Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Denver Papiller Protokoll för objektiv analys av Fungiform Papiller

doi: 10.3791/52860 Published: June 8, 2015

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta fungiform papilla densitet från digitala fotografier. Denna metod bygger prioritering och objektiva karakteristiska mätvärden till den ursprungliga beskrivande arbetet fungiform papiller av Miller & Reedy (1990).

Abstract

Målet för Denver Papiller protokollet är att använda en dikotoma nyckel för att definiera och prioritera egenskaper fungiform papiller (FP) för att säkerställa en konsekvent poäng mellan målskyttar. Detta protokoll bygger bort av ett behov som har uppstått från de senaste två decennierna smak forskning med hjälp av FP som en proxy för smak portätheten. FP densitet har historiskt analyserats med hjälp av Miller & Reedy s 1990 karakteriseringar av deras morfologi: runda, färgade tändare, stora och förhöjda. I detta arbete, varnat författarna att striktare definitioner av FP morfologi behövde skiss. Trots denna uppmaning till handling, har följa upp litteraturen varit knappa, med de flesta studier fortsätter att citera Miller & Reedy ursprungliga arbete. Följaktligen har FP densitet rapporter varit mycket varierande och i kombination med små provstorlekar, kan bidra till de avvikande slutsatser om den roll som FP i smak känslighet. De Genetics of Taste Lab undersökt denna uppenbara Inconkonsistens i räkna och fann att målskyttar personligen prioritera vikten av dessa egenskaper på olika sätt och hade ingen vägledning när en papilla hade några, men inte alla, av de rapporterade egenskaperna hos FP. Resultatet av denna subjektivitet är mycket variabla FP räknar av samma tungan bilden. Denver Papiller Protokollet har tagits fram för att råda bot på denna konsekvens genom användning av en dikotoma nyckel som ytterligare definierar och prioriterar betydelsen av de egenskaper tas fram av Miller & Reedy. Den föreslagna metoden kan bidra till att skapa ett standardiserat sätt att kvantifiera FP för forskare inom området smak och näringsmässiga studier.

Introduction

Papiller är de synliga gupp på tungan yta. Det finns fyra typer av papiller: fungiform (FP), foliate, circumvallate och filiform. Medan trådformiga papiller är spridda över ytan av tungan, är circumvallate lokaliserade endast på baksidan av tungan, och foliate finns på sidorna. Däremot är FP ligger mot framsidan av tungan. FP, foliate, och vallgravspapillerna anses smak- eftersom de har potential att innehålla smaklökar medan filiform inte gör det. Smaklökar är kluster av celler som är ansvariga för att detektera kemiska tastants och transducera de stimuli till en luktintrycket signal i hjärnan. Saliv och mat molekyler in i smaklökarna genom öppningar kallas smak porer där smak molekyler har sedan potential att aktivera smakceller.

Intressant, det finns stora individuella skillnader i smak bud densitet, som först observerades i en histologisk undersökning av tungorfrån 18 kadaver (Miller, 1988) 1. Smaklökar själva inte är synliga på tungan yta, men smak porer syns när du använder rätt förstoring, ljus och färgningsteknik som ledde Miller & Reedy (1990) för att utveckla en metod för att identifiera smak porer och fungiform papiller använder videomicroscopy i vardags människor 2. Ett antal laboratorier har ändrat sin ursprungliga videomicroscopy teknik med användning stillbildsfotografering och liten eller ingen förstoring. Eftersom fungiform papiller är mycket lättare att visualisera än är porer med användning av dessa senare tekniker, vände laboratorium till att räkna fungiform papiller i stället för smak porer. På så sätt är det antas att fungiform papilla tätheten är en rimlig mått för smak portätheten, även om många fungiform papiller inte innehåller smak porer eller smaklökar 3; inte bara är FP mer synliga och tillgängliga än circumvallate och växt papiller, men deras ta bilder är mindre timig krävande än smak por analys med hjälp av den alternativa metoden för videomicroscopy 2,4. År 1990 använde Miller & Reedy denna teknik för att finna att smaken pordensiteter är korrelerade med FP densiteter 3 vilket ytterligare bekräftades i Bartoshuk et al. 5 Utöver detta anatomiska förhållande, Miller & Reedy fann också att 8 personer i övre hälften av smaken distributions portätheten också betygsatt sackaros, NaCl, och propyltiouracil (prop) som betydligt mer intensiv än vad de andra 8 personer 3. Efterföljande arbete av Bartoshuk et al., (1994) observerade en korrelation mellan suprathreshold PROP smak intensitet och fungiform papilla densitet, liksom smak portätheten, i 42 försökspersoner 5. Denna bekväm metod ledde till inflytelserika studier rapporterar att patienter vars tungor har många papiller framkalla en starkare reaktion på många tastants, däribland bittra tastants phenylthiocarbamide (PTC) och PROP 6,7.

PTC och PROP är väl utforskade tastants ofta används på grund av den tydliga kopplingen mellan en persons smak känslighet fenotyp och deras genotyp. Befolkningsstudier har visat att människor som har homozygot recessiv diplotype av genen, TAS2R38, har en betydligt lägre känslighet för att stötta än bärare av den dominerande eller heterozygot variant av genen 8-10. Denna ärftliga fenomen rapporterades första gången 1932 när Arthur L. Fox meddelade hans upptäckt av "smak blindhet" till PTC 11. Bland personer som kan smaka dessa bittra föreningar, intensiteten av smaken rapporterade kan variera allt från något obehagligt att excruciatingly bitter 6. För att beakta varians som inte kan förklaras av TAS2R38 ades teori som lagts fram att det kan hänföras till densiteten hos FP på tungan 4.

Som smak forskning utvecklats, den field delades in i två skolor av tanke kring denna teori om betydelsen av FP och bitter smak känslighet. Även om många studier bekräftade den ursprungliga påståendet att FP densitet är en faktor i PROP känslig 4,6,12,13, har det skett en liten, men viktig händelse som har funnit bevis för att motbevisa det, rapporterar en oförmåga att replikera rollen 10, 14,15,16. Delwiche et al., (2001) varnade för att trenden är mycket varierande; FP densitet inte jämnt redogöra för skillnader i bitterhet känslighet över ämnen, och var endast påvisbar för patienter med åtminstone en måttlig känslighet för att stötta 7. Förutom användningen av mindre strängt definierade Miller & Reedy metod för att kvantifiera FP, är det viktigt att notera att med undantag för Beaver Dam Offspring Study 15 utförd av Fischer et al., De flesta av ovanstående studier hade litet urval storlekar som också kan bidra till inkonsekventa rön omrollen av FP i smak.

I korthet, i Miller & Reedy sädes- metoddokument (1990), författarna färgade tungor blå att kvantifiera FP eftersom FP förblir rosa medan trådformiga papiller absorberar färgämnet och blir blå. De klassificeras FP som "rundade rosa strukturer ca 0,5 mm i diameter" 2. Medan författarna rekommenderas att innan du använder den här metoden för ytterligare analysarbete, FP egenskaper bör mer strikt definieras och drog slutsatsen att variationen redan noterats i litteraturen "kan bero på olika ämnes populationer, olika metoder och olika utredare" 2, deras Forskningen har lett till allmänt accepterade egenskaper som FP är runt 17,18, stora 2, rosa eller färgade tändare 2 och förhöjd 4. Taget på nominellt värde, dessa egenskaper verkar mycket rakt fram. I Genetics of Taste Lab (fick Lab eller Lab), användningen av uppfylldahod komplicerades av Skytteliga individuella försök till kvalet och prioritera vikten av ovannämnda kriterier när vissa, men inte alla, av de egenskaper var närvarande. Dessa komplikationer ingår små papiller som dök rosa mitt i mycket större papiller; hela tungan absorbera blått färgämne vilket eliminerar klassificering baserad på färgvariation; avlånga papiller i stället för runda; och tungor som inte har någon variation i höjd, vilka alla bidragit till poängvärden som rapporterar allmänt varierande FP räknar av samma bild.

Dessa variationer i analys ledde oss att granska litteraturen i syfte att lokalisera subjektivitet, identifiera eventuella undantag från de allmänt accepterade FP egenskaper och slutligen ta fram ett protokoll för att noggrant och objektivt definiera och poäng FP.

Först FP form beskrivs i litteraturen som en rundad, svampliknande struktur 17,18. Men anmärkningsvärt undantagjoner nämndes också. Miller betonade att termen "fungiform" är en missvisande och att många FP inte svampformade men kan variera mycket i storlek och morfologi 18. Melis et al., (2013) beskrev också flera papiller som ansågs "förvrängd", där FP diameter i en riktning var minst två standardavvikelser längre än i en annan riktning 19. Dessutom Cheng & Robinson fann att när indikerar FP genom färgning, varierade de från platt-toppad med långsträckt utseende 20. Konstaterar undantagen ovan, för karakterisering av en FP är runda och svampformade visas begränsa en definition.

För det andra är FP färg beskrivs som "rosa cirklar mot en blå bakgrund" 7 efter färgning tungan med blå färg. Även färgning lättare var den mest konsekventa kriteriet FP hela litteraturen var det fortfarande inte ett enhetligt kval. Cheng & ; Robinson konstaterade att FP inte alltid lätt färgade, vilket gör identifiering svårt och osäkert 20. Det verkar då som tungor absorberar färg på olika sätt och medan kontrasten är uppenbart på många tungor, en del blir helt blå med ingen skillnad, medan andra omedelbart förlora några spår av blått färgämne 21.

Den tredje egenskap, FP storlek, var ganska konsekvent bland papper, som sträcker sig från 0,5 mm till 0,97 mm 6,18. I litteraturen noteras Miller att det fanns två storleksområden av papiller på den dorsala främre av tungan. Den papiller med större diametrar var främst fungiform och koniska papiller, medan papiller med en mindre diameter var mestadels filiform 18. Men med undantag för Beaver Dam Offspring Study 21, storlek verkade inte för att avgöra om en struktur är en FP i litteraturen, men lämnades för papiller redan klassificerats som "fungiform".

_content "> Slutligen höjd anges som den fjärde ramprogrammet karaktäristiska 4 men Miller påpekade att skillnaden mellan filiform och fungiform papiller är svårt när du använder detta kriterium nära kanten av tungan. Han gav två exempel på FP som varierade kraftigt i höjd, den ena är 0,8 mm i höjd medan en annan var mindre än 0,1 mm i höjd, men fortfarande hade två smak porer som tydligt observerades 18. Denna observation följdes också upp och bekräftas av Shahbake et al. 4

Dessa definitioner och deras redovisade undantag visar att smaken fältet länge har erkänt inkonsekvens i karakterisera FP och bristerna i vanligt förekommande protokoll från Miller & Reedy. I själva verket, Miller & Reedy uppmanade fältet för att ytterligare definiera funktionerna i FP 2. Vi antar att scorers var att ge olika vikt vid de egenskaper och prioritera deras betydelse på olika sätt när papillae inte uppfyllde alla kriterier, till exempel när en papilla var stor och svampformad, men färgas blå. Det motiverade att utredarna av tidigare publicerade studier sannolikt gjorde samma sak som i kombination med små provstorlekar, kan redogöra för de olika resultaten kommer från användning av denna metod.

Den fick Lab upp denna lucka i FP metodik genom att utveckla en riktlinje som definierar varje egenskap med hjälp av objektiva mätningar och prioriterar de egenskaper som anger vilka har företräde i analysen. Denna metod är Denver Papiller Protocol (DPP), en dikotoma nyckeln med klara och tydliga egenskaper FP för att säkerställa noggranna och repeterbara räknas från digitala fotografier av tungan. DPP är en föreslagen metod för att standardisera den tidigare använda Miller & Reedy metod, vilket tar bort individuella tolkningar och se mer konsekventa resultat vid analys av FP täthet. Genom att göra så, kan DPP användas till mer självsäkert determine roll FP i smak.

De tunga bilder tagna av patienterna analyserades av medborgare vetenskapsmän (Skytteliga) i labbet som är de verkliga föremål för denna studie. The Lab kärna av medborgare forskare består av medlemmar från samhället varierar i ålder (år) från 16 till mitten av 80-talet. En summativ utvärderingsrapport beställd av museet under 2012 beskriver medborgar forskare som har ett starkt intresse för naturvetenskap och med två tredjedelar har tjänat en högskoleexamen i en vetenskaplig disciplin 22. Kandidat medborgare forskare närvarande rekryteras via mun till mun, måste klara en intervju process med veteran volontärer på museet, och genomgår en försöksperiod i museets permanenta hälsoutställning, Expedition hälsa, innan de har möjlighet att ansöka om en plats i labbet. När antagen till Lab, medborgare forskare genomgå en 12-veckors utbildning för att bli certifierad för att registrera mänskliga subjektets. Efter denna certifiering, de har möjlighet att ta utbildningsmoduler på olika tekniker i labbet (t.ex. papiller räkning, DNA-extraktion) och efter ytterligare certifieringar och regelbundna åtgärder för kvalitetskontroll, dessa medborgare forskare har möjlighet att aktivt delta i dataanalys. Medborgar forskare frivilligt sin tid och inte kompenseras för deras bidrag till museet.

Protocol

Bilderna görs i denna studie samlades in som en del av en större smak studie i Genetics of Taste Lab på Denver Museum of Nature & Science (museet) 10. Ämnen av större studien var museets besökare (n = 1195) i åldrarna 18-93. Även patienter kom från sex av de sju kontinenterna, deltagarna var främst av europeisk härkomst. Varje föremål uppgifter samlades i ett 30 minuter laborationen. Västra Institutional Review Board godkänt protokoll informerade skriftliga medgivande gavs, och ämnen frivilligt sin tid och var inte kompenseras för sitt deltagande i studien.

1. Datainsamling

  1. Bildinsamling
    1. Visa utsätter ett fotografi av hur man poserar sig (Figur 1) och vad den tagna bilden kommer att se ut.
      Figur 1 Figur 1: Bildinsamling Pose.
    2. Direkt ämnen för att torka sin tunga med ett papper handduk och låt tungan sticker ut från munnen.
    3. Applicera ca 3 ml av blå livsmedelsfärg vid en 1:36 koncentration till spetsen av tungan med hjälp av en steril, rayon applikator med en 1-tums spets. Har ämnen tillbaka tungan till munnen och svälja för att avlägsna överskottsfärg.
    4. Har ämnen utgör själva som visas i figur 1, med sin haka på sina händer och armbågar stödd på ett bord för stabilitet. Direkt ämnen för att utöka sin tunga bekvämt avstånd och säkra den försiktigt mellan tänderna.
    5. Vidhäfta en 2,5 cm stycke av filterpapper med en 10 mm diameter cirkulär utskärning stansas i det till spetsen av den främre av den vänstra sidan av tungan intill mittlinjen (se figur 1).
    6. Ta minst tre närbilder av tungan, capturing hela 10 mm cirkulär utskärning för att säkerställa visualisering av alla FP inom detta område. Använd makroställandet av en högkvalitativ digital punkt och skjuta kamera monterad på ett stativ för stabilitet.
      1. Zooma in på den utsträckning som hela utskärning fotograferas samtidigt inom kamerans rekommenderade zoomomfång. Säkerställa att planet för kameralinsen är parallell med planet för tungan och att utskärningen visas cirkulär i bilden i stället för avlång. Granska bilder så att de är av hög kvalitet och till nytta för att räkna.
  2. Bildval och beredning
    1. Ladda upp bilder till datorn.
    2. Av de bilder som tagits av samma ämne tunga, bara välja ett för vidare analys baserad på tydlig definition mellan strukturer på tungan på högsta zoom och minst förvrängd vinkel så tungan är bred och platt mot kameran.
    3. Öppna den valda Raw-bild i öppen källkod såftware, ImageJ. Klicka på "Plugins" och i rullgardinsmenyn Bläddra till "Analysera" och klicka på "Cell Counter." När cellräknare öppnas klickar du på "Initiera" för att länka bilden till cellräknare.
      Obs: Här använder ImageJ 1,45 sek med 32-bitars Java 1.6.0_10 version.
      1. Använd en vanlig förstoring av 50% av konsekvens mellan scorers och för användning i efterföljande steg att göra mål FP. Flytta bilden till vänster sida av skärmen bredvid cellräknare. Den här bilden kommer att benämnas Copy A (se figur 2, vänster på skärmen).
  3. Öppna en andra kopia av den råa bilden (blad B) för att mäta diametrar papiller som kvantifieras. Zooma in och ut efter behov för att preferensen för den enskilde målskytt under poängsättningsprocessen. Flytta denna kopia till den högra sidan av skärmen så de två kopiorna är inte av misstag förväxlas. (Se figur 2, högra sidan avskärm)
  4. Klicka på linjeverktyget. Med hjälp av blad B, zooma in så mycket som behövs för att noggrant rita en diameter över 10 mm inre cirkeln av filterpapper i valfri vinkel och klicka på "Analysera" och "Set Scale." Fyll i "kända Avstånd" att vara "10 . "Kontrollera skalan är korrekt genom att mäta en alternativ vinkel och se till intervallet diameter är mellan 9,8-10,2 mm. Om det inte är, upprepa detta steg.

Figur 2
Figur 2: Kopiera A och kopiera B. Copy A (till vänster) är kopplad till celltalsräknare fönstret och ligger kvar på 50% förstoring av konsekvens från målskytt till målskytt medan blad B (höger) kan zoomas till preferensen för den enskilde.

2. Scoring FP Använda Denver Papiller protokollet Dichotomous Key

  1. För varje kandidat papilla, använd följande dikotoma nyckeln (steg 2,2-2,5) med uppgifter om kriterierna för att avgöra om det är en FP. Se figur 3 för en visuell av papiller som klassificeras som FP och för de som avvisas vid varje steg i processen.
    Figur 3 Figur 3: FP vs Rejected Papiller. Figur 3a är en tunga med flera kvalificerade FP medan 3b-3e har cirklade områden som bryter mot varje regel. (3b) området är amorf; (3c) papiller är för små; 3d) papilla är blå jämfört med dem som omger den, (3e) papilla är försänkt jämfört med dem runt den.
  2. Form
    1. Ta reda på om kandidaten papilla är amorf (lösa). Vid 50% zoom se om det finns en allmänt erkänd geometrisk form (ovala, kubiskt, rund).
    2. Om det finns en geometrisk form (se figur 3a), gå till steg 2,3.
    3. Om finse är ingen geometrisk form (se figur 3b), gå till celltalsräknare fönstret och klicka på "typ 1." På blad A (50% zoom), klicka på kandidat papilla för att markera den som amorft och inte en FP. Om du klickar på typerna 1-4 i detta och efterföljande steg gör poäng att veta att de har tagit upp alla kandidat papiller och kategoriserar som regel kränks när avslå en struktur som kommer att underlätta diskussionen i steg 2.7.2.
  3. Färg
    1. Se kopiera A vid 50% zoom och avgöra om det finns någon färg differentiering över ytan av tungan. Om så är fallet, fortsätter till nästa 2.3.2. Om inte, använd inte färg som en avgörande faktor; gå till steg 2,4.
    2. Ta reda på om kandidaten papilla är lättare än vävnaden eller papiller som omger den (se figur 3a). Om någon del av kandidat papilla har varit rosa eller färgade tändare, gå till steg 2,4.
    3. Om kandidaten papilla är blå och de omgivande papiller ärljusare (se figur 3c), gå till celltalsräknare fönstret och klicka på "typ 2" på cellräknare. På blad A, klicka kandidaten att markera som alltför blått och inte en FP.
  4. Storlek
    1. Med hjälp av blad B, zooma in avståndet där man bekvämt kan se konturerna av kandidat papilla.
    2. Klicka på linjen verktyg och mäta över den längsta dimensionen av kandidat papilla. Klicka på "Analysera" och sedan "åtgärd". Om den uppmätta längden är 0,5 mm eller större (se figur 3a), gå till steg 2,5.
    3. Om den uppmätta längden är 0,499 mm eller mindre, mäta en gång för att säkerställa noggrannheten. Om det fortfarande är 0,499 mm eller mindre (se F igure 3d), klicka på "typ 3" på celltalsräknare fönstret och blad A, klicka kandidaten papilla för att markera den som alltför små och inte en FP.
  5. Nedgång
    1. Med hjälp av blad A, bedöma om kandidaten papilla är antingen jämn hanight med resten av tungan eller förhöjd. Om papilla är i en spalt, bestämma dess höjd jämfört med de andra strukturerna i spalt, inte ytan av tungan. Om papilla är lägre än papiller som omger den (se figur 3e), använd "Typ 4" och blad A, klicka kandidaten papilla för att markera den som infälld och inte en FP.
    2. Om kandidaten papilla är antingen jämn höjd med resten av tungan eller förhöjda (se figur 3a), använd "typ 5" klicka på den och markera att detta är en FP. Denna typ 5 totalt är den råa FP poäng. Stäng inte kopiorna på denna punkt som ImageJ inte spara poängen på cellräknare eller färgade märken från olika typer 1-5 exemplar A.
  6. Spara Copy A
    1. Skriv ner i anteckningsboken rå FP poäng.
    2. På celltalsräknare fönstret, klicka på "Exportera bild." Spara med den önskade namngivningssystem för labbet. Detta kommer att tillåta öppnandet av polisy A i framtiden för att hålla kvar de färgade märken från typerna 1-5. Det kommer inte att spara rå FP poäng.
  7. Kvalitetskontroll
    1. Betyg varje foto med två individuella poäng och jämför 7.
    2. Om högre FP rå poäng är inom 10% av den nedre FP rå poäng, i genomsnitt de två poäng tillsammans för en konsensus FP poäng. Om de två FP rå poäng skiljer sig med mer än 10%, dra båda gjorde bilder på skärmen.
      1. Använd räknartyper 1-4 för att underlätta diskussionen om avvikelser och ge en slutlig enighet poäng. Om ingen enighet kan nås under diskussionen, ta en paus från att göra poäng. Vid en senare tidpunkt, rescore bilden och diskutera. Om enighet fortfarande inte kan nås, dra in en tredje målskytt. Be dem att göra mål på bilden och dialog med de andra två.

3. Utbildnings Målskyttar att använda DPP

  1. Bakgrund till utbildning
    1. Har två poäng räkna en mängd olika bilder,scoring individuellt och ger regelbundet för att säkerställa att de använde samma kriterier. Först när enskilda punkter var genomgående inom 10% av varandra för varje bilderna när gjorde var metoden (färdig ovan) anses godtagbart och kallas DPP.
    2. Välj 15 officiella bilder och 15 träningsbilder (Supplemental figurer 2-17) i ordningsföljd att göra mål. Om en bild ansågs oräkneliga under valet, hoppa på bilden och välj nästa sekventiella bild.
      Obs: Dessa bilder varierar i kvalitet och storlek som de valdes medan Lab fortfarande behärskar den rätta fotografering teknik. En av de valda bilderna ansågs oräkneliga genom denna primära räkna process men lämnades in för att se till att scorers kunde göra det samtalet när det behövs. Därför finns det 16 bilder som ges till praktikanter men bara 15 gjorde bilder.
    3. Med hjälp av DPP har ovannämnda poäng räkna 15 utbildnings bilder och skapa en samsynscore för varje.
    4. Ge praktikanter de 15 officiella bilderna och be att värdera med Miller & Reedy att skapa en baslinje. Spela poäng. Genomföra en gruppträning som följde steg 3.2. När steg 3,2 avslutades, har poäng poäng de 15 officiella bilderna igen och spela in sina poäng.
  2. Träning Efterföljande Målskyttar på DPP
    1. Ge utbildning poäng den första utbildningen bilden och visa DPP för några papiller i den här bilden. Diskutera resonemang för att välja eller avvisa varje papilla som FP. Låt praktikanter att fortsätta öva poäng för resten av detta foto och överlägga med konsensus nummer (för GOT Labs konsensus antal och typ 1-5 markörer, se kompletterande Figur 1). För detta foto diskutera eventuella avvikelser oavsett 10% för att säkerställa förståelsen av DPP.
    2. Ge efterföljande poäng den andra tränings bilden och få dem värdera med DPP.
    3. Om praktikanten rå FP poäng är inom tioprocent av den etablerade konsensus räknar från avsnitt 3.1.3. Låt praktikant att gå vidare till nästa bild och upprepa steg.
    4. Om resultatet är utanför de tio procent sortiment, använd praktikantens färgade märken föreställande typer 1-5 att förstå och identifiera inkonsekvens och sedan ta itu med avvikande förståelse för DPP.
    5. Ge praktikanten möjlighet att rescore bilden och verifiera den nya poäng en gång mer. Om det lyckas, flyttar praktikant på nästa bild tills alla bilder är klara.

Representative Results

Här är ett representativt fotografi görs av två individuella poäng när du använder vanligt förekommande Miller & Reedy metod för FP identifiering baserat på fältnormer runda, stora, rosa eller färgade ljusare, och förhöjda, och sedan samma fotografi gjordes av två scorers med användning av DPP. De räknas som visas är representativa för den höga variansen observeras med den ursprungliga metod jämfört med den lägre varians med hjälp av DPP.

Figur 4

Figur 4:. Miller & Reedy Kvantifiering vs DPP Kvantifiering Bilden till vänster är representativ för två Skytteliga "räknar med hjälp av Miller & Reedy metod. Bilden till höger föreställer två Skytteliga "räknar med hjälp av DPP. Rött är målskytt 1, är Gul målskytt 2 är Green scorers 1 & 2.

Statistisk tillförlitlighet DPP har tidigare studerat användning av en blandad linjär modell för att bedöma variabilitet 10. I korthet, att generera data för att bedöma vilken roll DPP spelar konsistens av värderingar, var femton bilder gjorde två mål. I den första omgången av poäng, DPP naiva scorers använde Miller & Reedy metod 2. De poäng därefter utbildade för att använda DPP och bilderna individuellt rescored utan den slutliga konsensus steg som beskrivs i avsnitt 2.7 detaljer Kvalitetskontroll (Figur 5). FP Poängen datauppsättning användes sedan i den blandade modellen för att bedöma de kombinerade skillnader på grund av protokollet (figur 6), inom-målskytt variabilitet och interaktionen mellan de två. Denna modell visade en signifikant skillnad i poäng vid användning av Miller & Reedy metod jämfört med DPP (p-värde <1 x 10 -6) med DPP som leder till en högre räkna med 6,99 (SE = 0,99); 5,2% av variationen i partituret berodde på utbildning, 25,9% på grund av målskytt, och resterande på grundvariabilitet specifik för bilden 10. Därefter för att generera data för att fastställa variationen inom-målskytt, var en serie av trettio bilder i slumpmässig ordning görs av 11 personer. Unbeknownst till scorers, denna serie av bilder ingår tre bilder som upprepades. Vi observerade en drastisk skillnad i värdering variabilitet jämföra olika bilder versusrepeated bilder.

Figur 5
Figur 5:. DPP-Naïve vs Post DPP Training paneler ger boxplots av omdömes betygen för 15 bilder före och efter Denver Papiller protokoll utbildning. För varje boxplot, en ifylld cirkel indikerar medelvärdet medan en öppen cirkel indikerar en avvikare.

Figur 6
Figur 6:. Förändring i Målskytt Varians Den grå representerar than variation för enskilda poäng före DPP utbildning. Svart är samma målskytt efter DPP utbildning.

Discussion

Använda DPP, variansen i bilden räknas över oberoende scorers och inom-sekreterar räknar minskat betydligt. Även om denna metod gör visuell FP densitetsanalys utan videomicroscopy mindre subjektivt, bör det noteras att denna metod endast poäng FP. DPP kan inte garantera att strukturer som klassificeras som FP har smak porer och är därför smaklökarna eller att räkningarna är reflekterande av verklig smak bud densitet 20,23 .Den typ av denna metod är att det inrättas tillförlitlighet genom konsekvens och precision; emellertid kan den förspännande resulterar i en konsekvent riktning. För att testa riktigheten i förhållande till andra metoder med hjälp av ett riktigt mått på smak bud densitet (t.ex. videomicroscopy) skulle sträcka sig utanför ramen för detta study.However, genom att karakterisera morfologin FP mer stringent och skapa en dikotom nyckel, behandlar denna metod Miller & Reedy laddning till det område som mer karakterisering av FPbehöver göras för att få samsyn kring deras morfologi och kvantifiering 2. Dessutom uppgav de att denna karakterisering kan "klargöra några av skillnaderna mellan individer och förklara några av de olikartade resultat bland utredarna 2." Genom att tillhandahålla en enhetlig metod för kvantifiering, många av skillnaderna på rollen som FP i smak och nutrition- relaterad forskning kan rättas till.

Den dikotoma nyckeln kan justeras för de olika bildtagningstekniker. Den kända avstånd för mätskala kan enkelt ställas in på diametern används i varje labb och lågkonjunktur kan uteslutas om Saran wrap eller glas placerades över tungan för bildfångst. I GOT Lab, visade det sig att den neutrala tungan ger den bästa definitionen av papiller. Detta kan bero på att mängden ljus i Lab som orsakade Saran wrap eller glas för att reflektera ljus tillbaka in i kameran skapar en reflexer som gjorde åsnorsment svårt. Vissa labs har sagt att de tycker att färgen svårare att räkna, men fick Lab hittade en utspädd blå livsmedelsfärg vid en koncentration av 1:36 utgjorde en perfekt kontrast mellan fungiform och filiform papiller på de flesta språk.

