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Neuroscience

Denver Papilas Protocolo para Objective Analysis de papilas fungiformes

doi: 10.3791/52860 Published: June 8, 2015

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para medir a densidade fungiformes papila das fotografias digitais. Este método baseia-se priorização e métricas característica objectiva para o trabalho descritivo original no papilas fungiformes por Miller & Reedy (1990).

Abstract

O objetivo do Denver Papilas protocolo é usar uma chave dicotômica para definir e priorizar as características das papilas fungiformes (FP) para garantir pontuação consistente entre marcadores. Este protocolo baseia-se fora de uma necessidade que surgiu a partir das duas últimas décadas de pesquisas gosto usando FP como um proxy para a densidade de poros gosto. Densidade FP tem sido historicamente analisados ​​utilizando de Miller & Reedy 1990 caracterizações de sua morfologia: redondo, manchado mais leve, grande e elevada. Neste trabalho, os autores avisado de que as definições mais estritas de morfologia FP precisava ser delineado. Apesar deste apelo à acção, o acompanhamento literatura tem sido escasso, com a maioria dos estudos que continuam a citar o trabalho original de Miller & Reedy. Por conseguinte, os relatórios de densidade de PF foram altamente variáveis ​​e, em combinação com amostras de pequenas dimensões, pode contribuir para as conclusões divergentes sobre o papel de FP na sensibilidade gosto. A genética da Lab Taste explorou esta aparente inconconsistência na contagem e descobriram que marcadores foram prioridade individualmente a importância dessas características de forma diferente e não tinha orientação para quando uma papila tinha algumas, mas não todas, as qualidades relatados de FP. O resultado dessa subjetividade é a contagem de PF altamente variáveis ​​de uma mesma imagem língua. O Denver Papilas protocolo foi desenvolvido para remediar essa consequência através do uso de uma chave dicotômica que mais define e prioriza a importância das características apresentadas por Miller & Reedy. O método proposto poderia ajudar a criar uma forma padrão para quantificar FP para pesquisadores da área de gosto e estudos nutricionais.

Introduction

Papilas são os solavancos visíveis na superfície da língua. Existem quatro tipos de papilas fungiformes: (FP), foliate, circumvallate, e filiformes. Enquanto papilas filiformes são espalhados sobre a superfície da língua, circunvaladas estão localizados apenas na parte posterior da língua, e estanhar são encontrados nos lados. Em contraste, FP estão localizados para a parte frontal da língua. FP, foliate, e papilas gustativas circumvallate são considerados, porque eles têm o potencial para conter paladar enquanto filiforme não. As papilas gustativas são aglomerados de células responsáveis ​​pela detecção de saborizantes químicas e transduzir os estímulos em um sinal gustativa no cérebro. Saliva e alimentos moléculas entram nas papilas gustativas através de aberturas chamados poros gustativas onde as moléculas de sabor, em seguida, têm o potencial de ativar células gustativas.

Curiosamente, existem grandes diferenças individuais na densidade gosto de gemas, como observado pela primeira vez em um estudo histológico de línguasde 18 cadáveres (Miller, 1988) 1. Papilas gustativas em si não são visíveis na superfície da língua, no entanto, poros gustativas são visíveis quando se usa técnicas de ampliação, iluminação, e de coloração adequadas que levaram Miller & Reedy (1990) para desenvolver um método para identificar poros de gosto e papilas fungiformes usando videomicroscopia na vida seres humanos 2. Um número de laboratórios de ter modificado a sua técnica videomicroscopia original, usando a fotografia ainda e pouca ou nenhuma ampliação. No entanto, desde papilas fungiformes são muito mais fáceis de visualizar do que são poros que utilizam estas últimas técnicas, laboratórios virou-se para contar papilas fungiformes no lugar de poros gustativas. Ao fazê-lo, assume-se que a densidade da papila fungiforme é uma medida de substituição razoável para a densidade de poros gosto, embora muitos papilas fungiformes não contêm poros de gosto ou paladar 3; não só são FP mais visíveis e acessíveis do que circumvallate e foliate papilas, mas a sua captura de imagem é menos time consumindo sabor do que a análise de poros através do método alternativo de videomicroscopia 2,4. Em 1990, Miller & Reedy usou essa técnica para descobrir que gosto densidades poros estão correlacionados com as densidades de PF 3, que foi corroborada em Bartoshuk et al. 5 Além dessa relação anatômica, Miller & Reedy também descobriram que os oito indivíduos no superior metade da distribuição da densidade de poros gosto também classificado sacarose, NaCl, e propiltiouracil (PROP) como significativamente mais intenso do que fizeram os outros oito indivíduos 3. Trabalho subsequente por Bartoshuk et al. (1994) observaram uma correlação entre a intensidade de sabor suprathreshold PROP e densidade fungiformes papila, bem como a densidade de poro sabor, em 42 sujeitos 5. Este método conveniente levou a estudos influentes relatando que indivíduos cuja língua tem muitas papilas provocar uma reação mais forte para muitos tastants, incluindo o tastants amargo feniltiocarbamida (PTC) e PROP 6,7.

PTC e PROP são tastants bem pesquisados ​​oft usados ​​devido à clara ligação entre a sensibilidade gustativa fenótipo de uma pessoa e seu genótipo. Estudos populacionais têm mostrado que pessoas que têm o diplotype homozigoto recessivo do gene, TAS2R38, têm uma sensibilidade significativamente menor do que para sustentar portadores da variante dominante ou heterozigoto do gene 8-10. Este fenômeno hereditário foi relatada pela primeira vez em 1932, quando Arthur L. Fox anunciou sua descoberta de "gosto cegueira" para PTC 11. Entre as pessoas capazes de provar estes compostos amargos, a intensidade do sabor relatado pode variar em qualquer lugar de um pouco desagradável para terrivelmente amargo 6. Para ter em conta para a variância que não pode ser explicado por TAS2R38, a teoria foi apresentada que poderia ser atribuído à densidade de FP na língua 4.

Como a pesquisa gosto progrediu, o field foi dividido em duas escolas de pensamento em torno desta teoria sobre o papel do FP e sensibilidade sabor amargo. Embora muitos estudos corroboraram a reivindicação original que a densidade FP é um fator na PROP sensibilidades 4,6,12,13, houve um pequeno, mas importante contingência que encontrou evidências para refutá-lo, relatando uma incapacidade de replicar o papel 10, 14,15,16. Delwiche et ai. (2001) advertiu que a tendência é altamente variável; Densidade FP faz conta não uniformemente as diferenças de sensibilidade amargura entre os indivíduos, e só foi demonstrável para indivíduos com, pelo menos, uma sensibilidade moderada a prop 7. Em adição à utilização do método de Miller & Reedy menos rigorosamente definida como quantificar FP, é importante notar que, com excepção da descendência Beaver Dam 15 Estudo realizado por Fischer et ai., A maior parte dos estudos acima teve pequena amostra tamanhos que podem também contribuir para resultados inconsistentes sobreo papel do FP no paladar.

Resumidamente, em Miller & Reedy papel metodologia seminal (1990), os autores manchado línguas azuis para quantificar porque FP FP permanecer rosa enquanto papilas filiformes absorver o corante e ficar azul. Eles classificaram FP como "estruturas arredondadas rosa cerca de 0,5 mm de diâmetro 2". Embora os autores aconselhável que antes de usar este método para trabalho de análise, características FP deve ser mais estritamente definido e concluiu que a variação já observado na literatura "pode ​​ser atribuída a diferentes populações sujeitas, métodos diferentes e diferentes investigadores" 2, a sua pesquisa levou às características comumente aceitos que FP estão ao redor 17,18, grande 2, rosa ou manchados mais leve 2 e elevada 4. À primeira vista, essas características aparecem muito para a frente. Nos Genética do Lab Taste (GOT Lab ou Lab), o uso da conhecihod foi complicado por tentativas individuais dos marcadores qualificar e priorizar a importância das características acima, quando alguns, mas não todos, as características estavam presentes. Estas complicações incluído pequeno papilas rosa que apareceu no meio de muito maior papilas; toda a língua absorver o corante azul eliminando assim a classificação com base na variação da cor; papilas oblonga em vez de rodada; e línguas tendo nenhuma variação em alçado, as quais contribuiu para marcadores de relatórios contagens FP amplamente variadas da mesma imagem.

Estas variações na análise nos levou a revisar a literatura, a fim de identificar a subjetividade, identificar eventuais exceções às características FP comummente aceites e, finalmente, elaborar um protocolo de forma precisa e objetiva definir e marcar FP.

Em primeiro lugar, forma FP é descrito na literatura como um arredondado, de cogumelo estrutura 17,18. No entanto, com exceção notávelíons também foram mencionados. Miller ressaltou que o termo "fungiformes" é um equívoco e que muitos FP não são em forma de cogumelo, mas podem variar muito em tamanho e morfologia 18. Melis et ai. (2013) também descreveu vários papilas que foram considerados "distorcida", onde o diâmetro FP numa direcção era pelo menos dois desvios padrão mais tempo do que na outra direcção 19. Além disso, Cheng & Robinson descobriu que quando indicando FP por coloração, eles variaram de topo achatado alongado para 20 na aparência. Observando as excepções acima referidas, a caracterização de um FP sendo rodada e aparece em forma de cogumelo uma definição demasiado estreita.

Em segundo lugar, cor FP é descrito como "círculos cor de rosa contra um fundo azul" 7 após a coloração da língua com corante azul. Apesar de coloração mais clara foi o critério mais consistente de FP por toda a literatura ainda não era um qualificador uniforme. Cheng & ; Robinson observou que FP nem sempre foram levemente manchado, tornando a identificação difícil e incerto 20. Parece então que as línguas absorver corante de forma diferente e, enquanto o contraste é evidente em muitas línguas, alguns se tornam inteiramente azul sem distinção enquanto outros perdem imediatamente qualquer vestígio de corante azul 21.

A terceira característica, tamanho FP, foi bastante consistente entre os papéis, variando de 0,5 mm a 0,97 milímetros 6,18. Na literatura Miller notar-se que havia dois intervalos de tamanho de papilas da anterior dorsal da língua. As papilas com diâmetros maiores eram principalmente fungiformes papilas e cônica, enquanto as papilas com um diâmetro menor foram principalmente filiforme 18. No entanto, com a excepção de o Offspring Study 21 Beaver Dam, tamanho não aparecem para determinar se uma estrutura é um FP na literatura, mas foi previsto papilas já classificados como "fungiformes".

_content "> Finalmente, a elevação é listado como o quarto FP característica 4 embora Miller ressaltou que distinção entre filiformes e fungiformes papilas é difícil quando se utiliza este critério perto da margem da língua. Ele deu dois exemplos de FP que variaram muito em elevação, uma sendo 0,8 mm de altura, enquanto o outro era inferior a 0,1 mm de altura, mas ainda tinha dois poros gustativas que foram claramente observadas 18. Esta observação foi também seguido para cima e confirmada por Shahbake et al. 4

Essas definições e suas exceções relatadas mostram que o campo gosto há muito reconheceu a inconsistência na caracterização FP e as deficiências do protocolo comumente usado de Miller & Reedy. Na verdade, Miller & Reedy exortou o campo para definir melhor as características de FP 2. Nossa hipótese é que artilheiros estavam dando peso diferente às características e priorizar sua importância de maneira diferente quando papillae não conseguiu cumprir todos os critérios, como quando uma papila era grande e em forma de cogumelo, mas manchado azul. Foi fundamentado que os investigadores dos estudos publicados anteriormente provavelmente fez o mesmo que, quando combinado com amostras de pequenas dimensões, pode contribuir para os resultados variados vindo de utilização deste método.

O Governo de Taiwan Lab abordou esta lacuna na metodologia FP através do desenvolvimento de uma diretriz que define cada característica meio de medidas objetivas e prioriza as características para indicar que tem precedência em análise. Este método é o Denver Papilas Protocol (DPP), uma chave dicotômica com características claras e distintas de FP para garantir contagens precisas e repetíveis de fotografias digitais da língua. DPP é uma proposta de método para padronizar o método de Miller & Reedy utilizado anteriormente, eliminando, assim, a interpretação individual e assegurar resultados mais consistentes ao analisar densidade FP. Ao fazê-lo, DPP pode ser usado para mais confiantemente determine o papel do FP no paladar.

