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Immunology and Infection

Isolement de leucocytes des tissus murins à l'interface materno-foetale

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

La tolérance immunitaire pendant la grossesse nécessite que le système immunitaire de la mère subit des changements distinctifs afin d'accepter et de nourrir le foetus de développement. Cette tolérance est initiée pendant le coït, établi au cours de la fécondation et l'implantation, et maintenu pendant toute la grossesse. Médiateurs actifs cellulaires et moléculaires de la tolérance foeto-maternelle sont enrichis sur le site de contact entre les tissus foetaux et maternels, connus sous le nom de l'interface materno-fœtale, qui comprend le placenta et l'utérus et des tissus déciduales. Cette interface est composée de cellules stromales et leucocytes infiltrants, et leurs caractéristiques d'abondance et phénotypiques changer au cours de la grossesse. Infiltration des leucocytes à l'interface materno-fœtale comprennent les neutrophiles, les macrophages, les cellules dendritiques, les mastocytes, les cellules T, les cellules B, les cellules NK, les cellules NKT et qui créent ensemble le micro-environnement local qui soutient la grossesse. Un déséquilibre entre ces cellules ou tout inappropaltération riée dans leurs phénotypes est considéré comme un mécanisme de la maladie pendant la grossesse. Par conséquent, l'étude des leucocytes qui infiltrent l'interface materno-fœtale est essentiel en vue d'élucider les mécanismes immunitaires qui conduisent à des complications liées à la grossesse. On décrit ici un protocole qui utilise une combinaison de dissociation mécanique douce suivie d'une décomposition enzymatique protéolytique robuste avec un cocktail enzymatique collagénolytique et pour isoler les leucocytes infiltrant des tissus murins à l'interface materno-fœtale. Ce protocole permet l'isolement d'un nombre élevé de leucocytes viables (> 70%) avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées. Les leucocytes isolés peuvent ensuite être analysés par plusieurs techniques, y compris l'immunophénotypage, tri cellulaire, l'imagerie, immunoblotting, l'expression d'ARNm, une culture de cellules, in vitro et des essais fonctionnels tels que des réactions de leucocytes mixtes, prolifération, ou des essais de cytotoxicité.

Introduction

La tolérance immunitaire à la grossesse est une période pendant laquelle se produisent les changements distincts dans le système immunitaire de la mère. Ces changements permettent à la mère de tolérer le fœtus, une greffe allogénique semi-1. Le fœtus exprime paternelle complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) 2, et les cellules foetales ont été trouvés dans la circulation maternelle 3; Cependant, le fœtus ne soit pas rejeté 4,5. Cette énigme est pas entièrement comprise.

L'hypothèse la plus récente indique que la tolérance materno-fœtale est créé pendant le coït et la fécondation 6,7 et maintenu pour soutenir une grossesse à terme 8-10. Une ventilation de cette tolérance foeto-maternelle est considéré comme un mécanisme de la maladie au cours des premiers et derniers stades de la grossesse 10-16. La tolérance foeto-maternelle implique la participation de diverses sous-populations de leucocytes, y compris les cellules T (cellules T régulatrices, les cellules Th1, Th2, et les cellules Th17), Macrophages, les neutrophiles, les mastocytes, les cellules NK et les cellules NKT, les cellules dendritiques et les cellules B, que le changement de la densité et de la localisation pendant la grossesse 15,17-19. La tolérance materno-fœtale est enrichi à l'interface materno-fœtale 20 - le site anatomique où le système immunitaire de la mère interagit avec les antigènes foetaux 20,21.

L'interface materno-fœtale est créé lors de la placentation lorsque les cellules du trophoblaste extravilleux fœtales envahissent la muqueuse utérine 22-24. Sur le côté fœtal de cette interface, les membranes entourant le fœtus créer une surface épithéliale spécialisé du placenta, et les cellules syncytiotrophoblaste contrôler l'échange des nutriments par leur contact direct avec le sang maternel 22. Du côté de la mère de l'interface, la caduque recrute une piscine hétérogène de leucocytes chez les souris qui représentent 30% à 50% de toutes les cellules déciduales. En plus de leur participation à Materntolérance immunitaire al, ces cellules sont les principaux contributeurs à différents processus pendant la grossesse, par exemple., la protection de l'appareil reproducteur des infections, la fécondation, l'implantation d'embryons 7,25, l'angiogenèse décidual 26, le remodelage vasculaire 24,27, l'invasion du trophoblaste 28, placentaire 24,25 développement, et, finalement, le travail et la livraison 15,17. Par conséquent, l'étude des leucocytes impliqués dans la tolérance foeto-maternelle est essentielle pour élucider la pathogenèse des complications liées à la grossesse.