Skapandet av en dikotoma nyckel för FP karakterisering gör det möjligt för forskare i olika laboratorier, med hjälp av olika bildfångstmetoder, att konsekvent analysera strukturer på tungan och har förtroende för rapportering av resultaten. Slutligen kan användningen av en dikotoma nyckeln har syften i andra områden av vetenskaplig metodik där egenskaper strukturer eller föremål tillhandahåller inkonsekventa siffror från studie till studie.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats delvis av Science Education Partnership Award (SEPA) R25 RR025066 mellan 2008-2012 från National Institutes of Health och National Center for Research Resources. Tack till kollegor i smaken fält för omtänksamt diskussion av litteraturen, våra resultat och synpunkter på användningen av DPP i olika laboratorie scenarier: John Hayes, Sue Coldwell, Paul Breslin, Carla Schubert. Tack också till ledarskap på Denver Museum of Nature & Science och personalen till stöd för medborgarnas vetenskap inom Genetics of Taste Lab inom Expedition hälsa. Slutligen, tack till alla våra frivilliga medborgar forskare för sin tid och engagemang för att utveckla och använda detta protokoll, inklusive: Bear Aragon, Mike Archer, Su Ataman, Michael Bagley, A'nette Bertrand, Diana Boyles, Wendy Covert, Sasha Dooley Patty Drever, Jessica Ern, Laura Harmacek, Sean Hibbard, Joyce Hutchens, Matt Joo, Leta Keane, Willem Leenhouts, Stephania Lukjan, Ashley Matthews, Mike Mauser, Stephanie Miller, Hallie Morgan-Rodriguez, Griffin Scherma, Alyssa Schickedanz, Terri Simon, Dylan Thomas, Rudy Torres, Tyler Wilson, Diane Woltkamp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Image J National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij
Food dye, Deep Blue Shade Esco http://escofoods.com/blue-food-coloring.html
Sterile Rayon Tipped OB/GYN Applicators Puritan 25-808 1PR
Grade 1 Filter Paper Whatman Whatman No.: 1001-325
Coolpix P100 (10.3 megapixels) and P500 (12.1 megapixels) Nikon http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/ neither model appears to be available on the website any longer
Paper Hand Towels Kleenex https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, I. J. Human taste bud density across adult age groups. J Gerontol. 43, (1), B26-B30 (1988).
  2. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Quantification of fungiform papillae and taste pores in living human subjects. Chem Senses. 15, (3), 281-294 (1990).
  3. Miller, I. J. Jr, Reedy, F. E. Jr Variations in Human Taste Bud Density and Taste Intensity Perception. Physiol Behav. 47, (6), 1213-1219 (1990).
  4. Shahbake, M., Hutchinson, I., Laing, D. G., Jinks, A. L. Rapid quantitative assessment of fungiform papillae density in the human tongue. Brain Res. 1052, (2), 196-201 (2005).
  5. Bartoshuk, L. M., Duffy, V. B., Miller, I. J. PTC/PROP tasting: anatomy, psychophysics, and sex effects. Physiol Behav. 56, (6), 1165-1171 (1994).
  6. Essick, G. K., Chopra, A., Guest, S., McGlone, F. Lingual tactile acuity, taste perception, and the density and diameter of fungiform papillae in female subjects. Physiol Behav. 80, (2-3), 289-302 (2003).
  7. Delwiche, J. F., Buletic, Z., Breslin, P. A. Relationship of papillae number to bitter intensity of quinine and PROP within and between individuals. Physiol Behav. 74, (3), 329-337 (2001).
  8. Kim, U. K., Jorgenson, E., Coon, H., Leppert, M., Risch, N., Drayna, D. Positional cloning of the human quantitative trait locus underlying taste sensitivity to phenylthiocarbamide. Science. 299, (5610), 1221-1225 (2003).
  9. Hayes, J. E., Bartoshuk, L. M., Kidd, J. R., Duffy, V. B. Supertasting and PROP bitterness depends on more than the TAS2R38 gene. Chem Senses. 33, (3), 255-265 (2008).
  10. Garneau, N. L., et al. Crowdsourcing taste research: genetic and phenotypic predictors of bitter taste perception as a model. Front Integr Neurosci. 8, (33), (2014).
  11. Fox, A. L. The relationship between chemical constitution and taste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 18, (1), 115-120 (1932).
  12. Tepper, B. J., Nurse, R. J. Fat Perception is related to PROP taster status. Physiol Behav. 61, (6), 949-954 (1997).
  13. Duffy, V. B., et al. Bitter receptor gene (TAS2R38.), 6-n.-Propylthiouracil (PROP) bitterness and alcohol intake. Alcohol Clin Exp Res. 28, (11), 1629-1637 (2004).
  14. Yackinous, C., Guinard, J. X. Relation between PROP taster status and fat perception, touch, and olfaction. Physiol Behav. 72, (3), 427-437 (2001).
  15. Fischer, M. E., et al. Factors related to fungiform papillae density: The Beaver Dam Offspring Study. Chem Senses. 38, (8), 669-677 (2013).
  16. Feeney, E. L., Hayes, J. E. Regional differences in suprathreshold intensity for bitter and umami stimuli. Chemosens Percept. 7, (3-4), 147-157 (2014).
  17. Saito, T., Narita, N., Yamada, T., Manabe, Y., Ito, T. Morphology of human fungiform papillae after severing chorda tympani nerve. Ann Otol Rhinol Laryngol. 120, (5), 300-306 (2011).
  18. Miller, I. J. Anatomy of the peripheral taste system. Handbook of Olfaction and Gustation. Doty, R. L. Marcel Dekker. New York. 521-547 (1995).
  19. Cheng, L. H. H., Robinson, P. P. The distribution of fungiform papillae and taste buds on the human tongue). Arch Oral Biol. 36, (8), 583-539 (1991).
  20. Cruickshanks, K. J., et al. Measuring taste impairment in epidemiologic studies-The Beaver Dam Offspring Study. Ann N Y Acad Sci. 1170, 543-552 (2009).
  21. McNamara, P. A. Genetics of Taste summative evaluation report prepared for Denver Museum of Nature & Science. Independent Evaluator. Chicago IL. (2012).
  22. Arvidson, K., Friberg, U. Human taste: Response and taste bud number in fungiform papillae. Science. 209, (4458), 807-808 (1980).
Denver Papiller Protokoll för objektiv analys av Fungiform Papiller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).More

Nuessle, T. M., Garneau, N. L., Sloan, M. M., Santorico, S. A. Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae. J. Vis. Exp. (100), e52860, doi:10.3791/52860 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter