Abstract
免疫耐受妊娠需要母亲的免疫系统发生，以接受和培养胎儿发育截然不同的变化。性交过程中启动了这种宽容，受精和着床过程中建立和维护整个孕期。母胎耐受性活跃的细胞和分子介质富集在胎儿与母体组织，被称为母胎界面，其中包括胎盘与子宫及蜕膜组织之间的接触部位。这个接口是由间质细胞和浸润白细胞，和它们的丰度和表型特征在怀孕过程中发生变化。白细胞浸润在母胎界面包括嗜中性粒细胞，巨噬细胞，树突细胞，肥大细胞，T细胞，B细胞，NK细胞，和NKT细胞一起创建的局部微环境，维持妊娠。这些细胞或任何inapprop之间的不平衡riate改变其表型被认为是疾病的妊娠的机制。因此，渗透到母胎界面白细胞的研究，以阐明导致妊娠并发症的免疫机制至关重要。本文中所描述的是，采用温和机械解离，随后通过一个健壮酶促解聚用蛋白分解和溶胶原酶鸡尾酒隔离从鼠组织中的白细胞浸润在母胎界面的组合的协议。该协议允许对高数量可行白细胞（> 70％）以足够保守抗原性和功能特性的分离。孤立白细胞然后可通过多种技术，包括免疫，细胞分选，成像，免疫印迹，mRNA的表达，细胞培养，并在体外功能测定法如混合白细胞反应，增殖或细胞毒性测定法来分析。
Introduction
免疫耐受怀孕是一段当母亲的免疫系统内发生截然不同的变化。这些变化让母亲忍受了胎儿，一个半同种异体移植物1。胎儿的父亲表示主要组织相容性复合体（MHC）抗原2，和胎儿细胞已经在母体循环3被发现;然而，胎儿不被拒绝4,5。这个谜尚不完全清楚。
最新的假说认为，母胎耐受性性交过程中创建和受精6,7和维护，以维持一个足月妊娠8-10。这母胎耐受的细目怀孕期间的10-16早期和晚期疾病视为一种机制。母胎容忍包括各种白细胞亚种群，包括T细胞（调节性T细胞，Th1细胞，Th2细胞，和Th17细胞），MAC的参与噬细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，NK细胞和NKT细胞，树突细胞，和B细胞，在密度和本地化这种变化在整个孕期15,17-19。母胎耐受富集在母胎界面20 -解剖位置在哪里，母亲的免疫系统与胎儿抗原相互作用20,21。
母胎界面胎盘期间，当胎儿绒毛外滋养细胞侵入子宫粘膜22-24创建。在该接口的胎侧，围绕胎儿膜创建一个专门的上皮表面的胎盘内，并且合体细胞控制与母体血液22通过其直接接触的物质交换。在界面的母体侧，蜕膜募集在小鼠占30％至所有蜕膜细胞的50％的白细胞的异质池。除了它们在matern参与人免疫耐受，这些细胞是主要贡献者怀孕期间不同的过程， 例如 ，在保护免受感染，受精生殖道，胚胎着床7.25，蜕膜血管26，血管重构24,27，滋养细胞浸润28，胎盘发展24,25，以及最终，生产和分娩15,17。因此，参与母胎耐受性白细胞的研究是必不可少的阐明了妊娠并发症的发病机制。
虽然使用免疫组织化学和免疫已产生的数据的直接可视化和子宫，蜕膜，胎盘或白细胞29,30的定位，流式细胞仪分析进一步揭示白细胞的特定子集在这些组织中31,32。此外，流式细胞仪已被用来确定密度和脑膜的比例NAL-母胎界面白细胞33和表达水平外和细胞内的蛋白质8-10,34的。流白细胞术分析在母胎界面需要一个单细胞悬液。为了从蜕膜，子宫和胎盘组织中分离白细胞浸润，组织离解的两种方法已被用于：机械和酶。这两种方法都允许渗透白细胞从这些组织的细胞外基质（ECM）的分离。酶组织离解优于机械组织离解，因为它允许更高的产率白细胞较少剪切力相关损害35。因此，机械组织解离需要汇集组织36，其可以增加样品的变异性和非均质性。然而，机械解离可能是选择，当目的抗原可以通过酶解或当改变细胞的功能感兴趣的需要s到被保留（ 例如 ，NK细胞的细胞毒性）35。
使用蛋白水解与特定的酶降解的ECM消除了低收率和机械解离观察。一些研究报告用32胰蛋白酶，胶原酶37，DNA酶31，分散酶38，以及各种酵素32,39的商 业鸡尾酒。然而，性质和不同的酶浓度和消化的持续时间，必须精心定义和验证，以确保维持所需的免疫细胞表面抗原性表位的完整性。各表面结构是由不同的酶差异易受破坏，与某些酶，如胰蛋白酶，是臭名昭著的汽提通过许多单克隆抗体所识别白细胞表面的表位。
这里介绍的是使用proteolyt的方法IC和胶原溶解酶的鸡尾酒，叫的Accutase。此酶溶液是温和足够，而在在母胎界面解离鼠组织仍然有效，并且不需要加入其它离解的试剂或血清以终止分解反应。而且，它已准备好使用所提供，虽然需要解离的时间进行验证，它比上面提到的酶40,41更加健壮。
