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Neuroscience

Denver Papille protocollo per l'analisi Obiettivo papille fungiformi

doi: 10.3791/52860 Published: June 8, 2015

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo per misurare la densità fungiformi papilla da fotografie digitali. Questo metodo si basa priorità e parametri caratteristici oggettive nel lavoro descrittivo originale sul papille fungiformi da Miller & Cannavò (1990).

Abstract

L'obiettivo del protocollo è di Denver Papille utilizzare una chiave dicotomica per definire e dare priorità alle caratteristiche delle papille fungiformi (FP) per garantire punteggio coerente tra marcatori. Questo protocollo costruisce fuori di un bisogno che è sorto dagli ultimi due decenni di ricerche gusto utilizzando FP come proxy per la densità dei pori gusto. Densità FP è stato storicamente analizzati utilizzando Miller & Reedy 1990 caratterizzazioni di loro morfologia: tondo, macchiato più leggero, ampio ed elevato. In questo lavoro, gli autori avvertiti che le definizioni rigorose di FP morfologia doveva essere descritte. Nonostante questo invito all'azione, seguire la letteratura è stata scarsa, con maggior parte degli studi che continuano a citare Miller & Cannavò del lavoro originale. Di conseguenza, i rapporti densità FP sono stati altamente variabile e, in combinazione con campioni di piccole dimensioni, possono contribuire alle conclusioni discordanti sul ruolo di FP nella sensibilità gusto. La genetica del gusto Lab esplorato questo apparente INCONcoerenza nel conteggio e ha scoperto che marcatori sono stati individualmente dando priorità l'importanza di queste caratteristiche in modo diverso e non ha avuto una guida per quando una papilla avuto alcuni, ma non tutti, le qualità riportati di FP. Il risultato di questa soggettività è conteggi FP altamente variabili della stessa linguetta. Il Denver Papille protocollo è stato sviluppato per rimediare a questa conseguenza attraverso l'uso di una chiave dicotomica che ulteriori definisce e dà la priorità alla importanza delle caratteristiche messe avanti da Miller & Reedy. Il metodo proposto potrebbe contribuire a creare un modo standard per quantificare FP per i ricercatori nel campo del gusto e studi nutrizionali.

Introduction

Papille sono i dossi visibili sulla superficie della lingua. Ci sono quattro tipi di papille fungiformi: (FP), foliate, circumvallate e filiforme. Mentre papille filiformi sono distribuite sulla superficie della lingua, circumvallate sono localizzati solo sul retro della lingua, e foliate si trovano ai lati. Al contrario, FP si trova verso la parte anteriore della lingua. FP, foliate, e papille gustative circumvallate sono considerati perché hanno il potenziale per contenere palato mentre filiforme non lo fanno. Papille gustative sono gruppi di cellule responsabili per la rilevazione tastants chimici e trasduttori gli stimoli in un segnale gustativa nel cervello. Molecole saliva e cibo entrano nelle papille gustative attraverso aperture chiamate pori del gusto in cui le molecole del gusto quindi hanno il potenziale di attivare cellule gustative.

È interessante notare che ci sono grandi differenze individuali nella densità papille gustative, come prima osservato in uno studio istologico delle lingueda 18 cadaveri (Miller, 1988) 1. Le papille gustative stesse non sono visibili sulla superficie della lingua, tuttavia, i pori gustative sono visibili quando si utilizza appropriate tecniche di ingrandimento, di illuminazione e di colorazione che hanno portato Miller & Reedy (1990) di sviluppare un metodo per identificare i pori del gusto e papille fungiformi utilizzando videomicroscopia in vita gli esseri umani 2. Un certo numero di laboratori hanno modificato la loro tecnica videomicroscopia originale, utilizzando la fotografia ancora e poco o niente di ingrandimento. Tuttavia, dal momento che papille fungiformi sono molto più facili da visualizzare che sono i pori utilizzano questi ultimi tecniche, laboratori rivolti a contare papille fungiformi al posto di pori di gusto. In tal modo, si presume che la densità fungiformi papilla è una misura di proxy ragionevole per la densità dei pori gusto, anche se molti papille fungiformi non contengono pori gustative o papille 3; non solo sono FP più visibile e accessibile di circumvallate e foliate papille, ma la loro cattura dell'immagine è meno timi consuma di analisi gusto pori attraverso il metodo alternativo di videomicroscopia 2,4. Nel 1990, Miller & Cannavò usato questa tecnica per scoprire che gusto densità dei pori sono correlati con densità FP 3 che è stato ulteriormente corroborato in Bartoshuk et al. 5 Oltre a questo rapporto anatomico, Miller & Cannavò hanno anche scoperto che le 8 persone nel superiore metà della distribuzione di densità dei pori gusto anche valutato di saccarosio, NaCl, e propiltiouracile (PROP) significativamente più intenso che hanno fatto gli altri 8 individui 3. Il lavoro successivo da Bartoshuk et al. (1994) ha osservato una correlazione tra suprathreshold intensità PROP gusto e la densità papille fungiformi, così come la densità dei pori gusto, in 42 soggetti 5. Questo metodo conveniente ha portato a studi autorevoli segnalazione che i soggetti cui lingue hanno molti papille suscitare una reazione più forte a molti tastants, tra cui il tastants amaro phenylthiocarbamide (PTC) e PROP 6,7.

