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Neuroscience

Denver Papillen Protokoll für objektive Analyse der pilzförmige Papillen

doi: 10.3791/52860 Published: June 8, 2015

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um pilzförmige Papillen Dichte von digitalen Fotos zu messen. Diese Methode baut Priorisierung und objektives Merkmal Metriken in den ursprünglichen Beschreibungs Arbeit an pilzförmigen Papillen von Miller & Reedy (1990).

Abstract

Das Ziel des Denver Papillen Protokoll ist es, eine dichotome Schlüssel verwenden, um zu definieren und zu priorisieren die Eigenschaften von pilzförmigen Papillen (FP), um konsistente Scoring zwischen Torschützen gewährleisten. Dieses Protokoll baut auf der Notwendigkeit, die von den letzten zwei Jahrzehnten des Geschmacks Forschung mit FP als Proxy für Geschmack Porendichte entstanden ist. FP Dichte war in der Vergangenheit mit Miller & Reedy ist 1990 Charakterisierungen ihrer Morphologie analysiert: rund, gefärbt Feuerzeug, groß, und erhöhten. In dieser Arbeit vorgewarnt die Autoren, dass strengere Definitionen FP Morphologie notwendig skizziert. Trotz dieser Aufruf zum Handeln hat verfolgen Literatur war knapp, mit den meisten Studien weiter zu Miller & Reedy ursprünglicher Arbeit zu zitieren. Folglich haben FP Dichte Berichte sehr unterschiedlich gewesen, und in Kombination mit kleinen Stichproben, können zu den abweichenden Schlussfolgerungen über die Rolle der FP in Geschmacksempfindlichkeit beizutragen. Die Genetik der Taste Lab erforscht diesen scheinbaren inconKonsistenz der Zählung und gefunden, daß scorers wurden einzeln Priorisieren der Bedeutung dieser Eigenschaften unterschiedlich und hatte keine Anleitung zur wenn eine Papille hatten einige, aber nicht alle, der berichtet Qualitäten FP. Das Ergebnis dieser Subjektivität ist sehr variabel FP Zählungen des gleichen Bildes Zunge. Die Denver Papillen Protokoll wurde entwickelt, um diese Folge durch die Verwendung eines dichotomen Schlüssel, dass weitere definiert und priorisiert die Bedeutung der Merkmale her von Miller & Reedy setzen beheben. Das vorgeschlagene Verfahren kann dazu beitragen, eine standardisierte Möglichkeit, FP für Forscher im Bereich der Geschmacks- und Ernährungsstudien zu quantifizieren.

Introduction

Papillen sind die sichtbaren Unebenheiten auf der Zungenoberfläche. Es gibt vier Arten von Papillen: pilzförmigen (FP), foliate, circumvallate und fadenförmig. Während fadenförmigen Papillen sind über die Oberfläche der Zunge verteilt sind circumvallate nur auf der Rückseite der Zunge lokalisiert und Blatt sind an den Seiten gefunden. Im Gegensatz dazu sind FP in Richtung der Vorderseite der Zunge entfernt. FP, foliate und Wallpapillen werden als Geschmacks, weil sie das Potenzial, Geschmacksknospen enthalten, während filiform nicht haben. Gaumen sind Cluster von Zellen zum Nachweis chemischer tastants und Transduzieren der Reize in einen gustatorischen Signals im Gehirn verantwortlich. Speichel und Nahrungsmoleküle treten in den Gaumen durch Öffnungen genannt Geschmack Poren, wo Geschmack Moleküle haben dann die Möglichkeit der Aktivierung Geschmackszellen.

Interessanterweise gibt es große individuelle Unterschiede in der Geschmacksknospe Dichte, als erste in einer histologischen Untersuchung der Zunge beobachtetab 18 Leichen (Miller, 1988) 1. Gaumen selbst nicht auf der Zungenoberfläche sichtbar sind jedoch sichtbar Geschmack Poren bei der Verwendung von richtigen Vergrößerung, Beleuchtung und Färbetechniken, die Miller & Reedy (1990) führte zu einer Methode, um Geschmack Poren und die pilzförmigen Papillen mit Videomikroskopie in lebenden identifizieren zu entwickeln Menschen 2. Eine Reihe von Labors haben ihren ursprünglichen Videomikroskopie Technik modifiziert, mit immer noch Fotografie und wenig oder keine Vergrößerung. Da jedoch pilzförmigen Papillen sind viel einfacher zu visualisieren sind als Poren mit diesen letzteren Techniken, wandte Labors zu zählen pilzförmige Papillen Geschmack anstelle von Poren. Dabei wird angenommen, dass pilzförmigen Papillen Dichte ist eine angemessene Ersatzgröße für den Geschmack Porendichte, auch wenn viele pilzförmigen Papillen enthalten keine Geschmacks Poren oder Geschmacksknospen 3; nicht nur FP sichtbarer und zugänglicher als circumvallate und foliate Papillen, aber ihre Bilderfassung weniger timich in Anspruch als Geschmack Porenanalyse durch die alternative Methode der Videomikroskopie 2,4. Im Jahr 1990, Miller & Reedy verwendet diese Technik, um den Geschmack Porendichten mit FP Dichten 3, die in Bartoshuk et al. 5 weiter bestätigt wurde Zusätzlich zu dieser anatomischen Beziehung korreliert finden, Miller & Reedy auch festgestellt, dass die 8 Personen in der oberen Hälfte der Geschmack Porendichteverteilung auch bewertet Saccharose, NaCl, und Propylthiouracil (PROP) als deutlich intensiver als die anderen taten 8 Personen 3. Nachfolgende Arbeiten von Bartoshuk et al. (1994) beobachteten eine Korrelation zwischen überschwellige PROP Geschmack Intensität und pilzförmigen Papillen Dichte sowie Geschmack Porendichte, in 42 Themen 5. Diese bequeme Methode führte zu einflussreichen Studien berichten, dass Patienten, deren Zungen haben viele Papillen entlocken eine stärkere Reaktion auf viele Geschmacksstoffe, einschließlich der bitteren Geschmacksstoffe Phenylthiocarbamid (PTC) und PROP 6,7.