这两种类型的组织分解的组合的利用率提高了获得的细胞的质量和数量;因此，一些研究已经实施了机械和酶解结合使用，获得满意结果31,32,37。本文所描述的协议建立和验证在我们的实验室;它使用了一个温和的机械解离，随后通过一个健壮的酶分解的组合。该协议允许的分离和进一步研究在白细胞浸润在小鼠组织在母胎界面（子宫，蜕膜，胎盘）。以下协议也保持了细胞表面标记物和产率足够的活细胞用于下游应用程序的完整性就证明了流式细胞术分析。最后，该协议维持细胞制备的分析和构成母胎界面不同小鼠组织的比较一致。
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Protocol
与之前在此协议中提到的样品工作，动物伦理委员会批准，必须由当地研究伦理委员会和机构审查委员会给出。当与动物血，细胞，或如本协议的有害因素的工作，适当的生物安全和实验室安全的行动必须遵循的。
1.鼠标操作和组织收集
- 准备一个无菌工作站，并获得无菌工具组织收集。这些工具将包括大型和小型手术剪，钳，细尖镊子。包括标记有相应的组织名称小培养皿，填充有1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（3 - 5ml）中平衡至室温（20 - 22℃）。还包括一个大培养皿，未标记的，填充用1×PBS溶液（10 - 15毫升）中。
- 安乐死一个孕鼠（10.5至19.0天后交配（DPC）或交付前）使用二氧化碳（CO 2）。以确保该鼠标安乐死，使用颈椎脱位技术。
注：在10.5 DPC，则难以手动从子宫组织中分离的蜕膜组织。如果不需要蜕膜白细胞的分离，从非妊娠小鼠的子宫组织或那些来自小鼠白细胞<10.5 DPC也可以通过以下这种协议进行的。 - 使用一对无菌手术剪刀，彻底去除皮肤和肌肉组织的下腹部。用钳子，将抛开一切其他器官，直到子宫和卵巢是可见的。与子宫还连着，使用镊子将其移动腹膜腔（ 图1A）的外部。
- 定位远端每个子宫角的输卵管和uterotubal结卵巢。使用小手术剪，做一个切口在uterotubal交界处，分离含有子宫血管肠系膜子宫角;那么，切除在子宫颈分离从腹膜腔（ 图1B）的子宫角。
- 与小手术剪，使子宫颈和子宫角的下段之间的切口。休假在此过程中（ 图1C）附子宫颈的一部分，以避免打开子宫角。
- 浸入子宫角（包括子宫颈）在一个大培养皿填充用1×PBS溶液（10 - 15毫升）中，以水化植入位置。
- 虽然还沉浸在1X PBS液，修剪任何脂肪从子宫角与小手术剪。保持浸渍在整个解剖的1×PBS溶液中的组织。
- 保持子宫角的地方与镊子，除去从通过间注入区切的横向子宫植入位点之一，用小的外科剪刀（ 图1D）。植入部位包括胎儿，被包围绒毛尿囊膜，和子宫，蜕膜和胎盘组织。
- 使用镊子，保持现场到位并作一小切口在相邻的胎盘和蜕膜（ 图1E）在子宫壁。修剪周围胎盘/蜕膜的周边，直到这些来自两个子宫壁和绒毛尿囊膜，其包括胎儿（ 图1F）变得分离。
- 取出胎盘和连接蜕膜组织和地方1X PBS液（3 - - 5毫升，见步骤1.12）。
- 放置由附着在子宫组织在培养皿中填充用1×PBS溶液中的绒毛尿囊膜包围的胎儿（3 - - 5毫升）中。这些组织的水合将促进从子宫壁的绒毛尿囊膜的分离（见步骤1.14）。
- 用一双细尖镊子，轻轻剥离从胎盘表面的蜕膜组织（白灰色层）。执行此步骤仔细维持胎盘及蜕膜组织（ 图1G）的完整性。
- 放置在两个独立标记的培养皿填充用1×PBS溶液中的胎盘和蜕膜（3 - 各5ml）。
- 轻轻地从尿囊膜用细尖镊子取出子宫壁。这些是子宫组织。
- 将子宫组织在培养皿中填充用1×PBS溶液（3 - - 5毫升）中。
- 重复步骤1.8至1.15，直到所有植入部位都已经被处理。
- 收集几个子宫，蜕膜和胎盘组织，以改善细胞的酶消化过程中的产率。组织的量取决于产仔;然而，白细胞隔离要求> 2个组织。
注：有关在不同妊娠天着床部位的解剖更详细的信息，查看的指南Investigati第二章中的图片对小鼠妊娠42。
2.子宫，蜕膜和胎盘组织离解
- 标号几个无菌2毫升锥形管具有适当的组织名称，并放置一个小瓶1000微升在冰上酶溶液。