PTC e PROP sono tastants ben studiate oft utilizzati a causa del chiaro legame tra la sensibilità gusto fenotipo di una persona e il loro genotipo. Gli studi di popolazione hanno dimostrato che le persone che hanno la diplotype recessivo omozigote del gene, TAS2R38, hanno una sensibilità significativamente inferiore a PROP di portatori della variante dominante o eterozigoti del gene 8-10. Questo fenomeno ereditabile è stata riportata nel 1932, quando Arthur L. Fox ha annunciato la sua scoperta del "gusto cecità" per PTC 11. Tra le persone in grado di assaggiare questi composti amari, l'intensità del gusto riportato può variare da nessuna parte da un po 'sgradevole terribilmente amaro 6. Per tenere conto di varianza che non può essere spiegato con TAS2R38, la teoria è stata avanzata che potrebbe essere attribuito alla densità di FP sulla lingua 4.

Come la ricerca gusto progrediva, il field è stato diviso in due scuole di pensiero in tutto questa teoria riguardanti il ​​ruolo di FP e sensibilità gusto amaro. Anche se molti studi corroborate la domanda principale che la densità FP è un fattore di PROP sensibilità 4,6,12,13, c'è stato un piccolo, ma importante contingenza che ha trovato prove per confutare esso, riportando l'incapacità di replicare il ruolo di 10, 14,15,16. Delwiche et al. (2001) ha avvertito che la tendenza è molto variabile; Densità FP fa conto non in maniera uniforme le differenze nella sensibilità amarezza tra i soggetti, ed era dimostrabile solo per i soggetti con almeno una sensibilità moderata a PROP 7. Oltre all'uso della Miller & Reedy metodo meno rigorosamente definita su come quantificare FP, è importante notare che, ad eccezione della progenie Beaver Dam Study 15 condotta da Fischer et al., La maggior parte degli studi precedenti avevano piccolo campione misure che possono anche contribuire a risultati inconsistenti suil ruolo di FP nel gusto.

In breve, in Miller & Reedy di carta metodologia seminale (1990), gli autori macchiati lingua blu da quantificare perché FP FP rimane rosa mentre papille filiformi assorbire il colorante e diventano blu. Essi classificati FP come "arrotondate strutture rosa di circa 0,5 mm di diametro" 2. Mentre gli autori informati che prima di utilizzare questo metodo per un ulteriore lavoro di analisi, le caratteristiche FP dovrebbero essere più strettamente definite e hanno concluso che la variazione già nota in letteratura "potrebbe essere attribuibile a diverse popolazioni soggette, metodi diversi, e diversi ricercatori" 2, il loro ricerca ha portato le caratteristiche comunemente accettati che FP sono intorno 17,18, grande 2, rosa o macchiato accendino 2, ed elevato 4. Preso alla lettera, queste caratteristiche appaiono molto semplice. Nelle Genetica del gusto Lab (GOT Lab o Lab), l'uso del riunitohod è stata complicata da singoli tentativi dei marcatori a qualificare e dare priorità l'importanza delle caratteristiche di cui sopra, quando alcuni, ma non tutti, le caratteristiche erano presenti. Queste complicazioni inclusi piccolo papille apparso rosa in mezzo a molto più grande papille; l'intera lingua assorbire il colorante blu eliminando così classificazione basata sulla variazione di colore; papille oblungo invece di turno; e alette avendo nessuna variazione in elevazione, ognuno dei quali ha contribuito a marcatori segnalazione ampiamente varie conteggi FP della stessa immagine.

