol Behav. 80, (2-3), 289-302 (2003).
  7. Delwiche, J. F., Buletic, Z., Breslin, P. A. Relationship of papillae number to bitter intensity of quinine and PROP within and between individuals. Physiol Behav. 74, (3), 329-337 (2001).
  8. Kim, U. K., Jorgenson, E., Coon, H., Leppert, M., Risch, N., Drayna, D. Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide. Science. 299, (5610), 1221-1225 (2003).
  9. Hayes, J. E., Bartoshuk, L. M., Kidd, J. R., Duffy, V. B. Supertasting and PROP bitterness depends on more than the TAS2R38 gene. Chem Senses. 33, (3), 255-265 (2008).
  10. Garneau, N. L., et al. Crowdsourcing taste research: genetic and phenotypic predictors of bitter taste perception as a model. Front Integr Neurosci. 8, (33), (2014).
  11. Fox, A. L. The relationship between chemical constitution and taste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 18, (1), 115-120 (1932).
  12. Tepper, B. J., Nurse, R. J. Fat Perception is related to PROP taster status. Physiol Behav. 61, (6), 949-954 (1997).
  13. Duffy, V. B., et al. Bitter receptor gene (TAS2R38.), 6-n.-Propylthiouracil (PROP) bitterness and alcohol intake. Alcohol Clin Exp Res. 28, (11), 1629-1637 (2004).
  14. Yackinous, C., Guinard, J. X. Relation between PROP taster status and fat perception, touch, and olfaction. Physiol Behav. 72, (3), 427-437 (2001).
  15. Fischer, M. E., et al. Factors related to fungiform papillae density: The Beaver Dam Offspring Study. Chem Senses. 38, (8), 669-677 (2013).
  16. Feeney, E. L., Hayes, J. E. Regional differences in suprathreshold intensity for bitter and umami stimuli. Chemosens Percept. 7, (3-4), 147-157 (2014).
  17. Saito, T., Narita, N., Yamada, T., Manabe, Y., Ito, T. Morphology of human fungiform papillae after severing chorda tympani nerve. Ann Otol Rhinol Laryngol. 120, (5), 300-306 (2011).
  18. Miller, I. J. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. L. Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
  19. Cheng, L. H. H., Robinson, P. P. The distribution of fungiform papillae and taste buds on the human tongue). Arch Oral Biol. 36, (8), 583-539 (1991).
  20. Cruickshanks, K. J., et al. Measuring taste impairment in epidemiologic studies-The Beaver Dam Offspring Study. Ann N Y Acad Sci. 1170, 543-552 (2009).
  21. McNamara, P. A. Genetics of Taste summative evaluation report prepared for Denver Museum of Nature & Science. Independent Evaluator. Chicago IL. (2012).
  22. Arvidson, K., Friberg, U. Human taste: Response and taste bud number in fungiform papillae. Science. 209, (4458), 807-808 (1980).
Denver Papillae Protokol for objektiv analyse af fungiforme Papillae
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter