Abstract
La grossesse est caractérisée par l'infiltration de leucocytes dans les tissus reproducteurs et à l'interface materno-fœtale (caduque basale et caduque pariétale). Cette interface est le site anatomique de contact entre la mère et de tissus foetaux; par conséquent, il est un site d'action immunologique au cours de la grossesse. Infiltrant leucocytes à l'interface materno-fœtale jouent un rôle central dans l'implantation, l'entretien de la grossesse, et le calendrier de livraison. Par conséquent, les caractérisations phénotypiques et fonctionnelles de ces leucocytes fourniront des renseignements sur les mécanismes qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs protocoles ont été décrits dans le but d'isoler leucocytes infiltrant des caduque basale et parietalis caduque; Cependant, le manque de cohérence dans les réactifs, les enzymes, et les temps d'incubation, il est difficile de comparer ces résultats. Décrit ici est une nouvelle approche qui combine l'utilisation de diss mécaniques et enzymatiques doucestechniques de ociation de préserver la viabilité et l'intégrité des marqueurs intracellulaires et extracellulaires dans les leucocytes isolés à partir de tissus humains à l'interface materno-fœtale. Mis à part l'immunophénotypage, culture cellulaire, et le tri de cellules, les applications futures de ce protocole sont nombreuses et variées. À la suite de ce protocole, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour déterminer la méthylation de l'ADN, l'expression de gènes cibles, de fonctionnalité in vitro de leucocytes (par exemple, la phagocytose, la cytotoxicité, la prolifération des cellules T, et de la plasticité, etc.), et la production d'espèces réactives de l'oxygène à l'interface materno-fœtale. En outre, en utilisant le protocole décrit, ce laboratoire a été en mesure de décrire les leucocytes nouvelles et rares à l'interface materno-fœtale.
Introduction
La grossesse est caractérisé par trois phases distinctes: une immunologiques) implantation et la placentation précoce associée à une réponse pro-inflammatoire (par exemple, implantation ressemble à un «plaie»); 2) le deuxième trimestre et la plupart du troisième trimestre de la grossesse, lorsque l'homéostasie immunitaire est atteint grâce à un état majoritairement anti-inflammatoire à l'interface materno-fœtale; et 3) la parturition, un état pro-inflammatoire 1-7. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire à l'interface materno-fœtale où leur abondance et le changement de localisation pendant la grossesse 6-9.
Chez les humains, l'interface materno-fœtale représente une zone de contact direct entre la mère (caduque) et foetale (chorion ou trophoblaste) tissus. Cette interface comprend: 1) la caduque pariétale qui tapisse la cavité utérine ne sont pas couverts par le placenta et est en juxtapositionau laeve de chorion; et 2) les caduque basale, situé dans la plaque basale du placenta où il est envahi par les trophoblastes interstitiels 10 (Figure 1). L'intimité de ces zones de contact crée les conditions pour l'exposition du fœtus à l'antigénique immunitaire 11-13 du système maternelle. Sans surprise, les leucocytes comprennent jusqu'à 30 à 40% des cellules déciduales 8,9,14,15 en plus des cellules de type stromal typiques et les cellules glandulaires 8,14,16. Le rôle des leucocytes à l'interface materno-fœtale englobe de multiples processus qui incluent la limitation de l'invasion trophoblaste 17, le remodelage des artères spiralées 18,19, maintien de la tolérance maternelle 12,20, et l'initiation du travail 21-26. Les leucocytes à la fois de l'adaptation et des membres innée du système immunitaire, à savoir, les cellules T, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules NK, ont été identifiés dans les tissus déciduales, et leurIl a été démontré proportions et l'état d'activation de varier spatialement et temporellement pendant toute la gestation 6-10,12,14,24,27-30. Perturbations dans la population et / ou de la fonction des leucocytes sont associés à un avortement spontané 31, 32 pré-éclampsie, une restriction de croissance intra-utérin 32,33 et 7,24 travail prématuré. Par conséquent, l'étude des caractéristiques phénotypiques et la fonctionnalité des leucocytes à l'interface materno-fœtale humaine facilitera l'élucidation des voies immunologiques surexprimés dans les troubles de la grossesse.