Queste variazioni di analisi ci ha portato a rivedere la documentazione, al fine di individuare la soggettività, di individuare eventuali eccezioni alle caratteristiche FP comunemente accettati e, infine, elaborare un protocollo in modo preciso e oggettivo definire e segnare FP.

Innanzitutto, forma FP è descritto in letteratura come arrotondato, fungo come struttura 17,18. Tuttavia, notevole eccezioneGli ioni sono stati menzionati. Miller sottolineato che il termine "fungiform" è improprio e che molti FP non sono a forma di fungo, ma può variare ampiamente in dimensioni e morfologia 18. Melis et al. (2013) ha descritto anche diversi papille che sono stati considerati "distorta", dove il diametro FP in una direzione era almeno due deviazioni standard più lungo in un'altra direzione 19. Inoltre, Cheng e Robinson hanno scoperto che quando si indica FP dalla colorazione, che variavano da cima piatta di forma allungata in apparenza 20. Prendendo atto delle eccezioni di cui sopra, la caratterizzazione di un FP essere rotondo e appare a forma di fungo una nozione molto ristretta.

In secondo luogo, il colore FP è descritto come "circoli rosa contro uno sfondo blu" 7 dopo colorazione della lingua con il colorante blu. Sebbene colorazione accendino era il criterio più coerente FP tutta la letteratura non era ancora un qualificatore uniforme. Cheng & ; Robinson ha osservato che la FP non erano sempre leggermente macchiato, rendendo difficile l'identificazione ed incerto 20. Sembra quindi che le lingue assorbono tintura in modo diverso e, mentre il contrasto è evidente in molte lingue, alcuni diventano interamente blu senza distinzione, mentre altri perdono immediatamente ogni traccia di colorante blu 21.

La terza caratteristica, la dimensione FP, è stato abbastanza coerente tra le carte, che vanno da 0,5 mm a 0,97 millimetri 6,18. Nella letteratura Miller osservato che vi erano due intervalli di grandezza di papille sulla dorsale anteriore della lingua. Le papille con diametri maggiori erano principalmente fungiformi papille e conica, mentre le papille con un diametro più piccolo erano per lo più filiforme 18. Tuttavia, con l'eccezione della Offspring Beaver Dam Study 21, formato non appariva per determinare se una struttura è un FP in letteratura, ma era prevista papille già classificato come "fungiformi".

_content "> Infine, elevazione è elencato come il quarto PQ caratteristica 4 anche se Miller ha sottolineato che distinzione tra filiformi e papille fungiformi è difficile quando si usa questo criterio vicino al margine della lingua. Ha dato due esempi di FP che varia notevolmente in elevazione, uno è 0,8 millimetri di altezza, mentre un altro è stato inferiore a 0,1 mm di altezza, ma aveva ancora due pori gusto che erano chiaramente osservati 18. Questa osservazione è stata anche seguiti e confermato da Shahbake et al. 4

Queste definizioni e le loro eccezioni riportate mostrano che il campo gusto ha da tempo riconosciuto l'inconsistenza nel caratterizzare FP e le carenze del protocollo comunemente usato da Miller & Reedy. Infatti, Miller & Reedy esortato il campo per definire ulteriormente le caratteristiche di FP 2. Abbiamo ipotizzato che marcatori davano peso diverso alle caratteristiche e priorità della loro importanza in modo diverso quando papillae non è riuscito a soddisfare ogni criterio, ad esempio quando una papilla era grande e forma di fungo, ma macchiato blu. E 'stato motivato che gli investigatori degli studi precedentemente pubblicati probabilmente fatto lo stesso che, se combinati con campioni di piccole dimensioni, può spiegare i risultati variegati provenienti dall'uso di questo metodo.

Il governo di Taiwan Lab affrontato questa lacuna metodologica FP attraverso lo sviluppo di una linea guida che definisce ogni caratteristica utilizzando misurazioni oggettive e priorità le caratteristiche per indicare che prevale in analisi. Questo metodo è il tasto a dicotomica con caratteristiche chiare e distinte di FP per assicurare conteggi precisi e ripetibili da fotografie digitali della lingua Denver Papille Protocol (DPP),. DPP è un metodo proposto per standardizzare la Miller & Cannavò metodo utilizzato in precedenza, eliminando in tal modo l'interpretazione individuale e garantendo risultati più coerenti quando si analizza la densità FP. In questo modo, DPP può essere utilizzato per più fiducia determine il ruolo di FP nel gusto.