As imagens tomadas língua dos sujeitos foram analisados ​​pelos cientistas do cidadão (marcadores) do Lab que são os verdadeiros sujeitos do estudo. Núcleo de cientistas do cidadão do Lab é composta por membros da comunidade com idades (em anos) de 16 a meados dos anos 80. Um relatório de avaliação sumativa encomendada pelo Museu em 2012 descreve cientistas cidadãos como tendo um forte interesse em ciência e com dois terços tendo ganho um diploma universitário em uma disciplina científica 22. Cientistas do cidadão candidato estão actualmente recrutados através da palavra da boca, deve concluir com sucesso um processo de entrevista com os voluntários veteranos no Museu, e passam por um período experimental em exposição permanente em saúde do Museu, Expedition Saúde, antes que eles tenham a oportunidade de aplicar para uma posição em o Lab. Uma vez aceito no laboratório, cientistas cidadãos passam por um treinamento de 12 semanas para tornar-se certificado para se inscrever sujeito humanos. Seguindo essa certificação, eles são capazes de tomar módulos de formação em várias técnicas no laboratório (por exemplo, contagem de papilas, extração de DNA) e seguintes certificações adicionais e medidas de controle de qualidade regulares, estes cientistas cidadãos têm a oportunidade de participar activamente na análise dos dados. Cientistas cidadãos doam seu tempo e não são compensadas por suas contribuições para o Museu.

Protocol

As imagens marcou neste estudo foram coletados como parte de um estudo maior realizado em sabor a Genética do Lab Taste no Museu Denver of Nature & Science (Museu) 10. Sujeitos do estudo eram maiores visitantes do museu (n = 1.195) na faixa etária 18-93. Enquanto indivíduos vieram de seis dos sete continentes, os participantes eram principalmente de descendência européia. Os dados de cada sujeito foi coletado em uma sessão de laboratório 30 min. The Western Institutional Review Board aprovou o protocolo, consentimento informado por escrito foi dado, e indivíduos ofereceram seu tempo e não foram compensados ​​pela sua participação no estudo.

1. Coleta de Dados

  1. Captura de Imagem
    1. Mostrar submete uma fotografia de como colocar a si mesmos (Figura 1) e que a imagem capturada será semelhante.
      Figura 1 Figura 1: Image Capture Pose.
    2. Assuntos diretos para secar sua língua com uma toalha de papel mão e deixar língua para fora de suas bocas.
    3. Aplique aproximadamente 3 ml de corante azul a uma concentração de 1:36 do ápice da língua usando uma solução estéril, de rayon com um aplicador de ponta de 1 polegada. Têm assuntos retornar língua para a boca e engolir para remover o excesso de corante.
    4. Já sujeitos representar-se como mostrado na Figura 1, com o seu queixo na suas mãos e cotovelos apoiados sobre uma mesa para a estabilidade. Assuntos diretos para estender sua língua uma distância confortável e segura-lo suavemente entre os dentes.
    5. Aderem um pedaço 2,5 centímetros de papel de filtro com um diâmetro de 10 milímetros recorte circular perfurado em que a ponta do anterior do lado esquerdo da lingueta ao lado da linha média (ver Figura 1).
    6. Tome pelo menos três imagens em close-up da língua, capturing toda a 10 milímetros entalhe circular para garantir a visualização de todo o FP dentro dessa área. Use a configuração macro de uma câmera de apontar e disparar digital de alta qualidade montada num tripé para a estabilidade.
      1. Zoom na medida em que todo o recorte é fotografado enquanto ainda dentro da faixa de zoom recomendada da câmera. Certifique-se de que o plano da lente da câmara é paralelo ao plano da língua e que o entalhe circular aparece na foto em vez de oblonga. Reveja fotos para garantir que eles são de alta qualidade e útil para a contagem.
  2. Seleção de Imagens e Preparação
    1. Enviar as fotos para o computador.
    2. Das imagens tiradas da língua do mesmo assunto, selecionar apenas uma para posterior análise com base na clara definição entre as estruturas na língua no zoom mais alto eo ângulo menos distorcida também a língua é ampla e plana em direção à câmera.
    3. Abra a imagem crua selecionado na fonte aberta tãoftware, ImageJ. Clique em "Plugins" e no livro menu suspenso para "Analisar" e clique em "Counter celular." Quando o contador de células abrir, clique em "Inicializar" para conectar-se a imagem para o contador de células.
      Nota: Aqui, use ImageJ 1.45 segundos com 32 bits Java versão 1.6.0_10.
      1. Use uma ampliação padrão de 50% para a coerência entre marcadores e para uso em etapas subseqüentes para marcar FP. Mova esta imagem para o lado esquerdo da tela, ao lado do contador de células. Esta imagem será referido como exemplar A (ver figura 2, do lado esquerdo da tela).
  3. Abra uma segunda cópia da imagem em bruto (cópia B) para medir os diâmetros das papilas serem quantificados. Zoom in e out, conforme necessário para a preferência do marcador indivíduo ao longo do processo de pontuação. Mova essa cópia para o lado direito da tela para que as duas cópias não são acidentalmente confuso. (Veja a Figura 2, lado direitoscreen)
  4. Clique na ferramenta de linha. Usando cópia B, zoom in, tanto quanto necessário estabelecer com precisão um diâmetro em toda a 10 milímetros círculo interno do papel de filtro em qualquer ângulo e clique em "Analisar" e "Set Scale." Preencha o "Distância Known" ser "10 ". Verifique a escala é correto medindo um ângulo alternativo e assegurar a faixa de diâmetro está entre 9,8-10,2 mm. Se não for, repita este passo.