PTC und PROP sind gut recherchierte Geschmacksstoffe durch die klare Verbindung zwischen einer Person Geschmack Empfindlichkeit Phänotyp und Genotyp ihrer oft verwendet. Bevölkerungsstudien haben gezeigt, dass Menschen, die homozygot rezessiv Diplotyp des Gens TAS2R38 haben, haben eine deutlich geringere Empfindlichkeit gegen PROP als Träger der dominant oder heterozygote Variante des Gens 8-10. Diese vererbbare Phänomen wurde zuerst im Jahr 1932 gemeldet, wenn Arthur L. Fox kündigte seine Entdeckung der "Geschmack Blindheit" zu PTC 11. Unter den Menschen in der Lage, diese Bitterstoffe schmecken, die Intensität des Geschmacks berichtet kann überall von ein wenig unangenehm, unerträglich bitter 6 variieren. Um die Varianz, die nicht durch TAS2R38 erklärt werden kann entfallen, wurde die Theorie vorgebracht, dass es mit der Dichte des FP auf der Zunge 4 zurückzuführen.

Als Geschmacksforschung fortgeschritten ist, das field wurde in zwei Denkschulen, um diese Theorie über die Rolle der FP und bitteren Geschmack Empfindlichkeit unterteilt. Obwohl viele Studien bestätigt die ursprüngliche Behauptung, dass FP Dichte ist ein Faktor in PROP Empfindlichkeiten 4,6,12,13, gab es einen kleinen, aber wichtigen Kontingenz, die gefunden hat Beweise zu widerlegen, den Hinweis auf die Unfähigkeit, die Rolle 10 zu replizieren, 14,15,16. Delwiche et al. (2001) warnte davor, dass der Trend ist sehr variabel; FP Dichte nicht gleichmäßig Konto für Unterschiede in der Bitterkeit Empfindlichkeit über Themen, und war nur für Patienten mit mindestens einem moderaten Sensitivität PROP 7 nachweisbar. Zusätzlich zu der Verwendung der weniger streng definierten Miller & Reedy Methode, wie man FP zu quantifizieren, ist es wichtig zu beachten, dass mit Ausnahme des Beaver Dam Nachkommen Study 15 durch Fischer geführt et al., Die meisten der oben genannten Studien hatten kleine Proben Größen, die auch zu inkonsistenten Befunde beitragen könnendie Rolle von FP im Geschmack.

Kurz gesagt, in Miller & Reedy brechenden Methodik Papier (1990), die Autoren gefärbten Zungen blau zu quantifizieren, weil FP FP bleiben rosa während fadenförmigen Papillen absorbieren den Farbstoff und blau. Sie klassifiziert FP als "abgerundeten rosa Strukturen etwa 0,5 mm Durchmesser" 2. Während die Autoren darauf hingewiesen, dass, bevor Sie dieses Verfahren für weitere Analysen, FP Merkmale sollten genauer definiert werden und festgestellt, dass die Variation in der Literatur bereits angemerkt, 2, "könnte auf verschiedene Themengruppen, verschiedenen Methoden und verschiedenen Forschern als" ihre Forschung hat auf die allgemein anerkannten Eigenschaften, die FP sind rund 17,18, große 2, rosa geführt oder gebeizt leichter 2 und 4 erhöhten. Bare Münze genommen scheinen diese Eigenschaften sehr geradlinig. In der Genetik der Taste Lab (GOT Lab oder Lab), die Verwendung der trafhod wurde von einzelnen Versuche der Torschützenkönige in der Qualifikation komplizierte und Priorisierung der Bedeutung der oben genannten Merkmale, wenn einige, aber nicht alle, der die Merkmale vorhanden waren. Diese Komplikationen waren kleine Papillen, die rosa in der Mitte viel größere Papillen erschienen; die gesamte Zunge zu absorbieren den blauen Farbstoff wodurch Klassifizierung nach Farbvariation; Lang Papillen statt rund; und Federn, die keine Veränderung in der Höhe, die alle dazu beigetragen, scorers Berichts weit variiert FP Zählungen des gleichen Bildes.

Diese Variationen in der Analyse führte uns zu der Literatur, um die Subjektivität zu lokalisieren, identifizieren keine Ausnahmen von den allgemein anerkannten FP Eigenschaften und letztlich entwickeln ein Protokoll genau und objektiv zu definieren und zu punkten FP überprüfen.

Zuerst wird FP Form in der Literatur als eine abgerundete, pilzartige Struktur 17,18 beschrieben. Allerdings bemerkenswerte AusnahmeIonen wurden ebenfalls genannt. Miller betont, daß der Ausdruck "pilzförmige" ist eine Fehlbezeichnung ist und dass viele FP nicht pilzförmig, sondern kann in der Größe und Morphologie 18 variieren. Melis et al. (2013) beschrieben mehrere Papillen, die berücksichtigt wurden "verzerrt", wobei die FP-Durchmesser in einer Richtung mindestens zwei Standardabweichungen mehr als in einer anderen Richtung 19 war. Außerdem Cheng & Robinson festgestellt, dass bei der Angabe von FP-Färbung, reichten sie aus, um längliche abgeflachte in Erscheinung 20. In Anbetracht der oben genannten Ausnahmen, die Charakterisierung eines FP ist rund und pilzförmigen erscheint eine zu enge Definition.