Le immagini scattate lingua dei soggetti sono stati analizzati dagli scienziati cittadini (Cannoniere) del laboratorio che sono i veri soggetti di questo studio. Il nucleo della Lab di scienziati cittadino è composto da membri della comunità che vanno in età (anni) da 16 a metà degli anni '80. Una relazione di valutazione sommativa commissionata dal Museo nel 2012 descrive cittadini scienziati come avere un forte interesse per la scienza e con due terzi dopo aver guadagnato una laurea in una disciplina scientifica 22. Cittadini scienziati candidati sono attualmente reclutati attraverso il passaparola, deve compilare con successo un processo di intervista con i volontari veterani al Museo, e sottoposti a un periodo di prova in mostra la salute permanente del Museo, Expedition salute, prima che abbiano la possibilità di fare domanda per una posizione in Lab. Una volta accettato nel laboratorio, gli scienziati dei cittadini sottoposti a una formazione di 12 settimane per ottenere la certificazione per l'iscrizione soggetto umanos. A seguito di tale certificazione, sono in grado di prendere i moduli di formazione su varie tecniche di laboratorio (ad esempio conteggio papille, estrazione del DNA) e le certificazioni aggiuntive e misure di controllo di qualità regolare, questi scienziati cittadini hanno la possibilità di partecipare attivamente alla analisi dei dati. Scienziati Citizen volontariamente il loro tempo e non sono compensati per il loro contributo al Museo.

Protocol

Le immagini segnati in questo studio sono stati raccolti come parte di un più ampio studio condotto in gusto Genetica del Gusto Lab presso il Museo di Denver della Natura e della Scienza (Museo) 10. I soggetti dello studio più ampio sono stati i visitatori del museo (n = 1195), di età compresa 18-93. Mentre i soggetti provenienti da sei dei sette continenti, i partecipanti erano principalmente di origine europea. I dati di ogni soggetto sono stati raccolti in una sessione di 30 minuti di laboratorio. The Western Institutional Review Board ha approvato il protocollo, il consenso informato scritto è stato dato, e soggetti volontariamente il loro tempo e non sono stati compensati per la loro partecipazione allo studio.

1. Raccolta dati

  1. Acquisizione Immagine
    1. Mostra sottopone una fotografia di come porre se stessi (Figura 1) e ciò che l'immagine catturata sarà simile.
      Figura 1 Figura 1: Acquisizione Immagine Posa.
    2. Soggetti diretti per asciugare loro lingua con un tovagliolo di carta a mano e lasciare la lingua sporgente dalle loro bocche.
    3. Applicare circa 3 ml di blu colorante alimentare ad una concentrazione 01:36 all'apice della lingua usando una sterile applicatore di rayon con una punta di 1 pollice. Avere soggetti ritornano lingua alla bocca e deglutire per rimuovere l'eccesso di tintura.
    4. Avere soggetti si pongono come mostrato in Figura 1, con il mento sulle mani e gomiti appoggiati su un tavolo per la stabilità. Soggetti diretti di estendere la propria lingua una distanza comoda e sicura delicatamente fra i denti.
    5. Aderire un 2,5 centimetri pezzo di carta da filtro con un diametro ritaglio circolare 10 millimetri punzonati in essa alla punta anteriore del lato sinistro della lingua vicino alla linea mediana (vedi Figura 1).
    6. Prendere almeno tre immagini ravvicinate della lingua, capturing l'intero 10 mm Finestra circolare per garantire la visualizzazione di tutti FP all'interno di tale zona. Utilizzare l'impostazione macro di un punto e sparare fotocamera digitale di alta qualità collegato a un treppiede per la stabilità.
      1. Ingrandite nella misura in cui l'intero ritaglio è fotografato mentre ancora nel range di zoom raccomandato della fotocamera. Assicurarsi che il piano della lente fotocamera è parallelo al piano della linguetta e che il ritaglio appare circolare nella foto anziché oblunga. Rivedere le foto per assicurare che siano di alta qualità e utili per il conteggio.
  2. Seleziona immagine e preparazione
    1. Carica le foto sul computer.
    2. Delle immagini scattate della lingua di stesso soggetto, selezionare solo uno per ulteriori analisi sulla base di una chiara definizione tra le strutture sulla lingua al di zoom più alto e l'angolo minimo distorta in modo che la lingua è ampia e piatta verso la telecamera.
    3. Apri l'immagine raw selezionata nella open source in modoftware, ImageJ. Clicca su "Plugins" e nel menu a tendina di scorrimento per "Analizza" e fare clic su "Counter Cell." Quando l'cella si apre, fare clic su "inizializzare" per collegare l'immagine al contatore delle cellule.
      Nota: Qui, utilizzare ImageJ 1.45 sec con la versione a 32 bit Java 1.6.0_10.
      1. Utilizzare un ingrandimento standard del 50% per la coerenza tra marcatori e per l'uso in successive fasi di segnare FP. Spostare questa immagine sul lato sinistro dello schermo accanto al contaglobuli. Questa immagine verrà indicato come copia A (vedi figura 2, lato sinistro dello schermo).
  3. Aprire una seconda copia dell'immagine grezza (copia B) per misurare i diametri delle papille essere quantificato. Zoom avanti e indietro come necessario per la preferenza del capocannoniere individuale per tutto il processo di punteggio. Spostare il copia al lato destro dello schermo in modo le due copie non sono accidentalmente confuso. (Vedi figura 2, lato destroschermo)
  4. Fare clic sullo strumento Linea. Utilizzando copia B, zoom in quanto necessario per disegnare con precisione un diametro attraverso il cerchio interno 10 mm di carta da filtro in qualsiasi angolazione e fare clic su "Analizza" e "Set Scale." Compilare il "Noto Distanza" essere "10 . "Verificare che la scala sia corretta, misurando un angolo alternativo e assicurare la gamma di diametri è compreso tra 9,8-10,2 mm. Se non lo è, ripetere questo passaggio.