Figura 2
Figura 2: Copiar A e B. Copiar Copiar A (esquerda) está ligada a janela do contador de células e permanece em 50% de ampliação para a consistência do artilheiro artilheiro enquanto a cópia B (direita) pode ser ampliada com a preferência do indivíduo.

2. Scoring FP Usando o Denver Papilas Protocolo Dicotômica Key

  1. Para cada papil candidatola, use a seguinte chave dicotómica (passo 2,2-2,5) detalhando os critérios para determinar se ele é um FP. Veja a Figura 3 para um visual de papilas que são classificados como FP e para aqueles que são rejeitados em cada passo do processo.
    Figura 3 Figura 3: FP vs. Rejeitado papilas. Figura 3a é uma língua com vários qualificação FP enquanto 3b-3e têm circulado áreas que violem cada regra. (3-B) área é amorfo; (3c) papilas são muito pequenas; 3d) papila é azul em comparação com aqueles que o rodeiam, (3e) papila é rebaixado em comparação com aqueles em torno dele.
  2. Forma
    1. Determinar se a papila candidato é amorfo (informe). Em 50% zoom ver se há uma forma geométrica comumente reconhecido (oval, cubóide, e volta).
    2. Se houver uma forma geométrica (ver Figura 3a), passar para o passo 2.3.
    3. Se there há forma geométrica (ver figura 3b), vá para a janela do contador de células e clique em "Tipo 1." On cópia A (50% de zoom), clique na papila candidato para marcá-lo como um amorfo e não a FP. Clicando sobre tipos 1-4 neste e passos subsequentes permite marcadores para saber que eles têm abordado todos papilas candidato e classificará qual regra foi violada ao rejeitar uma estrutura que ajudará na discussão na etapa 2.7.2.
  3. Cor
    1. Referem-se a copiar um zoom a 50% e determinar se existe qualquer diferenciação de cor através da superfície da língua. Se assim for, continue para a próxima 2.3.2. Se não, não usar a cor como fator determinante; mover-se para o passo 2.4.
    2. Determinar se a papila candidato é mais leve do que o tecido circundante ou papilas (ver Figura 3A). Se qualquer parte da papila candidato permaneceu rosa ou manchados mais leves, passar para o passo 2.4.
    3. Se a papila candidato é azul e as papilas circundantes sãomais leve (ver Figura 3c), vá para a janela do contador de células e clique em "Tipo 2" no contador de células. Na cópia A, clique no candidato de marcar como também azul e não a FP.
  4. Tamanho
    1. Usando cópia B, aumentar o zoom para a distância onde se pode ver confortavelmente o contorno da papila candidato.
    2. Clique na ferramenta de linha e medir em toda a dimensão mais longa da papila candidato. Clique em "Analisar" e depois "medida". Se a distância medida é de 0,5 mm ou mais (veja a Figura 3-A), mova para a etapa 2.5.
    3. Se o comprimento medido é ou menos 0,499 milímetros, medida mais uma vez para assegurar a precisão. Se ainda é menos 0,499 milímetros ou (veja F IGURA 3d), clique em "Tipo 3" na janela do contador de células e na cópia A, clique na papila candidato para marcá-lo como muito pequeno e não uma FP.
  5. Recessão
    1. Usando cópia A, avaliar se o candidato é ou papila uniforme que eleight com o resto da língua ou elevada. Se a papila está numa fenda, determinar a sua altura em relação a outras estruturas na fenda, e não a superfície da língua. Se a papila é menor do que as papilas em torno dela (veja a Figura 3e), use "Tipo 4" e na cópia A, clique na papila candidato para marcá-lo como recesso e não a FP.
    2. Se a papila candidato é ou de altura uniforme com o resto da língua ou elevada (ver Figura 3a), use "tipo 5" clicar nele e marcar que este é um FP. Este total tipo 5 é a pontuação FP-primas. Não feche as cópias neste momento como ImageJ não salva as pontuações no contador de células nem as marcas coloridas de tipos 1-5 em cópia A.
  6. Saving Copiar A
    1. Anote no caderno pontuação FP-primas.
    2. Na janela do contador de células, clique em "Exportar imagem." Salvar com o sistema de nomeação desejada do laboratório. Isto irá permitir que a abertura da tiray Uma no futuro, para reter as marcas coloridas de tipos 1-5. Não vai salvar a pontuação FP-primas.
  7. Controlo De Qualidade
    1. Pontuação cada foto por dois marcadores individuais e comparar 7.
    2. Se o escore bruto superior FP é de 10% da FP escore bruto mais baixo, a média dos dois resultados juntos para uma pontuação de consenso FP. Se os dois escores brutos PF diferem em mais de 10%, puxe ambas as fotos marcou na tela.
      1. Use contador tipos 1-4 para ajudar na discussão de discrepâncias e conferir a uma pontuação final de consenso. Se não houver consenso pode ser alcançado durante a discussão, fazer uma pausa de pontuação. Em um momento posterior, Rescore a imagem e discutir. Se um consenso ainda não pode ser alcançado, puxe em um terceiro marcador. Peça-lhes para marcar a imagem e diálogo com os outros dois.

3. Formação Artilheiros usar DPP

  1. Fundo para a Formação
    1. Ter dois artilheiros contar uma variedade de imagens,marcar individualmente e conferir regularmente para garantir que eles estavam usando os mesmos critérios. Só quando as contagens individuais foram consistentemente dentro de 10% do outro para cada as imagens quando marcou foi o método (finalizado acima) considerado aceitável e denominado DPP.
    2. Escolha 15 imagens oficiais e 15 imagens de formação (Supplemental Figuras 2-17) em ordem seqüencial para marcar. Se uma imagem foi considerada incontável durante a seleção, pule a imagem e escolha próxima imagem sequencial.
      Nota: Estas imagens variam em qualidade e tamanho que eles foram escolhidos enquanto o laboratório ainda estava dominando a técnica de fotografia correta. Uma das imagens selecionadas foi considerada incontável através deste processo de contagem primário, mas foi deixado em assegurar que pontuadores foram capazes de fazer essa chamada quando necessário. Portanto, há 16 imagens dadas aos formandos que apenas 15 marcou imagens.
    3. Usando DPP, foram os marcadores acima mencionados contar as imagens de treinamento 15 e criar um consensopontuação para cada um.
    4. Dê estagiários as imagens oficiais 15 e pedir para marcar usando Miller & Reedy para criar uma linha de base. Pontuações recordes. Realizar um treinamento do grupo que seguiu passo 3.2. Uma vez que passo 3.2 foi concluída, têm os artilheiros marcar as imagens oficiais 15 novamente e gravar suas pontuações.
  2. Treinando Artilheiros subsequentes sobre DPP
    1. Dê marcadores de formação a imagem de treinamento em primeiro lugar e demonstrar DPP para alguns papilas sobre esta imagem. Discutir raciocínio para selecionar ou rejeitar cada papila como um FP. Permitir que os formandos a continuar praticando placar para o resto da fotografia e conferenciar com o número consenso (por número consenso do Governo de Taiwan e Lab Escreva 5/1 marcadores, veja a Figura 1 suplementar). Para esta foto discutir quaisquer discrepâncias, independentemente dos 10% para garantir a compreensão do DPP.
    2. Dê artilheiros subsequentes a imagem Treinamento segunda e tê-los registos com DPP.
    3. Se o estagiário pontuação FP-prima é dentro de dezpor cento do consenso estabelecido contar da seção 3.1.3., permitir estagiário para passar para a próxima imagem e repita os passos.
    4. Se o resultado estiver fora do intervalo de dez por cento, use marcas coloridas do estagiário que representem tipos 1-5 para entender e identificar a inconsistência e, em seguida, abordar entendimento discrepante de DPP.
    5. Dê o estagiário a oportunidade de Rescore a imagem e verificar a nova pontuação mais uma vez. Se for bem sucedido, estagiário se move para a próxima imagem até que todas as imagens sejam concluídas.