Un des outils les plus puissants utilisés pour déterminer le phénotype et les propriétés fonctionnelles de leucocytes est la cytométrie de flux, une technologie qui permet l'analyse quantitative de plusieurs paramètres simultanément 34-36. Pour analyser les leucocytes par cytométrie de flux, l'isolement des leucocytes dans une suspension à cellule unique est nécessaire. Par conséquent, un procédé pour séparer l'infiltration leukocytes de l'interface materno-fœtale est nécessaire pour étudier leur propriétés phénotypiques et fonctionnels.
Plusieurs méthodes ont été décrites pour isoler les leucocytes de l'interface materno-fœtale humaine 10,14,25,27,37-39. Alors que certains appliquent désagrégation mécanique 10,25,27,38, d'autres utilisent la digestion enzymatique 37,40 pour la dissociation des tissus. Parce que la désagrégation mécanique produit un rendement plus faible et la viabilité réduite 41, et la dissociation enzymatique peut affecter la viabilité et la surface de la cellule marqueur rétention 42, le procédé décrit ici combine dissociation mécanique douce avec prétraitement enzymatique pour augmenter le rendement des leucocytes isolés sans compromettre la viabilité des cellules. Une combinaison de méthodes similaire a été démontrée comme étant efficace dans la séparation de leucocytes à partir des tissus déciduales à l'interface materno-fœtale 39. Par conséquent, le protocole décrit ici implique mécadésagrégation nique avec un dissociateur automatique de tissu qui augmente la cohérence tout en économisant du temps et de la main-d'œuvre par rapport à hachage traditionnel avec des scalpels opposées, lames de rasoir, des ciseaux chirurgicaux ou 10,28. L'enzyme choisie pour la dissociation des tissus était Accutase. Contrairement à la collagénase utilisée par 43, 44 dispase, la trypsine et 45, Accutase (une solution de détachement cellulaire) combine à la fois des activités protéolytique et collagénolytiques général qui contribuent à la dissociation efficace et doux 46,47. Après dissociation, les leucocytes sont enrichies à partir de la population totale des cellules déciduales par centrifugation en gradient de densité. Différents milieux de gradient de densité ont été utilisés précédemment, le plus commun qui sont Percoll (une suspension de particules de silice colloïdale) 48 et Ficoll (un polymère de saccharose avec un poids moléculaire synthétique de haute) 49. L'efficacité supérieure de l'isolement par le polymère de saccharose a été previoisa nt montré 50, et le protocole décrit ici encore prouve que ce média de gradient de densité produit une pureté suffisamment élevé de leucocytes mononucléaires.
Par conséquent, le protocole décrit ici combine la désagrégation du tissu mécanique avec un dissociateur automatique de tissu, la digestion enzymatique avec une solution de détachement de la cellule, et la séparation des leucocytes avec un milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) pour isoler les leucocytes à partir de tissus déciduales humaines. Ce protocole a été prouvé pour préserver les antigènes de surface des cellules ainsi que la viabilité des cellules. Les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications qui comprennent immunophénotypage avec la cytométrie de flux et des études fonctionnelles in vitro.
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Protocol
Ce protocole est approprié pour l'isolement des leucocytes des caduque basale et parietalis caduque en préparation pour l'immunophénotypage par cytométrie de flux. En outre, les cellules isolées peuvent être utilisées pour le tri cellulaire, culture cellulaire, l'isolement de l'ARN, et la cytologie. Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l'approbation éthique humaine doit être obtenue auprès du Comité d'éthique de la recherche locale et Institutional Review Board. La collecte et l'utilisation d'échantillons humains à des fins de recherche ont été approuvés par les Institutional Review Board de l'Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, National Institutes of Health (NIH), ministère de la Santé et des Services sociaux (DHHS , Bethesda, MD, USA) et Wayne State University (Detroit, MI, USA). Un consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de toutes les femmes enceintes avant le prélèvement d'échantillons de tissus.
REMARQUE: Tout en travaillant avec le sang des animaux, les cellules, ou de dangeragents UO comme mentionné dans ce protocole, il est essentiel que la biosécurité appropriée et des mesures de sécurité de laboratoire soient suivies.
1. Dissection des déciduales tissus humains
NOTE: La plaque de base est la base au-dessous et ci-joint au placenta et représente la surface maternelle. Les membranes chorioamniotic comprennent l'amnios et le chorion. La plaque basale comprend les caduque basale et le chorion comprend parietalis caduque (Figure 1).
- Decidua basalis
- Disséquer un morceau de la plaque de base d'un cotylédon du placenta (figures 1A et 1B).
- Placez-le sur une planche à découper stérile avec les villosités placentaires vers le haut. Le côté montrant la villosités placentaires est généralement rouge sang avec le tissu poilu en apparence. La plaque basale est lisse et pâle de couleur rouge.
- Utilisez tranchants, ciseaux pointes fines et une pince pour retirer la villtissus et les vaisseaux sanguins UO. Gardez le tissu trempé dans 1x PBS (Ca2 + - et Mg 2+ - gratuitement) pendant le processus (figure 1C). Recueillir 2 à 3 de ces pièces et rincez-les soigneusement avec 1x PBS pour éliminer le sang (figure 1D).
- Decidua parietalis
- Disséquer un morceau de membranes chorioamniotic (environ 10 cm x 10 cm, figure 1E). Placez-le sur la planche avec le chorion vers le haut. Le côté chorionique contient des caillots de sang et est généralement la lumière de couleur jaunâtre.
- Utilisez pointes fines pinces pour retirer autant de caillots de sang que possible (figure 1E). Rincer la membrane stérile 1x PBS pour nettoyer l'excès de sang à partir de la membrane jusqu'à ce que le PBS 1x soit claire.
- Utilisez un grattoir à cellules stérile à usage unique pour gratter doucement la couche déciduale de la membrane. Appliquer stérile 1x PBS sur la memBrane tout en complétant ce processus (figure 1F). Recueillir les tissus déciduales et les placer dans un tube en plastique de 50 ml avec PBS 1x stérile (figure 1G).
2. La ventilation mécanique et de digestion enzymatique
- Laver le tissu disséqué à partir de la caduque basilaire de l'étape (1.1.3) ou la caduque pariétale (de l'étape 1.2.3) avec PBS 1x stérile dans un tube en plastique de 50 ml. Recueillir des pastilles de tissu par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant situé au-dessus du culot de tissu soigneusement sans perturber le culot.
NOTE: A ce stade, les pastilles sont très lâche, car ils contiennent des globules rouges. Si le volume de la pastille est d'environ ou inférieur à 3 ml, remettre en suspension le culot dans 6 ml de solution de détachement cellulaire pré-chauffé à 37 ° C. Si la pastille est supérieure à 3 ml de volume, ajouter plus de solution de détachement cellulaire (ajouter environ 2 fois èmee volume des échantillons de tissus). - Transférer les tissus homogénéisés (caduque basale + détachement cellulaire solution ou caduque parietalis + solution de détachement cellulaire) à un tube de C.
- Placer le tube de C dans le dissociateur automatique et exécuter le programme correspondant.
NOTE: Le programme pour les caduque basale fonctionne pendant 17 secondes avec 668 tours au total par cycle. Le programme pour les parietalis caduque fonctionne pendant 37 secondes avec 235 tours au total par cycle. Ces programmes ont été personnalisés pour isoler des leucocytes caduque basilaire ou parietalis caduque avec un bon rendement et la viabilité cellulaire. - Après la désagrégation mécanique des tissus, digérer les tissus avec une solution de détachement cellulaire disponible dans le commerce tel que Accutase; (Un cocktail contenant des enzymes protéolytiques et collagénolytiques) pendant 45 min à 37 ° C avec agitation douce.
3. Isolement de leucocytes
- Après l'incubation, ajouter 10 ml de 1 x PBS à la digemélange stion et passer à travers un tamis cellulaire 100 um dans un tube en plastique de 50 ml. Selon la viscosité du mélange de digestion, on peut avoir besoin d'utiliser plusieurs filtres de cellules pour une mélange.
- Remplir le tube avec 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le PBS 1x-dessus des culots cellulaires soigneusement et remettre en suspension les culots avec 5 ml de tampon FACS glacé.
NOTE: Pour étudier les polynucléaires et mononucléaires leucocytes ensemble, passez à l'étape 6.1; d'étudier les leucocytes mononucléaires, passez à l'étape 3.3. - Ajouter 5 ml de 20% de milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) dans un tube en plastique de 15 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire au-dessus du milieu de gradient de densité. Bien que la stratification de l'échantillon, il est important de ne pas mélanger le milieu à gradient de densité avec la suspension de cellules.
- Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à 4 ° C sans le frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et lOsing le gradient. Les leucocytes se trouvent à l'interface entre le milieu à gradient de densité et le tampon FACS.
- Retirer la couche supérieure qui contient les débris de la mémoire tampon et la cellule FACS très soigneusement à l'aide d'une pipette. La bande de l'interface contenant les cellules mononucléaires déciduales et une partie des leucocytes polynucléaires.
- Transférer les cellules à l'interface complètement dans un nouveau tube de plastique de 15 ml. Ajouter au moins 3 fois plus de volume de tampon FACS.
- Centrifuger à 300 g pendant 5 min à pastiller les cellules. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec un tampon FACS. Pastiller les cellules avec un autre centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante.
REMARQUE: Pour effectuer la culture de cellules, voir l'étape 4. Pour effectuer le tri de cellules, voir l'étape 5. Pour effectuer immunophénotypage, voir l'étape 6.
4. Applications - culture cellulaire
- Re-suspendre les cellules de l'étape 3.7 dans 1 ml de milieu de culture RPMI 1640. Compter les cellules viables using un compteur automatique de cellules ou d'un hémocytomètre et une solution bleu trypan 0,4%.
- Additionner la quantité de milieu de culture RPMI pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml. Les cellules sont maintenant prêts pour la culture.
5. Les demandes - Isolement de macrophages pour la culture de cellules primaires
- Pour isoler CD14 + cellules magnétiquement marquer les cellules de l'étape 3.7 avec des microbilles CD14 (20 perles de pi par 10 7 cellules), incuber pendant 15 min à 4 ° C, et CD14 séparé + cellules d'autres types de cellules par application d'un champ magnétique. Après 2 lavages avec du tampon MACS et le retrait du champ magnétique, éluer les cellules CD14 + retenues magnétiquement avec un tampon MACS.
- Après la centrifugation, remettre en suspension les culots cellulaires dans du milieu de culture RPMI 1640. Les cellules sont prêtes pour le placage (Figure 2).
6. Applications - IMMUNOPHENOTYPAGE
- Pour utiliser les cellules pour immunophenotyping, re-suspendre les cellules de l'étape 3.7 dans 1 ml de PBS 1x. Compter les cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre et une solution de bleu trypan à 0,4%.
- Étiqueter les cellules avec un colorant de viabilité peut être fixée (figure 3). Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension les cellules dans du tampon de coloration. Incuber avec un bloqueur FcR pendant 15 min à 4 ° C.
- Ajouter les anticorps conjugués à des fluorochromes extracellulaires. Par exemple, dans ce protocole, en utilisant l'anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15, anti-CD56 et des anticorps (tableau 1). Incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Après deux lavages avec 1 x PBS, les cellules seront analysés dans 500 ul de tampon de coloration en utilisant un cytomètre de flux. Une représentation de la stratégie de déclenchement utilisé pour analyser les sous-populations de leucocytes présents dans les tissus déciduales est représenté sur la Figure 4.
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Representative Results
. La dissection de tissus humains à l'interface materno-fœtale (caduque basale et caduque parietalis) est représenté en figure 1 Cette procédure comprend la dissection de la plaque de base, qui comprend les caduque basale (Figure 1A - D). Le basalis caduque est obtenue en enlevant la villosités placentaires (côté fœtal) à partir de la plaque de base (Figure 1C). Le parietalis caduque est recueilli par grattant doucement la membrane chorionique (figure 1E - F). La figure 2 montre la morphologie des macrophages isolés (CD14 +) de recueillies auprès des parietalis caduque dans un terme de la grossesse à l'aide de tri cellulaire magnétique. Macrophages isolés maintenu la capacité de libérer des cytokines après 3 jours de culture (données non présentées). Le rendement en cellules viables isolées des caduque basilaire et parietalis caduque est représenté sur la figure 3, et elle est supérieure à 90% dans les deux.
Figure 1. Human materno-fœtale Interface:. Placenta et les membranes chorioamniotic (A) plaque basale est disséquée du placenta; (B) la plaque de base est séparée de la villosités placentaires; (C) placentaire villosités est rognée de la plaque basale y compris les caduque basilaire; (D) caduque basa lis est rincée dans 1x PBS; (E) un fragment de la membrane chorionique est obtenu et les caillots de sang sont délicatement retiré; (F) caduque pariétale en frottant délicatement; et (G) parietalis caduque (en pointillés) est séparée de la membrane chorionique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. macrophages déciduales en culture. Les macrophages (piles CD14 +) ont été isolés à partir des parietalis caduque au terme de la grossesse. Les macrophages ont été étalées dans des lames à chambres en matière plastique avec RPMI1640 + 10% FBS + 1% de pénicilline-streptomycine + 50 ng / ml MCSF. Les photos ont été prises au moment de placage (A) et après 3 jours de culture (C).3 / 52863fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. viabilité cellulaire total. Viabilité du nombre total de cellules isolées à partir des caduque basale et la parietalis caduque a été déterminée gradient de densité suivante en utilisant un colorant de viabilité fixable (étape 6.2). La viabilité des cellules isolées est> 95%, selon la coloration de la viabilité des cellules vivants / morts. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Stratégie gate pour les sous-populations de leucocytes décidual. Les leucocytes ont été fermée avec FSC et SSC. Les cellules vivantes ont ensuite été déclenchés en fonction de la grille de la viabilité (Live). Les cellules viables ont été séparés en neutrophils (CD15 +) et les macrophages (CD14 +). La population CD14-CD15- a ensuite été séparé en cellules NK (CD3-CD56 +), les cellules NKT (CD3 + CD56 +), les cellules T (CD3 +) et les cellules B (CD19 +). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure sous-populations de 5. de leucocytes dans les tissus déciduales neutrophiles (CD15 +) et les macrophages (CD14 +) ont été bloqués à l'intérieur de la porte de la viabilité; Cellules T (CD3 +) et les cellules B (CD19 +) ont été bloqués à l'intérieur de la porte de CD14-CD15-. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. leucocytes Rare sous-populations de l'DECIDtissus UAL. cellules NK (CD56 +) et les cellules NKT (CD56 + CD3 +) ont été bloqués à l'intérieur de la porte de CD14-CD15-. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| liste des anticorps | Entreprise | Catalogue No. |
| CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen anti-humaine | BD Biosciences | 557747 |
| CD15-BV605 BD Horizon anti-humaine | BD Biosciences | 562980 |
| CD14-BUV395 BD Horizon anti-humaine | BD Biosciences | 563561 |
| CD19-BUV737 BD Horizon anti-humaine | BD Biosciences | 564303 |
| CD3 Brilliant Violet 650 anti-anticorps humain | Biolegend | 317323 |
Tableau 1. Liste des anticorps utilisé pour leucocytes sous-ensemble immunophénotypage
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Discussion
Caractérisation des propriétés fonctionnelles et phénotypiques de l'infiltration des leucocytes à l'interface materno-fœtale humaine est essentielle pour la compréhension des mécanismes immunitaires qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites pour isoler les leucocytes de l'interface materno-fœtale humaine pendant la grossesse 10,14,25,28,37,42,43. Cependant, chacune de ces techniques est distinct, met en oeuvre des enzymes ou des combinaisons d'enzymes différentes, nécessite des temps de dissociation, ne précise pas les quantités de tissu, et, surtout, ne précise pas toujours la viabilité des cellules isolées. Le protocole décrit ici permet l'isolement des leucocytes infiltrant à l'interface materno-fœtale humaine (caduque basale et caduque pariétale) résultant en un rendement élevé de viabilité et fournit des informations détaillées sur les réactifs commerciaux, la préparation de la mémoire tampon, les quantités de tissu, et des temps d'incubation validaTed dans notre laboratoire.
La première étape critique du procédé d'isolement des leucocytes est dissociation du tissu; cette étape implique la déségrégation mécanique et / ou dissociation enzymatique. Désagrégation mécanique est effectué avec succès par raclage lorsque le chorion isoler la caduque pariétale (figure 1F) et en coupant les villosités placentaires de la plaque de base lors de l'isolement des caduque basilaire (figure 1c) 10,28. Par conséquent, le protocole décrit ici comprend à la fois des procédures comme des étapes initiales. Cependant, il est important de considérer que la plaque de base (des tissus maternels) et les villosités placentaire (des tissus fœtaux) sont intimement liés, ce qui peut entraîner la contamination des leucocytes fœtales lorsqu'on isole des leucocytes caduque basale. Pour éviter la contamination du fœtus, le protocole recommande ici lavage de la plaque de base garnie deux ou trois fois (figure 1D). Après grattage de cellules ou de tailledes caduque basilaire ou parietalis caduque, une étape supplémentaire de la désagrégation des tissus mécanique a été recommandé 39. Cette étape est recommandée parce que les leucocytes infiltrants à l'interface expriment des molécules d'adhésion cellulaire materno-fœtales qui les attachent fermement à la matrice extracellulaire 6,7. Par conséquent, le protocole décrit ici implique la désagrégation mécanique avec un dissociateur automatique de tissu qui augmente la cohérence tout en économisant du temps et de la main-d'œuvre par rapport à hachage traditionnel avec des scalpels, lames de rasoir, des ciseaux chirurgicaux ou 10,28.
Une seconde étape critique dans le processus de dissociation des tissus est dissociation enzymatique. Enzymes simples et une combinaison de différentes enzymes ont été utilisés pour isoler les leucocytes infiltrant des caduque basale et caduque parietalis 10,14,25,28,37,42,43. Dans de nombreux cas, ces enzymes préparés à une certaine concentration à la main dans le laboratoire peut être sujette à l'erreur humaine. Ici, au contraire, un prêt-à-utilisation de la collagénase purifiée / protease neutre cocktail, Accutase, a été mis en œuvre dans le laboratoire; comme une enzyme commerciale, il a été montré pour fournir des résultats fiables en culture cellulaire 51. Accutase (une solution de détachement cellulaire) est connu pour détacher efficacement les macrophages de plaques de culture sans gratter et, surtout, sans perdre antigènes de surface 51. Cette enzyme préparée a également été utilisé pour traiter la digestion des tissus du système nerveux humaine et animale, conduisant à des cellules viables qui restent isolées durable pendant une longue période qui, dans le temps, permet de leur culture 52 cellulaire. De plus, cette solution conserve une antigénicité également CD24 dans les cellules isolées à partir de tissus du système nerveux central 52. Lorsque comparé à Libérase-1, un autre cocktail de la collagénase et la protéase neutre, ni Accutase ni Libérase-1 générer des agrégats d'ADN libres; cependant, est Accutase gEntler que Libérase-1 au cours de la dissociation des tissus 52. Pour cette raison, ne se dissocie pas Accutase agrégats de cellules après la digestion 52. Pour surmonter cette limitation, le protocole décrit ici, comprend la désagrégation du tissu automatique des caduque basilaire et caduque parietalis avant la dissociation du tissu avec la solution. Accutase a également démontré sa supériorité à la trypsine dans la préservation de CD44, une tige de cancer surface cellulaire marqueur 53. Les études de notre laboratoire ont toujours souligné que la solution détachement conserve les antigènes de surface. En effet, les différences entre les troubles de la grossesse et les grossesses normales ont été trouvées dans l'expression de plusieurs marqueurs extracellulaires et intracellulaires dans les macrophages (CD14 + cellules), les neutrophiles (cellules CD15 +), des cellules T (CD3 + cellules), et les cellules B (CD19 + cellules), comprenant CD80, CD86, CD163, CD209, ICAM3, CD45RO, CD45RA, CXCR3, CCR7, CCR6, CD4, CD8, CD25, FOXP3, CD24, CD38, CD27, CD38, CD43, CD23, IgM, IgD, CD5, T-bet, GATA-3, et RORγt, et la libération de cytokines. Par conséquent, le protocole décrit ci-après est optimal pour l'immunophénotypage des leucocytes d'infiltration à l'interface materno-fœtale humaine comme le montrent les résultats représentatifs.
Un avantage important du protocole décrit ici est qu'il permet l'isolement des leucocytes avec un rendement élevé de cellules viables. Les données représentant montre que> 90% des cellules sont viables isolées. Ceci est d'une grande importance que ce protocole a permis l'étude des propriétés fonctionnelles des cellules isolées à partir de tissus humains à l'interface materno-fœtale. Par exemple, les cultures des macrophages déciduales et l'étude de la libération de cytokines sous stimulation ont été réalisées en utilisant ce protocole.
Pour obtenir de bons résultats en utilisant le protocole décrit, il est important de considérer les facteurs suivants: 1) Collecti de tissussur doit être effectuée dans 1-2 heures après l'accouchement, et de ces tissus doivent être placés dans un récipient avec 1x PBS à 4 ° C pour préserver la viabilité des cellules isolées; 2) la désagrégation des tissus mécanique doit être réalisée en utilisant un homogénéisateur automatique à la fois validées, comme décrit dans ce protocole; 3) la durée de l'incubation avec la solution de détachement de la cellule doit être inférieure à 1 heure depuis son activité après ce temps diminue; 4) la température de l'incubation avec la solution de détachement des cellules doit être maintenue à 37 ° C pour obtenir une activité optimale de l'enzyme présente; 5) la manipulation de culot cellulaire doit être fait doucement avec micropipettes parce que l'utilisation du vortex peut endommager l'intégrité des cellules (rappelez-vous que les cellules isolées sont différenciées et la manipulation brusque peut facilement réduire leur viabilité); 6) tampon et à des températures de centrifugation doivent être maintenus à la même température que la suspension de cellules; 7) des cellules isolées doivent être traitées pour immunophénotypage ou utilisés immément que de leur viabilité diminue rapidement; et 8) lors de l'exécution immunophénotypage, les échantillons doivent être acquises en utilisant un cytomètre de flux immédiatement pour de meilleurs résultats.
Une des limitations de ce protocole est le coût de Accutase, qui est plus cher que d'autres enzymes ayant des fonctions similaires, par exemple, la trypsine, la dispase II, et la collagénase. Toutefois, les avantages que Accutase affiche au-delà de ces enzymes sont supérieurs. Une deuxième limitation du protocole est l'exigence d'un dissociateur tissulaire automatique, ce qui est un instrument de laboratoire commun et, par conséquent, peut être coûteux. Pour surmonter cette limitation, la désagrégation du tissu peut également être réalisée à l'aide de petits ciseaux chirurgicaux; Cependant, cette étape ne peut pas dépasser 3-5 minutes depuis de longues périodes ont été démontrées pour réduire le rendement des cellules viables. Tous les dissociations doivent être effectués par le même chercheur pour minimiser la variabilité.
En résumé, le proProtocole propose ici une nouvelle approche qui combine l'utilisation de techniques mécaniques et enzymatiques douces dissociation de tissu à préserver l'intégrité des marqueurs extracellulaires et intracellulaires dans les leucocytes isolés à partir des tissus humains à l'interface materno-fœtale. Mis à part l'immunophénotypage, culture cellulaire, et le tri de cellules, les applications futures de ce protocole sont nombreuses et variées. Nous avons réussi à utiliser ce protocole pour isoler des leucocytes déciduales pour les études in vitro de la fonctionnalité de leucocytes (ie, la cytotoxicité, de la prolifération des cellules T et la plasticité, etc.), et la production d'espèces réactives de l'oxygène dans les leucocytes isolés à partir de tissus déciduales (données non représenté). En effet, en utilisant le protocole décrit, notre laboratoire a été en mesure de décrire les leucocytes nouvelles et rares à l'interface materno-fœtale.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Eunice Kennedy Shriver Institut national de la santé infantile et le développement humain, NIH / DHHS. Ce travail a également été soutenue, en partie, par l'Initiative de l'Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l'enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty (Wayne State University) pour ses lectures critiques du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection | |||
| Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
| Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
| Dissociation | |||
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
| Sterile 2 ml safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
| 100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
| 5 ml round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
| Transfer pipettes | Any vendor | ||
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| Cell Culture | |||
| RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
| Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
| Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
| Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
| Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
| Cell Separation | |||
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| 30 μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
| Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
| MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2 mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
| Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
| FACS buffer | (0.1% BSA, 0.05% Sodium Azide, and 1X PBS, pH=7.4) | ||
| Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media (1.077 + 0.001 g/ml) |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
| Vacuum system | Any vendor | ||
| Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator | |
References
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