Zweitens wird FP Farbe "rosa Kreise vor einem blauen Hintergrund" 7 nach Färbung der Zunge mit blauen Farbstoff beschrieben. Obwohl Färbung leichter war der konsequenteste Kriterium der FP in der gesamten Literatur war es noch kein einheitliches Qualifikationsspiel. Cheng & ; Robinson beobachtet, dass FP nicht immer leicht ver- schmutzt, so dass Identifizierung schwierig und unsicher 20. Es scheint also, dass Zungen absorbieren Farbstoff anders und während der Kontrast ist offensichtlich auf viele Sprachen, einige werden ohne Unterscheidung ganz blau, während andere sofort verlieren jede Spur von blauem Farbstoff 21.

Die dritte Eigenschaft, FP Größe war ziemlich konsistent unter den Papieren, die von 0,5 mm bis 0,97 mm 6,18. In der Literatur Miller merkt, dass es zwei Größenbereichen von Papillen auf der dorsalen anterioren der Zunge. Die Papillen mit größeren Durchmessern sind in erster Linie fungiform und konisch Papillen, während die Papillen mit einem kleineren Durchmesser waren zumeist fadenförmig 18. Jedoch mit Ausnahme der Beaver Dam Nachkommen Study 21, Größe nicht erscheinen, um zu bestimmen, ob eine Struktur ein FP in der Literatur, aber war für Papillen bereits als "pilzförmige" klassifiziert ist.

_content "> schließlich Erhebung wird hier nur als vierten charakteristischen FP 4 obwohl Miller wies darauf hin, dass die Unterscheidung zwischen fadenförmig und pilzförmigen Papillen ist schwierig, wenn Sie diese Kriterien in der Nähe des Randes der Zunge. Er gab zwei Beispiele von FP, die sich stark in der Höhe variiert, einer 0,8 mm in der Höhe, während eine andere betrug weniger als 0,1 mm in der Höhe, aber immer noch zwei Geschmacks Poren deutlich beobachtet wurden 18. Diese Beobachtung wurde auch verfolgt und durch Shahbake et al. 4 bestätigt

Diese Definitionen und deren berichteten Ausnahmen zeigen, dass das Geschmacksfeld ist seit langem bei der Charakterisierung von FP und die Mängel der häufig verwendete Protokoll von Miller & Reedy erkannte die Inkonsistenz. In der Tat, Miller & Reedy ermahnte das Feld, um die Eigenschaften FP 2 weiter zu definieren. Wir vermuten, dass Torschützenkönige gaben unterschiedliche Gewicht auf die Eigenschaften und Priorisierung ihrer Bedeutung unterschiedlich, wenn papillae versäumt, jedes Kriterium, beispielsweise wenn ein Papille war groß und pilzförmigen treffen, aber blau gefärbt. Es wurde argumentiert, dass die Ermittler von den bisher veröffentlichten Studien wahrscheinlich tat das gleiche, die, wenn sie mit kleinen Stichproben kombiniert werden, können für die vielfältigen Ergebnisse aus Anwendung dieses Verfahrens Rechnung zu tragen.

Die taiwanische Lab adressiert diese Lücke in der FP-Methodik durch die Entwicklung einer Leitlinie, die jedes Merkmal definiert mit objektiven Messungen und priorisiert die Eigenschaften anzugeben, welche Vorrang in Analyse dauert. Diese Methode ist die Denver Papillen Protocol (DPP), eine dichotome Schlüssel mit klaren und deutlichen Merkmale von FP, um genaue und wiederholbare zählt von den digitalen Fotografien der Zunge zu gewährleisten. DPP ist ein vorgeschlagenes Verfahren, um die zuvor verwendeten Miller & Reedy Verfahren, wodurch das Entfernen individuelle Interpretation und sicherzustellen, konsistentere Ergebnisse bei der Analyse von FP Dichte standardisieren. Auf diese Weise kann DPP zu mehr Zuversicht d verwendet werdenetermine die Rolle von FP im Geschmack.

Die Zunge Bilder der Probanden entnommen wurden durch die Bürger Wissenschaftler (Torschützen) des Lab, die die wahren Themen dieser Studie untersucht. Kern der Bürger Wissenschaftler des Labors wird der Mitglieder aus der Community, die im Alter (Jahre) von 16 bis Mitte der 80er Jahre zusammen. Eine summative Evaluation Bericht des Museums im Jahr 2012 in Auftrag beschreibt Bürger Wissenschaftler wie mit einem starken Interesse an der Wissenschaft und mit zwei Dritteln mit einem Hochschulabschluss in einem wissenschaftlichen Gebiet 22 verdient. Kandidat Bürger Wissenschaftler derzeit via Mundpropaganda rekrutiert, muss erfolgreich abgeschlossen werden ein Interview-Prozess mit Veteran Freiwilligen im Museum, und eine Probezeit in Dauergesundheitsausstellung des Museums, Expedition Gesundheit, unterziehen, bevor sie die Möglichkeit, für eine Position in beantragen Labor. Einmal in die Lab akzeptiert, Bürger Wissenschaftler einen 12-wöchigen Ausbildung absolvieren, um zertifiziert zu werden, um menschliche Subjekt einschreibens. Im Anschluss an diese Zertifizierung, in der Lage, Trainingsmodule auf verschiedenen Techniken im Labor (zB Papillen Zählung, DNA-Extraktion) und zusätzlich folgende Zertifizierungen und regelmäßige Qualitätskontrollmaßnahmen sind, haben diese Bürger Wissenschaftler die Möglichkeit, aktiv in die Datenanalyse zu beteiligen. Citizen Wissenschaftler ehrenamtlich und werden nicht für ihre Beiträge zum Museum kompensiert.