Representative Results

Aqui está uma fotografia representativa marcado por dois marcadores individuais ao usar o Miller & Reedy metodologia comumente utilizada para a identificação FP com base nas normas de campo de volta, grande, rosa ou manchados mais leve, e elevado, e, em seguida, a mesma fotografia marcado por dois artilheiros usando DPP. As contagens apresentados são representativos da alta variância observada usando o método original em comparação com o menor variância utilizando DPP.

Figura 4

Figura 4:. Miller & Reedy Quantificação vs DPP Quantificação A imagem à esquerda é representativa das contagens dois marcadores 'usando o método de Miller & Reedy. A imagem à direita representa duas contagens apontador usando DPP. Red é o melhor marcador 1, Amarelo é o melhor marcador 2, Verde é artilheiros 1 & 2.

Fiabilidade estatística da DPP foi previamente estudado através de um modelo linear misto para avaliar a variabilidade 10. Resumidamente, para gerar dados para avaliar o papel DPP desempenha na consistência dos escores, as imagens foram quinze marcou duas vezes. No primeiro lote de partituras, DPP artilheiros ingênuos usou a Miller & Reedy método 2. Os artilheiros foram então treinados para usar DPP e as imagens foram recodificados individualmente sem a etapa consenso final descrito na seção 2.7 detalha Controle de Qualidade (Figura 5). O conjunto de dados de pontuação FP foi, em seguida, usado no modelo misto para avaliar as diferenças devido à combinadas protocolo (Figura 6), a variabilidade dentro-de-marcador e a interacção entre as duas. Este modelo mostrou uma diferença significativa na pontuação quando se utiliza o método de Miller & Reedy comparação com DPP (p-valor <1 x 10 -6) com DPP levando a uma maior contagem por 6,99 (SE = 0,99); 5,2% da variabilidade na pontuação foi devido ao treinamento, 25,9%, devido ao marcador, e os restantes devidoà variabilidade específica para a imagem 10. Em seguida, para gerar dados para determinar a variabilidade dentro-de-marcador, uma série de trinta imagens por ordem aleatória foram marcados por 11 indivíduos. Sem o conhecimento de marcadores, esta série de imagens incluiu três imagens que foram repetidas. Observou-se uma diferença drástica na variabilidade pontuação comparando imagens distintas versusrepeated imagens.

Figura 5
Figura 5:. DPP-Naïve vs Publicar DPP Formação Painéis fornecer boxplots de pontuação avaliador para 15 imagens pré e pós treinamento Denver Papilas protocolo. Para cada boxplot, um círculo preenchido indica a média enquanto um círculo aberto indicam um outlier.

Figura 6
Figura 6:. Mudança no marcador Variance A cinza representa tele variância para marcadores individuais anteriores à formação DPP. O preto é a formação mesmo posto marcador DPP.