Figura 2
Figura 2: copia A e B. Copy Copy A (sinistra) è collegato alla finestra contaglobuli e rimane a 50% di ingrandimento di coerenza da marcatore per scorer mentre copia B (destra) può essere ingrandita alla preferenza dell'individuo.

2. Segnare FP Utilizzando il Denver Papille protocollo dicotomica Key

  1. Per ogni candidato papilla, utilizzare la seguente chiave dicotomica (passo 2,2-2,5) in dettaglio i criteri per determinare se si tratta di un FP. Fare riferimento alla Figura 3 per una visuale di papille che sono classificati come FP e per quelli che sono respinti in ogni fase del processo.
    Figura 3 Figura 3: FP vs Rifiutato Papille. La figura 3a è una lingua con diverse qualifiche FP mentre 3b-3e hanno cerchiato aree che violano ogni regola. (3b) zona è amorfo; (3c) papille sono troppo piccoli; 3d) papilla è blu rispetto a quelli che lo circonda, (3e) papilla è incassata rispetto a quelli intorno.
  2. Forma
    1. Determinare se la papilla candidato è amorfo (informe). Al 50% di zoom vedere se c'è una forma geometrica comunemente riconosciuto (ovale, cubico, rotondo).
    2. Se vi è una forma geometrica (vedi figura 3a), passare al punto 2.3.
    3. Se there non è la forma geometrica (vedi figura 3b), andare alla finestra bancone cellulare e fare clic su "Tipo 1" On copia A (50% dello zoom), fare clic sulla papilla candidato per contrassegnare come amorfo e non un FP. Cliccando su tipi 1-4 in questo e in fasi successive consente marcatori di sapere che hanno affrontato tutte le papille candidato e categorizza quale regola violata quando respinge una struttura che sarà di aiuto nella discussione al punto 2.7.2.
  3. Colore
    1. Fare riferimento alla copiare A al 50% zoom e determinare se vi è una differenziazione del colore sulla superficie della lingua. Se è così, continuare con il prossimo 2.3.2. In caso contrario, non usare il colore come un fattore determinante; passare al punto 2.4.
    2. Determinare se la papilla candidato è più leggero rispetto al tessuto o papille circonda (vedi Figura 3a). Se una parte della papilla candidato è rimasto rosa o macchiato più leggero, passare al punto 2.4.
    3. Se la papilla candidato è blu e le papille circostanti sonopiù leggero (si veda la Figura 3c), andare alla finestra bancone cella e scegliere "Tipo 2" sul bancone cellulare. Su copia A, fare clic sul candidato da contrassegnare come troppo blu e non un FP.
  4. Taglia
    1. Utilizzando copia B, zoom alla distanza dove si può vedere comodamente la sagoma della papilla candidato.
    2. Fare clic sullo strumento Linea e misurare attraverso la dimensione più lunga della papilla candidato. Fare clic su "Analizza" e poi "misura". Se la lunghezza misurata è di 0,5 mm o maggiore (vedere Figura 3a), passare al punto 2.5.
    3. Se la lunghezza misurata sia o meno 0,499 millimetri, misurare una volta per assicurare la precisione. Se è ancora 0,499 millimetri o meno (vedi F IGURA 3d), fare clic su "Tipo 3" nella finestra del contatore delle cellule e sulla copia A, fare clic sulla papilla candidato per contrassegnare come troppo piccola e non un FP.
  5. Recessione
    1. Utilizzando copia A, di valutare se la papilla candidato è o divisa cheight con il resto della lingua o elevata. Se la papilla è in una fessura, determinare la sua altezza rispetto alle altre strutture nella fessura, non la superficie della lingua. Se la papilla è inferiore al papille circonda (vedi Figura 3e), usare "Tipo 4" e sulla copia A, fare clic sulla papilla candidato per contrassegnare come incasso e non un FP.
    2. Se la papilla candidato è o di altezza uniforme con il resto della lingua o elevata (vedi figura 3a), utilizzare "Tipo 5" per scegliere e contrassegnare che questo è un FP. Questo totale tipo 5 è il punteggio FP crudo. Non chiudere le copie a questo punto come ImageJ non salva i punteggi sul bancone cellulare, né i segni colorati da tipi 1-5 su copia A.
  6. Risparmio Copia A
    1. Annotare in taccuino grezzo punteggio FP.
    2. Nella finestra contatore cellulare, fai clic su "Esporta immagine." Salva con il sistema di denominazione desiderata del laboratorio. Ciò consentirà l'apertura di copy A in futuro per mantenere i segni colorati da tipi 1-5. Non si salva il punteggio FP crudo.
  7. Controllo Qualità
    1. Punteggio ogni foto da due marcatori individuali e confrontare 7.
    2. Se il più alto FP punteggio grezzo è entro il 10% delle PF punteggio grezzo più basso, la media dei due punteggi insieme per un punteggio di consenso FP. Se i due punteggi grezzi FP differiscono di oltre il 10%, tirare entrambe le foto segnate sullo schermo.
      1. Utilizzare tipi di contatori 1-4 per aiutare nella discussione delle discrepanze e conferisce un punteggio consenso finale. Qualora non si raggiunga l'unanimità nel corso della discussione, prendersi una pausa dal punteggio. In un momento successivo, Rescore l'immagine e discutere. Se un consenso ancora non può essere raggiunto, tirare in un terzo marcatore. Chiedi loro di segnare l'immagine e il dialogo con gli altri due.

3. Formazione Marcatori per utilizzare DPP

  1. Sfondo per la formazione
    1. Avere due marcatori contare una serie di immagini,segnando individualmente e conferendo regolarmente per garantire che stavano usando gli stessi criteri. Solo quando i singoli conteggi erano sempre entro il 10% l'uno dall'altro per ciascuna delle immagini quando ha segnato è stato il metodo (finalizzato sopra) ritenuto accettabile e denominato DPP.
    2. Scegli 15 immagini ufficiali e 15 immagini di addestramento (Supplemental Figure 2-17) in ordine sequenziale a segnare. Se un'immagine è stata ritenuta non numerabile durante la selezione, ignorare l'immagine e scegliere il prossimo immagine sequenziale.
      Nota: Queste immagini variano in qualità e dimensioni sono state scelte mentre il Lab è stato ancora padroneggiare la corretta tecnica di fotografia. Una delle immagini selezionate è stato ritenuto non numerabile attraverso questo processo di conteggio primaria, ma è stato lasciato a far sì che marcatori sono stati in grado di fare quella chiamata in caso di necessità. Quindi ci sono 16 immagini date a tirocinanti anche se solo il 15 ha ottenuto le immagini.
    3. Utilizzando DPP, sono i marcatori suddetti contare le immagini di formazione 15 e creare un consensopunteggio per ciascuno.
    4. Dare tirocinanti le 15 immagini ufficiali e chiedere di valutazione con Miller & Reedy per creare una linea di base. Punteggi record. Condurre una formazione di gruppo che ha seguito passo 3.2. Una volta che passo 3.2 è stata completata, hanno i marcatori punteggio di nuovo le 15 immagini ufficiali e registrare i loro punteggi.
  2. Formazione Marcatori successive sul DPP
    1. Dare marcatori di formazione dell'immagine primo allenamento e dimostrare DPP per pochi papille su questa immagine. Discutere il ragionamento per la selezione o rifiutare ogni papilla come FP. Consentire ai tirocinanti di continuare a praticare punteggio per il resto di quella foto e conferiscono con il numero di consensi (per numero di consensi del GoT Lab e Tipo 1-5 marcatori, vedi figura complementare 1). Per questa foto discutere eventuali discrepanze a prescindere dal 10% per garantire la comprensione di DPP.
    2. Dare marcatori successivi la seconda immagine della formazione e li hanno valutazione con DPP.
    3. Se il tirocinante prima punteggio FP è entro dieciper cento del consenso istituita contare dalla sezione 3.1.3., consentono tirocinante di passare all'immagine successiva e ripetere i passaggi.
    4. Se il punteggio è di fuori del campo il dieci per cento, utilizzare segni colorati del tirocinante che rappresentano i tipi di 1-5 per capire e identificare l'inconsistenza e poi affrontare la comprensione discrepanti del DPP.
    5. Dare al tirocinante la possibilità di Rescore l'immagine e verificare il nuovo punteggio ancora una volta. In caso di successo, tirocinante sposta sulla prossima immagine fino al completamento di tutte le immagini.