Protocol

Die in dieser Studie erzielte Bilder wurden als Teil einer größeren Studie Geschmack in der Genetik der Taste Lab im Denver Museum of Nature & Science (das Museum) 10 durchgeführt gesammelt. Themen der größeren Studie waren Museumsbesucher (n = 1195) im Alter von 18 bis 93. Während Themen aus sechs der sieben Kontinente kamen, waren die Teilnehmer vor allem europäischer Abstammung. Daten jedes Thema wurde in einem 30 Minuten Labor-Sitzung gesammelt. The Western Institutional Review Board genehmigt das Protokoll, informiert schriftliche Einwilligung erteilt wurde und Untertanen freiwillig ihre Zeit und wurden nicht für ihre Teilnahme an der Studie kompensiert.

1. Data Collection

  1. Bilderfassung
    1. Themen anzeigen eine Fotografie, wie sie sich darstellen (Abbildung 1), und was das aufgenommene Bild aussehen wird.
      Abbildung 1 Abbildung 1: Bildaufnahme Pose.
    2. Direkter Themen, ihre Zunge mit einem Papierhandtuch trocken und lassen Sie die Zunge aus dem Mund herausragt.
    3. Ca. 3 ml blauer Lebensmittelfarbstoff in einer Konzentration 1.36 bis zum Scheitelpunkt der Zunge mit Hilfe einer sterilen, Rayon Applikator mit einem 1-Zoll-Spitze. Haben Themen zurückkehren Zunge, den Mund und schlucken, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen.
    4. Haben Themen stellen sich, wie in Abbildung 1 dargestellt ist, mit ihren Kinn auf ihre Hände und Ellbogen auf einen Tisch für Stabilität gestützt. Direkter Themen, ihre Zunge einen komfortablen Abstand zu verlängern und befestigen Sie sie vorsichtig zwischen den Zähnen.
    5. Erfüllen, ist eine 2,5 cm großes Stück Filterpapier mit einem Durchmesser von 10 mm kreisförmigen Ausschnitt in tanzt bis zur Spitze der vorderen von der linken Seite der Zunge neben der Mittellinie (siehe Abbildung 1).
    6. Nehmen Sie sich mindestens drei Nahaufnahmen der Zunge, capturing die gesamte 10 mm kreisförmigen Ausschnitt zu Visualisierung aller FP in diesem Gebiet zu gewährleisten. Verwenden Sie die Makro-Einstellung eines hochwertigen digitalen Punkt und schießen Kamera auf einem Stativ für Stabilität befestigt.
      1. Zoom hinein in dem Maße, dass die gesamte Aussparung, während noch in der Kamera empfohlen Zoombereich fotografiert. Sicherzustellen, daß die Ebene des Objektivs parallel zur Ebene der Zunge, und dass die Aussparung kreisförmig erscheint im Bild anstatt länglich. Bewertung Fotos, um sicherzustellen, sie sind von hoher Qualität und nützlich für die Zählung.
  2. Bildauswahl und Vorbereitung
    1. Laden Sie die Fotos auf den Computer.
    2. Der Bilder desselben Motivs der Zunge aufgenommen, wählen Sie nur eine für die weitere Analyse auf der Grundlage klarer Definition von Strukturen auf der Zunge an der höchsten Zoom und der mindestens verzerrte Winkel so die Zunge ist breit und flach in Richtung der Kamera.
    3. Öffnen Sie den ausgewählten Rohbild in der Open-Source-software, ImageJ. Klicken Sie auf "Plugins" und im Dropdown-Menü zu blättern und "Analysieren" und klicken Sie auf "Zellzähler." Wenn der Zellenzähler wird, klicken Sie "Initialisieren", um das Bild an die Zellzähler verbinden.
      Hinweis: Hier verwenden ImageJ 1,45 sec mit Java 1.6.0_10 32-Bit-Version.
      1. Verwenden Sie eine Standardvergrößerung von 50% für die Kohärenz zwischen Torschützen und für den Einsatz in den nachfolgenden Schritten zu punkten FP. Verschieben Sie das Bild auf der linken Seite des Bildschirms neben dem Zellzähler. Dieses Bild wird als Kopie A (siehe Abbildung 2, linke Seite des Bildschirms) bezeichnet werden.
  3. Öffnen Sie eine zweite Kopie des rohen Bild (Kopie B) zum Messen der Durchmesser der Papillen quantifiziert. Vergrößern und Verkleinern, um den Vorlieben des einzelnen Torschützenkönig in der gesamten Bewertungsprozess benötigt. Bewegen Sie diese Kopie auf der rechten Seite des Bildschirms, so die beiden Kopien sind nicht zufällig durcheinander. (Siehe Abbildung 2, rechte SeiteBildschirm)
  4. Klicken Sie auf das Werkzeug Linie. Verwenden Kopie B, vergrößern so viel wie nötig, um genau zu zeichnen einen Durchmesser über der 10 mm Innenkreis des Filterpapiers in einem beliebigen Winkel und klicken Sie auf "Analysieren" und "Set-Skala". Füllen Sie das "bekannte Strecke" sein "10 . "Stellen Sie sicher durch die Messung eine alternative Winkel korrekt die Waage und sorgen für die Durchmesserbereich zwischen 9,8 bis 10,2 mm. Wenn es nicht ist, wiederholen Sie diesen Schritt.

Figur 2
Abbildung 2: Kopieren Sie A und B. Copy Copy A (links) mit dem Zellzähler Fenster verknüpft und bleibt mit 50% Vergrößerung auf Konsistenz von Torschützenkönig, um Torschützenkönig, während Kopie B (rechts) kann auf die Vorlieben des Einzelnen vergrößert werden.

2. Scoring FP Mit der Denver Papillen Protocol Dichotome Key

  1. Für jeden Kandidaten Papilla, verwenden Sie die folgende dichotome Schlüssel (Schritt 2,2-2,5) detailliert die Kriterien zu bestimmen, ob es sich um eine FP. Beziehen sich auf eine visuelle Papillen, die als FP klassifiziert und für diejenigen, die bei jedem Schritt in dem Verfahren zurückgewiesen werden, Figur 3.
    Figur 3 Abbildung 3: FP vs. Abgelehnt Papillen. 3a ist eine Zunge mit mehreren Qualifikations FP während 3b-3e sind Bereiche, die jede Regel verstoßen eingekreist. (3b) Bereich amorph; (3c) Papillen sind zu klein; 3d) Papille ist blau im Vergleich zu den umgebenden, (3e) Papille ausgespart im Vergleich zu denen um ihn herum.
  2. Form
    1. Bestimmen Sie, ob der Kandidat Papille amorph (formlos). Bei 50% Zoom sehen, ob es eine allgemein anerkannte geometrische Form (oval, quaderförmig, rund).
    2. Wenn es eine geometrische Form (siehe Abbildung 3a), fahren Sie mit Schritt 2.3.
    3. Wenn there keine geometrische Form (siehe Abbildung 3b), gehen Sie auf die Zellenzähler-Fenster und klicken Sie auf "Typ 1" auf Kopie A (50% Zoom), klicken Sie auf die Kandidaten Papille zu markieren Sie ihn als amorphe und nicht ein FP. Mit einem Klick auf Typen 1-4 in diesem und den folgenden Schritten können Torschützen zu wissen, dass sie alle Bewerber Papillen angesprochen und kategorisiert, welche Regel verletzt wurde, wenn die Zurückweisung einer Struktur, die in der Diskussion in Schritt 2.7.2 helfen werden.
  3. Farbe
    1. Beziehen sich auf eine auf 50% zoomen kopieren und zu bestimmen, ob es einen Farbunterscheidung über die Oberfläche der Zunge. Wenn ja, weiter zum nächsten 2.3.2. Wenn nicht, verwenden Sie nicht die Farbe als entscheidender Faktor; fahren Sie mit Schritt 2.4.
    2. Bestimmen Sie, ob der Kandidat Papille ist leichter als das Gewebe oder Papillen umgibt (siehe Abbildung 3a). Wenn ein Teil des Kandidaten Papille hat rosa geblieben oder gebeizt leichter, fahren Sie mit Schritt 2.4.
    3. Wenn der Kandidat Papille ist blau und die umgebenden PapillenFeuerzeug (siehe Abbildung 3c), gehen Sie auf die Zellenzähler-Fenster und klicken Sie auf "Typ 2" auf der Zellzähler. Am Kopie A, klicken Sie auf die Kandidaten Als zu blau und nicht eine FP.
  4. Größe
    1. Verwenden Kopie B, vergrößern, um den Abstand in dem man bequem die Umrisse des Kandidaten Papille.
    2. Klicken Sie auf das Zeilenwerkzeug und messen in der längsten Abmessung des Kandidaten Papille. Klicken Sie auf "Analysieren" und dann "Maßnahme". Wenn die gemessene Länge beträgt 0,5 mm oder mehr (siehe Abbildung 3a), fahren Sie mit Schritt 2.5.
    3. Wenn die gemessene Länge 0.499 mm oder weniger, noch einmal zu messen, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Wenn es noch 0,499 mm oder weniger (siehe B ild 3d), klicken Sie auf "Typ 3" auf der Zellzähler-Fenster und auf Kopie A, klicken Sie auf die Kandidaten Papille zu markieren Sie ihn als zu klein und kein FP.
  5. Rezession
    1. Verwenden Kopie A, zu beurteilen, ob der Kandidat Papille entweder Uniform, die eright mit dem Rest der Zunge oder erhöht. Wenn die Papille in einem Spalt bestimmen, verglichen mit den anderen Strukturen in den Spalt, nicht die Oberfläche der Zunge seiner Höhe. Wenn der Papille niedriger als die umgebenden Papillen ist (siehe Abbildung 3e), verwenden Sie "Type 4" und auf Kopie A, klicken Sie auf die Kandidaten Papille um sie zu markieren und als Einbau kein FP.
    2. Wenn der Kandidat Papille entweder von gleichmäßiger Höhe mit dem Rest der Zunge oder erhöhten (siehe Abbildung 3a), verwenden Sie "Typ 5" es zu klicken, und markieren Sie, dass dies ein FP. Diese Art 5 Gesamt ist die rohe FP-Score. Die Kopien an dieser Stelle nicht schließen, wie ImageJ nicht auf Kopie A. speichern Sie die Werte auf der Zellzähler noch die farbigen Markierungen von Typen 1-5
  6. Saving Copy A
    1. Notieren Sie sich in Notebook raw FP-Score.
    2. Auf der Zellenzähler-Fenster auf "Bild exportieren". Speichern Sie mit der gewünschten Namenssystem des Labors. Dadurch wird die Öffnung der Polizist ermöglicheny A in die Zukunft, um die farbigen Markierungen von Typen 1-5 zu halten. Es wird nicht speichern Sie die raw FP-Score.
  7. Qualitätskontrolle
    1. Ergebnis jedes Foto von zwei einzelnen Torschützen und vergleichen Sie 7.
    2. Wenn die höhere FP Rohwert innerhalb von 10% der unteren FP Rohwert, der Mittelwert der beiden Noten zusammen für einen Konsens FP-Score. Wenn die beiden FP Rohwerte sich um mehr als 10%, ziehen beide erzielte Fotos auf den Bildschirm.
      1. Verwenden Zählertypen 1-4, um auf einem endgültigen Konsens Punktzahl in die Diskussion über Abweichungen unterstützen und beraten. Wird kein Konsens in der Diskussion zu erreichen, machen Sie eine Pause von Scoring. Zu einem späteren Zeitpunkt, rescore das Bild und diskutieren. Wenn ein Konsens noch nicht erreicht werden kann, ziehen Sie in einem Dritt traf. Bitten Sie sie, um das Bild und den Dialog mit den anderen beiden punkten.

3. Ausbildung Torschützenkönige zu DPP Verwenden

  1. Hintergrund für die Ausbildung
    1. Haben zwei Torschützen zählen eine Vielzahl von Bildern,individuell Scoring und verleihen regelmäßig, um sicherzustellen, dass sie mit den gleichen Kriterien wurden. Nur wenn einzelne zählt durchweg innerhalb von 10% voneinander für jeweils die Bilder, wenn erzielte war die Methode (oben abgeschlossen) als akzeptabel angesehen und bezeichnet DPP.
    2. Wählen Sie 15 offizielle Bilder und 15 Trainingsbilder (Supplemental Figuren 2-17) in der angegebenen Reihenfolge zu punkten. Wenn ein Bild wurde während der Auswahl als unzählige, überspringen Sie das Bild und wählen nächstfolgende Bild.
      Hinweis: Diese Bilder unterscheiden sich in Qualität und Größe, wie sie gewählt wurden, während das Lab noch die Beherrschung der richtigen Technik Fotografie. Einer der ausgewählten Bilder wurde durch diese Primär Zählvorgang als unzählige, wurde aber in links, um sicherzustellen, dass Torschützen konnten zeigen, dass Anruf, wenn nötig. Daher gibt es 16 Bilder zu Auszubildende gegeben, obwohl nur 15 erzielte Bilder.
    3. Verwendung DPP haben die oben genannten Torschützen zählen die 15 Trainingsbilder und ein KonsensGäste für jede.
    4. Geben Sie die 15 Auszubildenden offizielle Bilder und bitten, auswerten Miller & Reedy, um eine Basis zu schaffen. Rekordergebnisse. Führen Sie eine Gruppentraining, das Schritt 3.2 gefolgt. Sobald Schritt 3.2 abgeschlossen wurde, haben die Torschützenliste stand es 15 offizielle Bilder wieder und nehmen ihre Noten.
  2. Schulung Nachfolgende Torschützenkönige auf DPP
    1. Geben Ausbildung Torschützen des ersten Bildes Ausbildung und zeigen DPP für einige Papillen zu diesem Bild. Diskutieren Begründung für die Auswahl oder Ablehnung jeder Papille als FP. Ermöglichen Auszubildenden weiter praktizieren Scoring für den Rest des Foto und verleihen mit dem Konsens Nummer (der Got Lab Konsens Anzahl und Art 1-5 Marker, siehe Zusatz Abbildung 1). Dieses Foto diskutieren Abweichungen unabhängig von der 10%, um das Verständnis der DPP gewährleisten.
    2. Geben nachfolgenden Torschützen des zweiten Bildausbildungs ​​und sie auswerten DPP.
    3. Wenn der Auszubildende raw FP-Score ist innerhalb von zehnProzent der etablierten Konsens zählen von Abschnitt 3.1.3., ermöglichen Auszubildenden bis zum nächsten Bild zu bewegen und wiederholen Sie die Schritte.
    4. Wenn die Gäste außerhalb der Zehn-Prozent-Bereich, verwenden des Auszubildenden farbigen Markierungen, die Typen 1-5, zu verstehen und zu identifizieren, die Inkonsistenz und dann adressieren abweichenden Verständnis der DPP.
    5. Geben Sie dem Praktikanten die Möglichkeit, die Bild rescore und überprüfen Sie die neue Partitur noch einmal. Wenn dies gelingt, auf das nächste Bild bewegt Trainee bis alle Bilder fertig sind.

Representative Results

Hier ist eine repräsentative Fotografie durch zwei einzelne Torschützen bei der Verwendung der häufig verwendete Miller & Reedy Methodik zur Identifizierung FP auf der Grundlage der Feldstandards rund, groß, rosa erzielt oder gebeizt leichter und erhöht, und dann das gleiche Foto von zwei Torjäger erzielte mit DPP. Die gezeigten zählt, sind repräsentativ für die Verwendung des ursprünglichen Verfahrens im Vergleich zum unteren Varianz mit DPP beobachtete hohe Varianz.

Figur 4

Abb. 4: Miller & Reedy Quantifizierung vs DPP Quantifizierung Das Bild auf der linken repräsentativen Zählungen zwei scorers 'mit dem Miller & Reedy Verfahrens geeignet ist. Das Bild auf der rechten Seite stellt zwei Torschützenkönige zählt mit DPP. Red ist Torschützenkönig 1, ist Yellow Torschützen 2, Grün Torschützen 1 & 2.

Statistische Zuverlässigkeit der DPP wurde zuvor unter Verwendung einer gemischten linearen Modell, um die Variabilität zu bewerten 10 untersucht. Kurz gesagt, die Daten, die Rolle spielt DPP in Konsistenz von Partituren beurteilen zu erzeugen, wurden fünfzehn Bilder zweimal erzielt. In der ersten Partie von Partituren, verwendet DPP naiv Torschützen die Miller & Reedy Methode 2. Die Torschützen wurden geschult, um DPP verwenden und die Bilder wurden einzeln ohne die in Abschnitt 2.7 detailliert Quality Control (Abbildung 5) beschrieben endgültigen Konsens Schritt rescored. Die FP-Score Datensatz wurde dann in der Mischmodell verwendet, um die kombinierten Unterschiede aufgrund Protokoll (Abbildung 6), in-Torschützenkönig Variabilität und die Wechselwirkung zwischen den beiden zu bewerten. Dieses Modell zeigte einen signifikanten Unterschied in Scoring bei Verwendung der Miller & Reedy Verfahrens gegenüber DPP (p-Wert von <1 x 10 -6) mit DPP und damit ein höherer Zählwert um 6,99 (SE = 0,99); 5,2% der Variabilität in der Partitur war auf Ausbildung, 25,9% aufgrund von Torschützenkönig, und die restlichen auf GrundUm die Variabilität der spezifisch auf die Bild 10. Als nächstes wird, um Daten zu erzeugen, die in-Torschützenkönig Variabilität zu bestimmen, wurden eine Reihe von dreißig Bilder in zufälliger Reihenfolge von 11 Personen erzielt. Unbemerkt von Torschützen, diese Serie von Bildern enthalten drei Bilder, die wiederholt wurden. Wir beobachteten eine drastische Unterschied in der Partitur Variabilität Vergleich deutliche Bilder versusrepeated Bilder.

Figur 5
Abb. 5: DPP-Naive vs Beitrag DPP Ausbildung Panels bieten Boxplots der Rezensent Partituren für 15 Bilder vor und nach Denver Papillen Protocol Ausbildung. Für jede boxplot, ein im Kreis gefüllt gibt den Mittelwert der Erwägung, dass ein offener Kreis zeigen einen Ausreißer.

Figur 6
Abb. 6: Veränderung der Scorer Variance Der graue stellt ter Varianz für einzelne Torschützen vor der DPP-Training. Schwarz ist die gleiche Torschütze Post DPP Ausbildung.

Discussion

Verwendung DPP, die Varianz innerhalb image zählt über unabhängige Torschützen und zählt innerhalb Torschützenkönig deutlich zurückgegangen. Während dieses Verfahren macht visuelle FP Dichteanalyse ohne Videomikroskopie weniger subjektiv ist anzumerken, dass dieses Verfahren nur Partituren FP werden. DPP kann nicht garantieren, dass Strukturen wie FP eingestuft haben Geschmack Poren und sind daher Geschmackspapillen, noch, dass die zählt, sind repräsentativ für echte Geschmacksknospe Dichte 20,23 .Die Natur dieser Methode ist, dass sie feststellt, Sicherheit durch Konsistenz und Präzision; jedoch kann es sein Vorspannen ergibt eine einheitliche Richtung. Um die Genauigkeit im Vergleich zu anderen Methoden zu testen mit einem wahre Maß Geschmacksknospe Dichte (zB Videomikroskopie), würde den Rahmen dieses study.However erstrecken, durch die Charakterisierung der Morphologie der FP strenger und die Schaffung einer dichotomen Schlüssel, diese Methode richtet Miller & Reedy die Ladung auf dem Gebiet, dass weitere Charakterisierung von FPmuss, um einen Konsens über ihre Morphologie und Quantifizierung 2 müssen durchgeführt werden. Außerdem gaben sie an, dass diese Charakterisierung könnten "einige der Unterschiede zwischen den Themen zu klären und einige der unterschiedlichen Ergebnisse erklären unter Ermittler 2." Durch die Bereitstellung einer einheitlichen Methode zur Quantifizierung, viele der Abweichungen über die Rolle der FP in Geschmack und ernährungs Forschung kann behoben werden.

Die dichotomen Schlüssel kann für die unterschiedlichen Bildaufnahmetechniken angepasst werden. Die bekannten Abstand zur Messskala kann leicht an die in jedem Labor und Rezession verwendet werden, können ausgeschlossen werden, wenn Frischhaltefolie oder Glas wurden über die Zunge für die Bilderfassung platziert Durchmesser eingestellt werden. In der Got Lab wurde festgestellt, dass die neutrale Zunge die beste Definition der Papillen. Dies kann aufgrund der Menge an Licht in der Lab, die Frischhaltefolie oder Glas verursacht, um Licht in die Kamera zu reflektieren die Schaffung einer Blendung, die Esel gemacht werdensment schwierig. Einige Labors haben gesagt, sie der Farbstoff eine größere Herausforderung zu zählen, zu finden, aber der Got Lab fand eine verdünnte blauer Lebensmittelfarbstoff in einer Konzentration von 1.36 bot den idealen Kontrast zwischen pilzförmige und fadenförmigen Papillen auf der Mehrzahl von Zungen.