- 从培养皿填充用1×PBS溶液，转移两块 - 子宫，蜕膜或胎盘组织的（100 150毫克）到一个标记为2毫升锥形管中。
- 加入500微升冷酶溶液成每次2毫升锥形管中。
- 用细无菌剪刀，开始分解浸泡在酶溶液的组织，直到它被剁碎。随着时间的推移，暂停将开发一个乳白色的外观。此步骤不应超过超过2分钟，以防止过度操纵样品。
- 一旦组织已被解离，添加一个额外的500微升冷酶溶液以2毫升锥形管中。
- 放置2毫升锥形管在冰上。
- 重复步骤2.2至2.6与每个单独的组织，直到所有的组织都已经被处理。
- 转让全部2毫升锥形管与组织匀浆（组织糜+酶溶液）的样品从冰变成一个孵化器在37ºC和执行温和的轨道搅拌（80转）。温育30 - 35分钟。确保培养箱的温度开始培养时间之前是稳定的。
- 孵育后，除去2毫升锥形管中从培养箱解离组织，并将其放置在冰上，以防止任何进一步的消化。
- 按照组织类型的标签无菌50ml锥形管。取下盖子，并将它们与一个无菌细胞过滤器（100微米孔径）替换。
- 倾从2毫升通过细胞过滤锥形管使用离解的组织约20毫升的1×PBS溶液。组织的碎片会保留在细胞过滤并将细胞悬浮液将通过它。
- 洗迪在细胞过滤ssociated组织2 - 3次用20ml的1×PBS溶液，用移液管。
- 冲洗空2毫升锥形管用1×PBS溶液（1毫升）中，并通过细胞过滤器倾的内容。
- 从取出50毫升锥形管的细胞过滤器和更换盖子。离心管在1250×g离心10分钟，在4ºC。
- 仔细，吸出上清液，而不会干扰细胞沉淀。将细胞沉淀包含所述分离的白细胞和基质细胞。
- 重悬在1ml的RPMI培养基中的细胞沉淀无胎牛血清（FBS）。轻轻混匀。不要使用旋涡。
- 加入500μl整齐的FBS为5ml的聚苯乙烯塑料管，慢慢地覆盖细胞悬液。
- 离心机在1100×g离心10分钟，不制动在RT以沉淀的活细胞，而细胞碎片被保持在PBS / FBS的接口。
- 吸出上清液而不触及细胞沉淀。该CEL升颗粒主要含有活细胞。
- 任选：要集中的单核细胞，用20％的饱和多糖溶液，如下所述。
- 重悬在1000微升的RPMI培养基中的细胞沉淀无FBS中。
- 加入1毫升20％饱和多糖溶液以5ml的聚苯乙烯塑料管和慢慢重叠在该溶液顶部的细胞悬浮液，根据制造商的说明。而层叠的样品，避免混合与细胞悬浮液在20％的饱和多糖溶液。
- 离心机摆动出转子在500 XG 30分钟，在室温下不带刹车。它是关闭的制动，以避免混合细胞和丢失的梯度非常重要。单核细胞将在20％的饱和多糖溶液和1×PBS溶液之间的界面上被发现。
- 吸并弃去上清液。将细胞沉淀主要含有单核细胞。
没有TE：要执行的可行性染色和细胞内染色，见步骤3.要进行免疫，请参阅步骤4.要进行可行性染色，只有外染色，见第5步要执行分离白细胞的细胞培养，见步骤6.要执行磁性细胞分选，见第7步。
3.活力染色的细胞可固定
- 重悬在1100微升的1×PBS溶液中的细胞沉淀。轻轻混匀用微量移液器。
- 转移100微升细胞悬浮液到5ml的聚苯乙烯塑料管。加入400微升的1×PBS溶液向5毫升聚苯乙烯管中。该管是用于组织自发荧光的控制。储存在4ºC，直到步骤3.5。
- 传输剩余1000微升细胞悬浮液到一个新的5毫升聚苯乙烯塑料管。加入1μl的生存能力染料并轻轻均质。孵育在黑暗中30分钟，在4ºC。
- 孵育后，添加1000＆＃181;升1X PBS液。用手轻轻混匀。
- 离心机既5毫升聚苯乙烯塑料试管（步骤3.2和3.3）以1250×g离心10分钟，在4ºC。吸并弃去上清液。
注意：将细胞沉淀（步骤3.3）将用于在第4步将细胞沉淀（步骤3.2）将作为组织自发荧光的控制。
4.免疫分型
- 重悬细胞沉淀中加入50μl抗小鼠CD16 / CD32的（稀释1：在FACS缓冲液100 [0.1％BSA，0.05％叠氮化钠，1×PBS溶液，pH为7.4]）。轻轻混合细胞悬液。不要使用漩涡。
- 孵育细胞悬浮液中在黑暗中的5毫升聚苯乙烯管中，在4℃下进行10分钟。
- 孵育后，加入50微升每种抗白细胞单克隆抗体与细胞外的细胞表面标记或同种型匹配对照抗体反应（抗体稀释液必须验证）。例如，为了分析白细胞亚群，使用防摩使用的抗体与下列白细胞的细胞表面标记物进行反应：CD45，Ly6G，F4 / 80，的CD11c，CD49b，B220，CD3，CD4，和CD8（ 表1）。
- 一旦抗外标记已被添加到中的5毫升的聚苯乙烯塑料管，轻轻混匀。孵育在黑暗中为30分钟，在4℃。
- 在这段温育，准备和预温热的固定缓冲液（用去离子水稀释，1：5）如果需要的话，以37ºC，。保持在缓冲液中于37ºC在黑暗中直到它的使用是必要的。
- 经过30分钟孵化，在中的5毫升的聚苯乙烯塑料管加入500μlFACS缓冲液，并轻轻拌匀。此步骤是必要的，以洗涤细胞，并除去过量的未结合的抗体。
- 离心样品在1250×g离心在4℃下进行10分钟。吸并弃去上清液。
注意：如果不需要的细胞内染色，参见步骤5。如果细胞内染色是必需的，则执行透和小区内ular染色这里，然后进行固定（步骤4.8）。 - 添加预热的固定缓冲液中的细胞沉淀在500微升并在37ºC孵育在黑暗中10分钟。
- 免除500微升FACS缓冲成中的5毫升的聚苯乙烯塑料管。轻轻混匀。
- 离心样品在1250×g离心在4℃下进行10分钟。吸并弃去上清液。
- 加入500微升FACS缓冲液到每个样品中。这些样品现在可以通过流式细胞术进行分析。立即获取的样品，以取得最佳效果。
5.活力染色的细胞无法修复
- 胞免疫后，重悬在500μlFACS缓冲液将细胞沉淀。
- 加入1微升4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，200微克/毫升）刚刚采集样品之前。
- 使用流式细胞仪加入DAPI后2分钟 - 可视内1的样品。
- 准备在无菌通风柜的工作站。使用水浴预暖的RPMI培养基至37℃。
- 重悬细胞沉淀1000微升FACS缓冲液用于细胞计数。
- 计数存活的细胞用自动细胞计数器或血球和0.4％台盼蓝溶液的数量，下面的制造商的说明。记录总活细胞计数。
- 离心将细胞在1250×g离心在4℃下进行10分钟以去除FACS缓冲液。
- 轻轻吹打2至3倍重悬在500μl预热的RPMI培养基中的细胞沉淀。
- 板单元的期望数量在无菌的24孔板中并在37℃。孵化时间将所研究的问题而定。
7.磁性细胞分选
- 设置一个干净的工作站与下列物质：MS色谱柱，磁性细胞分离器，15毫升锥形管，30微米预分离过滤器，和一个多底座。
- 重悬在500μl的MACS缓冲液（0.5％BSA，2mM的EDTA，1×PBS溶液，pH7.2）中的细胞沉淀。
- 使用自动细胞计数或血球和0.4％台盼蓝溶液，计数和记录总活细胞计数。
- 离心细胞在1250×g离心在4℃下进行10分钟。吸并弃去上清液。添加另一个500微升MACS缓冲。
- 继续执行磁选按照制造商的建议。
- 确定纯度通过流式细胞仪或显微镜。
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Representative Results
从母胎界面小鼠组织的解剖示于图1;此过程包括打开腹膜腔（ 图1A，B），子宫角（ 图1C），包括植入位置（ 图1D），和子宫组织的集合（ 图1E），胎盘（ 图1F）和蜕膜（ 图1G），在16.5 DPC。 图2示出了分离的巨噬细胞的形态（F4 / 80 +）的蜕膜和子宫组织在16.5 DPC使用磁性细胞分选收集的。孤立的巨噬细胞保持以释放细胞因子（数据未示出）的能力。活细胞从蜕膜，子宫和胎盘中分离的产率示于图3和细胞活力是在所有的组织中大于70％。 图4示出了门控策略进行分析polymorphonucle的单峰和生存能力闸门内芳和单核白细胞，包括T细胞（CD45 + CD3 +），嗜中性粒细胞（CD45 + Ly6G +），巨噬细胞（CD45 + F4 / 80 +），树突细胞（CD45 +的CD11c +）和NK细胞（CD45 + CD49b +）为16.5 DPC。比例高的巨噬细胞共表达的CD11c的。 图5示出嗜中性粒细胞，巨噬细胞和T细胞的蜕膜，子宫和胎盘组织在16.5 DPC。 图6示出了门控策略进行分析淋巴细胞的单峰和生存能力闸门内，包括T细胞（CD45 + CD3 +）和B细胞（CD45 + B220 +）为16.5 DPC。 T细胞包括CD4 +和CD8 + T细胞。在母胎界面鼠组织还包括CD3 + CD4-CD8-（γ-δT细胞）的高比例。 图7示出了T细胞和B细胞的蜕膜，子宫，并且在16.5 DPC胎盘组织。