Representative Results

Ecco una fotografia rappresentativa segnato da due marcatori singoli quando si utilizza la Miller & Reedy metodologia utilizzata per l'identificazione FP sulla base degli standard di campo di turno, grande, rosa o macchiato più leggero, ed elevato, e quindi la stessa fotografia segnato da due marcatori utilizzando DPP. I conteggi indicati sono rappresentativi della elevata varianza osservata utilizzando il metodo originale rispetto alla varianza inferiore usando DPP.

Figura 4

Figura 4:. Miller & Cannavò quantificazione vs DPP Quantificazione L'immagine a sinistra è rappresentativo di conteggi due marcatori "utilizzando la Miller & Reedy Method. L'immagine a destra rappresenta due conteggi marcatori utilizzando DPP. Il rosso è capocannoniere 1, giallo è capocannoniere 2, Green è marcatori 1 & 2.

Affidabilità statistica dei DPP è stato precedentemente studiata utilizzando un modello lineare misto di valutare la variabilità 10. In breve, per generare i dati per valutare il ruolo DPP gioca nella coerenza dei punteggi, immagini quindici sono stati segnati due volte. Nel primo lotto dei punteggi, DPP marcatori ingenui utilizzato il metodo di Miller & Reedy 2. I marcatori sono stati poi addestrati ad usare DPP e le immagini sono state individualmente rescored senza il passaggio consenso finale descritto nella sezione 2.7 dettagli Quality Control (Figura 5). Il set di dati punteggio FP è stato poi utilizzato nel modello misto per valutare le differenze combinate causa protocollo (Figura 6), la variabilità intra-marcatore e l'interazione tra i due. Questo modello ha mostrato una differenza significativa nel punteggio quando si utilizza il metodo Miller & Reedy rispetto al DPP (p-value <1 x 10 -6) con DPP portando ad un conteggio superiore di 6.99 (SE = 0,99); 5,2% della variabilità nel punteggio è dovuto alla formazione, 25,9% a causa di capocannoniere, e il rimanente dovutoalla variabilità specifica all'immagine 10. Avanti, per generare dati per determinare in-scorer variabilità, una serie di trenta immagini in ordine casuale sono stati segnati da 11 individui. All'insaputa di marcatori, questa serie di immagini incluso tre immagini che sono state ripetute. Abbiamo osservato una drastica differenza nella variabilità punteggio confrontando immagini distinte versusrepeated immagini.

Figura 5
Figura 5:. DPP-Naïve vs post DPP Formazione pannelli forniscono grafici a scatole di punteggi degli utenti su 15 immagini pre e post allenamento Denver Papille protocollo. Per ogni boxplot, debitamente compilata in cerchio indica la media, mentre un cerchio aperto indicano un outlier.

Figura 6
Figura 6:. Variazione Scorer Varianza Il grigio rappresenta tegli varianza per i singoli marcatori prima di formazione DPP. Il nero è il DPP formazione stesso marcatore palo.