Die Schaffung einer dichotomen Schlüssel für FP Charakterisierung wird für Forscher in verschiedenen Labors zu ermöglichen, mit einer Vielzahl von Bildaufnahmeverfahren, um konsequent zu analysieren Strukturen auf der Zunge und das Vertrauen in die Berichterstattung über die Ergebnisse. Schließlich kann die Verwendung eines dichotomen Schlüssel Zwecke in anderen Bereichen der wissenschaftlichen Methodologie, wo Eigenschaften von Strukturen oder Objekten bieten inkonsistente Zahlen von Studie zu Studie.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch Science Education Partnership Award (SEPA) R25 RR025066 zwischen 2008 bis 2012 von den National Institutes of Health und der National Center for Research Resources finanziert. Wir danken Ihnen, den Kollegen in den Geschmacksfeld für nachdenkliche Erörterung der Literatur, unsere Ergebnisse und Rückmeldungen über die Verwendung der DPP in verschiedenen Laborszenarien: John Hayes, Sue Coldwell, Paul Breslin, Carla Schubert. Vielen Dank auch an Führung im Denver Museum of Nature & Science und das Personal zur Unterstützung der Bürger der Wissenschaft innerhalb der Genetik der Taste Lab innerhalb Expedition Gesundheit. Schließlich, ich danke Ihnen für alle unsere ehrenamtliche Bürger Wissenschaftler für ihre Zeit und das Engagement für die Entwicklung und die dieses Protokoll verwenden, einschließlich: Bären Aragon, Mike Archer, Su Ataman, Michael Bagley, A'nette Bertrand, Diana Boyles, Wendy Covert, Sasha Dooley , Patty Drever, Jessica Ern, Laura Harmacek, Sean Hibbard, Joyce Hutchens, Matt Joo, Leta Keane, Willem Leenhouts, Stephania Lukjan, Ashley Matthews, Mike Mauser, Stephanie Miller, Hallie Morgan-Rodriguez, Griffin Scherma, Alyssa Schickedanz, Terri Simon, Dylan Thomas, Rudy Torres, Tyler Wilson, Diane Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10.3 megapixels) and P500 (12.1 megapixels) Nikon http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/ neither model appears to be available on the website any longer
Paper Hand Towels Kleenex https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

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References

  1. Miller, I. J. Human taste bud density across adult age groups. J Gerontol. 43, (1), B26-B30 (1988).
  2. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Quantification of fungiform papillae and taste pores in living human subjects. Chem Senses. 15, (3), 281-294 (1990).
  3. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Variations in Human Taste Bud Density and Taste Intensity Perception. Physiol Behav. 47, (6), 1213-1219 (1990).
  4. Shahbake, M., Hutchinson, I., Laing, D. G., Jinks, A. L. Rapid quantitative assessment of fungiform papillae density in the human tongue. Brain Res. 1052, (2), 196-201 (2005).
  5. Bartoshuk, L. M., Duffy, V. B., Miller, I. J. PTC/PROP tasting: anatomy, psychophysics, and sex effects. Physiol Behav. 56, (6), 1165-1171 (1994).
  6. Essick, G. K., Chopra, A., Guest, S., McGlone, F. Lingual tactile acuity, taste perception, and the density and diameter of fungiform papillae in female subjects. Physiol Behav. 80, (2-3), 289-302 (2003).
  7. Delwiche, J. F., Buletic, Z., Breslin, P. A. Relationship of papillae number to bitter intensity of quinine and PROP within and between individuals. Physiol Behav. 74, (3), 329-337 (2001).
  8. Kim, U. K., Jorgenson, E., Coon, H., Leppert, M., Risch, N., Drayna, D. Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide. Science. 299, (5610), 1221-1225 (2003).
  9. Hayes, J. E., Bartoshuk, L. M., Kidd, J. R., Duffy, V. B. Supertasting and PROP bitterness depends on more than the TAS2R38 gene. Chem Senses. 33, (3), 255-265 (2008).
  10. Garneau, N. L., et al. Crowdsourcing taste research: genetic and phenotypic predictors of bitter taste perception as a model. Front Integr Neurosci. 8, (33), (2014).
  11. Fox, A. L. The relationship between chemical constitution and taste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 18, (1), 115-120 (1932).
  12. Tepper, B. J., Nurse, R. J. Fat Perception is related to PROP taster status. Physiol Behav. 61, (6), 949-954 (1997).
  13. Duffy, V. B., et al. Bitter receptor gene (TAS2R38.), 6-n.-Propylthiouracil (PROP) bitterness and alcohol intake. Alcohol Clin Exp Res. 28, (11), 1629-1637 (2004).
  14. Yackinous, C., Guinard, J. X. Relation between PROP taster status and fat perception, touch, and olfaction. Physiol Behav. 72, (3), 427-437 (2001).
  15. Fischer, M. E., et al. Factors related to fungiform papillae density: The Beaver Dam Offspring Study. Chem Senses. 38, (8), 669-677 (2013).
  16. Feeney, E. L., Hayes, J. E. Regional differences in suprathreshold intensity for bitter and umami stimuli. Chemosens Percept. 7, (3-4), 147-157 (2014).
  17. Saito, T., Narita, N., Yamada, T., Manabe, Y., Ito, T. Morphology of human fungiform papillae after severing chorda tympani nerve. Ann Otol Rhinol Laryngol. 120, (5), 300-306 (2011).
  18. Miller, I. J. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. L. Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
  19. Cheng, L. H. H., Robinson, P. P. The distribution of fungiform papillae and taste buds on the human tongue). Arch Oral Biol. 36, (8), 583-539 (1991).
  20. Cruickshanks, K. J., et al. Measuring taste impairment in epidemiologic studies-The Beaver Dam Offspring Study. Ann N Y Acad Sci. 1170, 543-552 (2009).
  21. McNamara, P. A. Genetics of Taste summative evaluation report prepared for Denver Museum of Nature & Science. Independent Evaluator. Chicago IL. (2012).
  22. Arvidson, K., Friberg, U. Human taste: Response and taste bud number in fungiform papillae. Science. 209, (4458), 807-808 (1980).
Denver Papillen Protokoll für objektive Analyse der pilzförmige Papillen
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Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

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