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图1.组织解剖。（A）在子宫16.5 DPC在B6小鼠角。子宫角附着在肠系膜和排水容器。 （B）的子宫角从肠系膜解剖并仍附着到子宫颈。 （ 三）子宫角，包括植入部位及宫颈。 （四）解剖植入部位。 （ 五）从解剖植入部位的子宫组织的。 （F）分离植入部位的胎盘和蜕膜。从胎盘蜕膜（白灰色层）（G）支队。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.巨噬细胞分离蜕膜和子宫组织。巨噬细胞（F4 / 80 +细胞）从蜕膜和子宫组织16.5 DPC使用磁性细胞分选分离出来。 20X放大。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.生存能力分离细胞。蜕膜，子宫和胎盘组织中分离活细胞（用箭头表示的DAPI-细胞）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图4.浇注战略和多形单核白细胞。白细胞总数人口的汗衫和活力门门控范围内。 T细胞（CD45 + CD3 +），巨噬细胞（CD45 + F4 / 80 +），嗜中性粒细胞（CD45 + Ly6G +），树突细胞（CD45 +的CD11c +）和NK细胞（CD45 + CD49b +）的总白细胞栅内进行门控（ CD45 +）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.嗜中性粒细胞，巨噬细胞和T细胞在母胎界面鼠组织。嗜中性粒细胞（CD45 + Ly6G +），巨噬细胞（CD45 + F4 / 80 +），和T细胞（CD45 + CD3 +）的可行性内进行门控和总白细胞（CD45 +）在分离的蜕膜，子宫和胎盘细胞栅极。TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图6.门控战略淋巴细胞。单个核细胞的汗衫和活力门中门控。 T细胞（CD3 +）和B细胞（B220 +）的可行性栅内进行门控。 CD4 +和CD8 + T细胞的T细胞门（CD3 +）内门控。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7.淋巴细胞亚群在小鼠组织在母胎界面。T细胞（CD3 +）和B细胞（B220 +）的在隔离的蜕膜，子宫和胎盘细胞的生存能力栅内门控。 CD4 +和CD8 + T细胞的T细胞门（CD3 +）内门控。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 细胞标记物 | 荧光 | 克隆 | 公司 | 目录编号 |
| LIVE / DEAD | DAPI | - | Life Technologies公司 | L23105 |
| CD45 | V450 | 30-F11 | BD Biosciences公司 | 560501 |
| CD3 | FITC | 145-2C11 | BD Biosciences公司 | 553062 |
| CD4 | APC | RM4-5 | BD Biosciences公司 | 553051 |
| CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | BD Biosciences公司 | 562283 |
| B220 | APC-Cy7的 | RA3-6B2 | BD Biosciences公司 | 552094 |
| F4 / 80 | PE | BM8 | eBiosciences | 12-4801-82 |
| Ly6G | APC-Cy7的 | 1A8 | BD Biosciences公司 | 560600 |
| CD49b | APC | DX5 | BD Biosciences公司 | 560628 |
| 的CD11c | PE-Cy7的 | HL3 | BD Biosciences公司 | 558079 |
表1.抗体的名单用于白细胞免疫的子集
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Discussion
它记录白细胞浸润的数量和表型特征在母胎界面一致的数据收集是必不可少的理解妊娠并发症的发病机制。几种技术已经描述了促进浸润从在母胎界面的鼠组织白细胞整个怀孕31,38,39,43-46的分离。然而，每种技术不同的是，使用不同的酶或酶组合，需要不同的解离时间，不指定组织的数量时，以及最重要的是，并不总是指定分离的细胞的生存能力。本文所描述的协议允许渗透从鼠组织白细胞在具有高存活率母胎界面的隔离，并提供了有关商用试剂验证在详细信息，缓冲制剂，组织数量时，及温育时间实验室。
之一的白细胞分离过程中最关键的步骤之一是组织离解;这个步骤涉及机械均质化和/或酶反应，可以改变在表型特征47使用胞外蛋白的完整性。本文描述的协议提供了一种新的方法，结合使用温和的化学和酶组织分离技术，以保持在从胎盘和小鼠的蜕膜和子宫组织中分离白细胞外标记的完整性。
单一酶和不同酶的组合已被用于分离从小鼠组织白细胞浸润在母胎界面31,32,39,44。在许多情况下，在实验室中制备的，以特定浓度的手，这些酶可能受到人为错误。在这里，而是一个随时可以使用的纯化胶原酶/中性PROT缓解鸡尾酒的Accutase，已经在实验室中实现;作为市售的酶制剂，它已被证明是提供在细胞培养物48可靠的结果。此酶溶液是已知的，有效地分离从培养板的巨噬细胞不刮，而最重要的是，不失去表面抗原48。此制备的酶也已用于处理人类和动物的神经系统的组织的消化，导致有活力的分离的细胞仍可持续很长时间，这使得他们的后续培养47。此外，这种酶溶液保持CD24抗原的细胞分离自中枢神经系统组织47。时相比，LIBERASE-1，胶原酶和中性蛋白酶的另一种鸡尾酒，既不的Accutase也不LIBERASE-1生成游离DNA粒料;但是，是的Accutase分离组织在47比LIBERASE-1温和。胶原酶/中性蛋白酶合作在这个协议中使用cktail还展示了优越性胰蛋白酶在CD44，癌干细胞表面标记物49的保存。该实验室的研究一致指出，这种酶溶液保持鼠标白细胞表面抗原。实际上，信息的差异已发现的胞外标记物的表达的巨噬细胞（CD11b的+ F4 / 80 +细胞），嗜中性粒细胞（细胞CD11b + Ly6G +细胞），自然杀伤T细胞（CD3 + CD49b +细胞），T细胞（CD3 +细胞）和乙细胞（B220 + CD19 +细胞），包括CD4，CD8，CD69，CD25，CD40L，PD1，CD44，CD62L，和CTLA4，以及在细胞因子的释放。因此，这里所描述的方法是最佳的白细胞浸润在小鼠母胎界面，如图的代表性结果的免疫。
这种方法的一个重要的优点是同时测定的生存能力栅内的几个细胞外和细胞内抗原。染料最常用的脱termine细胞活力是碘化丙啶（PI）;然而，它的用途是有限的，因为它可以用于仅在用FITC结合。这是因为，PI，不能充分地从蓝色和红色激光器50激发大多数其他荧光区分开。一个解决办法是使用DAPI 50或通过UV激光器，但不是由蓝色和红色激光器通常用于免疫激发的任何其它染料。该协议允许活细胞的免疫表型，因为它包括使用DAPI 50的不固定的细胞或使用存活率染料为可固定细胞。
本文所描述的协议的第二个重要的优点是，它允许白细胞以高收率活细胞的分离。代表性数据显示，70％至89％的分离细胞是可行的。这是非常重要的，因为这协议允许分离的细胞从小鼠组织的功能性质的在母胎界面的研究。 F或例如，蜕膜和子宫的巨噬细胞和细胞因子释放的刺激下研究的培养已经用这种方法进行。
1）必须在5至10分钟，打开腹腔后进行组织采集，和这些组织必须放置在冰上保存的可行性：以达到成功的结果，考虑到以下因素，当所描述的协议的应用是很重要的所述分离的细胞; 2）机械组织均质化，必须使用细尖剪刀进行，并且不能超过2分钟，因为长时间已经证明减少的活细胞的产率; 3）培养与酶溶液的持续时间必须小于1小时，因为其活性这一段时间后减少; 4）必须保持温育与酶溶液的温度在37℃，得到本鸡尾酒酶的最佳活性; 5）细胞沉淀MANIPulation必须轻轻微量进行，因为使用的旋涡会损坏细胞的完整性（分离的细胞是分化的和突然的操纵可以很容易地减少其生存力）; 6）缓冲液和离心机的温度必须保持在相同的温度下将细胞悬浮液; 7）分离的细胞必须经过处理用于免疫或直接用作其可行性迅速降低; 8）进行免疫时，样品必须立即流式细胞仪为了获得最佳效果使用流动收购。
此协议的一个限制是酶溶液的成本，这是比其他的酶具有相似的功能， 例如 ，胰蛋白酶，分散酶II和胶原酶更昂贵。但是，此酶溶液显示在以上所描述的酶的优点是优异的。