Discussion

Utilizzando DPP, la varianza all'interno dell'immagine conta attraverso marcatori indipendenti e conta di entro-scorer è diminuita in modo significativo. Mentre questo metodo rende visiva analisi di densità FP senza videomicroscopia meno personale, va notato che questo metodo solo punteggi FP. DPP non può garantire che le strutture classificate come FP hanno pori gusto e sono quindi papille gustative, né che i conti sono riflettenti di vero gusto densità germoglio 20,23 .La natura di questo metodo è che stabilisce l'affidabilità attraverso la coerenza e precisione; tuttavia, può essere polarizzazione risultati in una direzione costante. Per testare la precisione rispetto ad altri metodi utilizzando una vera misura di gusto densità bud (ad esempio, videomicroscopia) estenderebbe oltre lo scopo di questo study.However, caratterizzando la morfologia di FP più stringente e la creazione di una chiave dicotomica, questo metodo si rivolge Miller & carica di reedy al campo che più caratterizzazione di FPdeve essere fatto in modo da avere il consenso alla loro morfologia e quantificazione 2. Inoltre, hanno indicato che questa descrizione potrebbe "chiarire alcune delle differenze tra soggetti e spiegare alcuni dei risultati disparati tra gli investigatori 2." Fornendo un metodo uniforme di quantificazione, molte delle discrepanze sul ruolo di FP nel gusto e Nutrizione- ricerca relativa potrà essere rettificato.

La chiave dicotomica può essere regolata per le diverse tecniche di cattura delle immagini. La distanza nota per la scala di misurazione può essere facilmente impostato al diametro utilizzato in ogni laboratorio e recessione può essere scontato se saran wrap o vetro sono stati collocati sulla lingua per la cattura dell'immagine. Nel GoT Lab, si è constatato che la lingua neutra fornito la migliore definizione delle papille. Ciò può essere dovuto alla quantità di luce in laboratorio che ha causato saran wrap o vetro per riflettere la luce nella fotocamera creando un bagliore che ha reso culivalu- difficile. Alcuni laboratori hanno detto che trovano il colorante più difficile da contare, ma il GoT Lab ha trovato un colorante alimentare blu diluito ad una concentrazione di 1:36 a condizione che il contrasto ideale tra fungiformi e papille filiformi sulla maggior parte delle lingue.

La creazione di una chiave dicotomica per la caratterizzazione FP consentirà per i ricercatori in differenti laboratori, utilizzando una varietà di metodi di acquisizione delle immagini, di analizzare costantemente le strutture sulla lingua e avere fiducia nella comunicazione dei loro risultati. Infine, l'uso di una chiave dicotomica può avere scopi in altri settori della metodologia scientifica in cui le qualità di strutture o oggetti stanno fornendo numeri incoerenti da studio a studio.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato in parte finanziato da Science Education Partnership Award (SEPA) R25 RR025066 tra 2008-2012 dal National Institutes of Health e il Centro Nazionale per la Ricerca Risorse. Grazie ai colleghi del settore gusto per la discussione da parte di letteratura, i nostri risultati e il feedback sull'uso di DPP in vari scenari di laboratorio: John Hayes, Sue Coldwell, Paul Breslin, Carla Schubert. Grazie anche a una leadership al Denver Museum of Nature & Science e il personale di supporto della scienza cittadino nei Genetica del gusto Lab all'interno Expedition Salute. Infine, grazie a tutti i nostri cittadini scienziati volontari per il loro tempo e dedizione per lo sviluppo e l'utilizzo di questo protocollo, tra cui: Orso Aragona, Mike Archer, Su Ataman, Michael Bagley, A'nette Bertrand, Diana Boyles, Wendy Covert, Sasha Dooley , Patty Drever, Jessica Ern, Laura Harmacek, Sean Hibbard, Joyce Hutchens, Matt Joo, Leta Keane, Willem Leenhouts, Stephania Lukjan, Ashley Matthews, Mike Mauser, Stephanie Miller, Hallie Morgan-Rodriguez, Griffin Scherma, Alyssa Schickedanz, Terri Simon, Dylan Thomas, Rudy Torres, Tyler Wilson, Diane Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10.3 megapixels) and P500 (12.1 megapixels) Nikon http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/ neither model appears to be available on the website any longer
Paper Hand Towels Kleenex https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

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References

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Denver Papille protocollo per l&#39;analisi Obiettivo papille fungiformi
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Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

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