Discussion

Usando DPP, a variância dentro de imagem conta através de marcadores independentes e contagens de dentro de-artilheiro diminuiu significativamente. Enquanto este método faz análise de densidade FP visuais sem videomicroscopia menos subjetiva, deve notar-se que este método só pontuações FP. DPP não pode garantir que as estruturas classificadas como FP têm poros gosto e são, portanto, papilas gustativas nem que as contagens são reflexo do verdadeiro sabor densidade bud 20,23 .A natureza deste método é que ele estabelece confiabilidade através da consistência e precisão; no entanto, pode ser polarização resulta numa direcção consistente. Para testar a exactidão em relação a outros métodos que utilizam uma verdadeira medida da densidade broto sabor (por exemplo, videomicroscopia) se estender para além do âmbito do presente study.However, por caracterizar a morfologia de FP mais rigorosamente e criação de uma chave dicotómica, este método elimina Miller & carga de Reedy para o campo que mais caracterização de FPprecisa de ser feito de modo a ter consenso sobre a sua morfologia e quantificação 2. Além disso, eles indicaram que essa caracterização pode "esclarecer algumas das diferenças entre os temas e explicar alguns dos resultados díspares entre os pesquisadores 2." Ao fornecer um método uniforme de quantificação, muitas das discrepâncias sobre o papel do FP no gosto e à nutrição investigação relacionada podem ser rectificadas.

A chave dicotômica pode ser ajustada para as diferentes técnicas de captura de imagem. A distância conhecida para a escala de medição pode ser facilmente ajustado para o diâmetro utilizado em cada laboratório e recessão pode ser descontado se saran ou de vidro foram colocados sobre a língua para captura de imagem. No Lab tem, verificou-se que a língua neutra desde a melhor definição de papilas. Isto pode ser devido à quantidade de luz no laboratório que causou saran ou de vidro para refletir a luz de volta para a câmera criando um olhar que fez jumentossment difícil. Alguns laboratórios disseram que encontrar o corante mais desafiador para contar, mas a Lab GoT encontrado um corante azul alimento diluído numa concentração de 1:36 desde o contraste ideal entre fungiformes papilas filiformes e na maioria das línguas.

A criação de uma chave dicotômica para a caracterização FP permitirá a pesquisadores em laboratórios diferentes, usando uma variedade de métodos de captura de imagem, para analisar de forma consistente estruturas na língua e ter confiança na comunicação de seus resultados. Finalmente, o uso de uma chave dicotômica pode ter efeitos em outras áreas de metodologia científica, onde as qualidades de estruturas ou objetos estão fornecendo números inconsistentes de estudo para estudo.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte pela Science Education Partnership Award (SEPA) R25 RR025066 entre 2008-2012 dos Institutos Nacionais de Saúde e do Centro Nacional de Investigação Recursos. Obrigado a colegas no campo gosto pela discussão cuidadosa da literatura, nossos resultados e feedback sobre o uso de DPP em vários cenários de laboratório: John Hayes, Sue Coldwell, Paul Breslin, Carla Schubert. Obrigado também a liderança no Denver Museum of Nature & Science ea equipe de apoio à ciência do cidadão dentro dos Genética do Lab Taste dentro Expedition Saúde. Finalmente, obrigado a todos os nossos cientistas cidadãos voluntários para o seu tempo e dedicação ao desenvolvimento e utilização deste protocolo, incluindo: Urso Aragão, Mike Archer, Su Ataman, Michael Bagley, A'nette Bertrand, Diana Boyles, Wendy Covert, Sasha Dooley , Patty Drever, Jessica Ern, Laura Harmacek, Sean Hibbard, Joyce Hutchens, Matt Joo, Leta Keane, Willem Leenhouts, Stephania Lukjan, Ashley Matthews, Mike Mauser, Stephanie Miller, Hallie Morgan-Rodriguez, Griffin Scherma, Alyssa Schickedanz, Terri Simon, Dylan Thomas, Rudy Torres, Tyler Wilson, Diane Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
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References

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Denver Papilas Protocolo para Objective Analysis de papilas fungiformes
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Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

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