除了免疫和细胞培养和排序，这个协议的应用前景是NU瓣和多样。例如，现在有可能确定在体外白细胞功能（ 例如，吞噬作用，细胞毒性，T细胞增殖和可塑性试验等 ），和生产的活性氧中的白细胞分离的DNA甲基化，靶基因的表达，从在母胎界面鼠组织。事实上，也可以进行对在母胎界面小鼠组织新的和罕见的白细胞描述。
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Disclosures
作者披露利益冲突。
Acknowledgments
NGL是由产妇，围产期和儿童健康的韦恩州立大学围产期倡议的支持。我们非常感谢莫林McGerty和Amy E. Furcron（韦恩州立大学），他们的手稿的读数。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell Separator | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μm pre-separation filters | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Multistand | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml conical tubes | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS Buffer | Militenyi Biotec | Laboratory preparation | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2) |
| Reagents | |||
| Accutase enzymatic solution | Life Technologies | A11105-01 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| Anti-mouse extracellular antibodies | BD Bioscences/eBiosciences | Table 1 | |
| Sodium azide | Fisher | S227-500 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| LIVE/DEAD viability dye | Life Technologies | L23105 | |
| Fixation buffer solution | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS Buffer | BD Biosciences | Laboratory preparation | 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4 |
| Trypan blue solution 0.4% | BIO-RAD | 145-0013 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD LSRFortessa | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| Vacuum system | laboratory constructed | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Incubator 3307 | |
| Water bath | Precision | 51221035 | |
| Cell counter | BIO-RAD | TC20 Automated Cell Counter | |
| Optical and fluorescence microscopes | Zeiss and Olympus | Zeiss LSM780 and Olympus CKX41 | |
References
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