Bien que l'utilisation de l'immunohistochimie et l'immunofluorescence a généré des données pour la visualisation directe et la localisation de l'utérus, déciduale, ou leucocytes 29,30 placentaires, l'analyse par cytométrie en flux a révélé en outre des sous-ensembles spécifiques de leucocytes dans chacun de ces tissus 31,32. En outre, la cytométrie en flux a été utilisée pour déterminer la densité et la proportion de materInterface nal-fœtale leucocytes 33 et d'expression des niveaux de protéines extracellulaires et intracellulaires 8-10,34. Analyse des flux cytométrique des leucocytes à l'interface materno-fœtale nécessite une suspension à cellule unique. Afin d'isoler les leucocytes infiltrants du déciduale, de l'utérus et les tissus placentaires, deux méthodes de dissociation de tissus ont été utilisées: mécanique et enzymatique. Les deux procédés permettent la séparation des leucocytes infiltrés de la matrice extracellulaire (ECM) de ces tissus. Dissociation enzymatique du tissu est supérieure à la dissociation mécanique de tissu, car elle permet un rendement plus élevé de leucocytes avec des dommages moins cisaillement de force associé 35. Par conséquent, la dissociation de tissu mécanique nécessite la mise en commun des tissus 36, ce qui peut augmenter la variabilité et l'hétérogénéité des échantillons. Cependant, la dissociation mécanique peut être le choix lorsque l'antigène d'intérêt peut être modifiée par dissociation enzymatique ou lorsque la fonctionnalité de la cellules d'intérêt doivent être préservées (par ex., la cytotoxicité des cellules NK) 35.

L'utilisation de la protéolyse avec des enzymes spécifiques à dégrader l'ECM élimine les faibles rendements observés avec dissociation mécanique. Plusieurs études ont rapporté l'utilisation de la trypsine 32, 37 collagénase, DNase 31, Dispase 38, et des cocktails commerciales de divers enzymes 32,39. Cependant, la nature et la concentration des différentes enzymes et la durée de digestion doivent être soigneusement définies et validées en vue d'assurer le maintien de l'intégrité des epitopes antigéniques de la surface des cellules requises pour l'immunophénotypage. Les différentes structures de surface sont différentiellement sensibles à la destruction par différentes enzymes, avec des enzymes telles que la trypsine, qui est connu pour le décapage des épitopes de surface des leucocytes reconnus par de nombreux anticorps monoclonaux.

Introduit le présent mémoire est un procédé utilisant un proteolytic et cocktail enzymatique collagénolytique, appelé Accutase. Cette solution enzymatique est assez doux tout en performant à dissocier tissus murins à l'interface materno-fœtale, et ne nécessite pas l'ajout d'autres réactifs ou du sérum de dissociation de mettre fin à la réaction de dissociation. En outre, il est prêt à être utilisé tel que fourni et, bien que le temps de dissociation doit être validé, il est plus robuste que les enzymes mentionnées ci-dessus 40,41.

L'utilisation d'une combinaison des deux types de désagrégation du tissu améliore la qualité et la quantité de cellules obtenues; Ainsi, plusieurs études ont mis en œuvre l'utilisation combinée de dissociation mécanique et enzymatique avec des résultats satisfaisants 31,32,37. Le protocole décrit ici a été établie et validée dans notre laboratoire; il utilise une combinaison d'une dissociation mécanique douce suivie d'une décomposition enzymatique solide. Ce protocole permet l'étude d'isolement et continue desles leucocytes infiltrants dans les tissus murins à l'interface materno-fœtale (utérus, caduque, et le placenta). Le protocole suivant maintient également l'intégrité des marqueurs de surface cellulaire et des rendements de cellules viables suffisant pour les applications en aval tel que démontré par une analyse par cytométrie de flux. Enfin, ce protocole maintient la cohérence de préparation de cellules pour l'analyse et la comparaison des différents tissus murins composant l'interface materno-fœtale.

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Protocol

Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l'approbation éthique animale doit être donné par le Comité d'éthique de la recherche locale et les Institutional Review Boards. Lorsque vous travaillez avec du sang animal, cellules, ou des agents dangereux tel que mentionné dans ce protocole, les actions appropriées en matière de biosécurité et de sécurité de laboratoire doivent être respectées.

1. Manipulation Mouse et collecte de tissus

  1. Préparer un poste de travail stérile et obtenir des outils stériles pour la collecte de tissus. Ces outils incluront des grands et petits ciseaux chirurgicaux, pinces et pinces à pointe fine. Inclure de petites boîtes de Petri marquées avec les noms des tissus appropriés, remplis de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) solution (3-5 ml) équilibrée à la température ambiante (20-22 ° C). Inclure aussi une grande boîte de Pétri, sans étiquette, rempli de solution 1x PBS (10 - 15 ml).
  2. Euthanasier une souris enceinte (de 10,5 à 19,0 jours après le coït (DPC) ou avant la livraison) en utilisant du dioxyde de carbone (CO 2). Pour veiller à ce que la souris est euthanasié, utiliser la technique de la dislocation cervicale.
    Remarque: Avant 10,5 dpc, il est difficile de séparer manuellement les tissus déciduales à partir des tissus utérins. Si l'isolement des leucocytes déciduales est pas nécessaire, leucocytes à partir des tissus de l'utérus de souris non enceintes ou à partir de souris <10,5 dpc peuvent également être effectuées en suivant le protocole.
  3. En utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux stériles, supprimer complètement la partie inférieure de l'abdomen de la peau et du tissu musculaire. Avec des pinces, écarter tous les autres organes que l'utérus et les ovaires sont visibles. Avec l'utérus encore attaché, utilisez la pince pour le déplacer à l'extérieur de la cavité péritonéale (figure 1A).
  4. Repérez les ovaires distales à l'oviducte et utéro jonction de chaque corne utérine. En utilisant les petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision à la jonction utéro et séparer les cornes utérines de la mésentère contenant les vaisseaux utérins; puis,accise au niveau du col de détacher les cornes utérines de la cavité péritonéale (figure 1B).
  5. Avec de petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision entre le col et le segment inférieur des cornes utérines. Congé attaché une partie du col de l'utérus au cours de ce processus (figure 1C) pour éviter d'ouvrir la corne utérine.
  6. Immerger les cornes utérines (y compris le col de l'utérus) dans une grande boîte de Pétri remplie de solution PBS 1x (10-15 ml) pour hydrater les sites d'implantation.
  7. Alors qu'il était encore plongé dans une solution PBS 1x, couper tout le gras des cornes utérines avec les petits ciseaux chirurgicaux. Gardez les tissus immergés dans une solution de PBS 1x long de la dissection.
  8. En tenant les cornes utérines en place avec la pince, retirer l'un des sites d'implantation de l'utérus avec une coupe transversale à travers la région inter-implantation, en utilisant les petits ciseaux chirurgicaux (figure 1D). Le site d'implantation contient le foetus, entouré par lamembrane chorioallantoïque, et l'utérus, décidual, et des tissus placentaires.
  9. Utilisation de la pince, maintenez le site en place et de faire une petite incision dans la paroi utérine à côté de la barrière placentaire et les tissus déciduales (figure 1E). Garniture autour du périmètre du placenta / caduque jusqu'à ce que ceux-ci sont séparés de tous les deux la paroi utérine et de la membrane chorio-allantoïde qui comprend le fœtus (figure 1F).
  10. Retirez le placenta et les tissus déciduales attachés et le placer dans une solution de PBS 1x (3 - 5 ml; voir l'étape 1.12).
  11. Placez le fœtus entouré par la membrane chorio-allantoïde fixé aux tissus de l'utérus dans une boîte de Pétri remplie de solution 1 x PBS (3-5 ml). L'hydratation de ces tissus facilite la séparation de la membrane chorio-allantoïde de la paroi de l'utérus (voir l'étape 1.14).
  12. En utilisant une paire de pinces à pointe fine, retirez délicatement le tissu décidual (couche gris-blanc) à partir de la surface placentaire. Effectuez cetteétape avec soin pour maintenir l'intégrité de la barrière placentaire et les tissus déciduales (figure 1G).
  13. Placez le placenta et les tissus déciduales dans deux boîtes de Petri marquées séparément remplis de solution de PBS 1x (3 - 5 ml chacune).
  14. Retirez délicatement la paroi utérine de la membrane chorioallantoïque avec des pincettes à pointe fine. Ce sont les tissus utérins.
  15. Placer les tissus utérins dans une boîte de Pétri remplie de solution 1 x PBS (3-5 ml).
  16. Répéter les étapes à travers 1,8 1,15 jusqu'à ce que tous les sites d'implantation ont été traitées.
  17. Recueillir plusieurs utérine, décidual, et des tissus placentaires pour améliorer le rendement des cellules pendant la digestion enzymatique. La quantité de tissus dépend de la taille de la portée; Cependant, l'isolement des leucocytes nécessite> 2 morceaux de tissu.
    Remarque: Pour des informations plus détaillées sur la dissection des sites d'implantation sur les différents jours de gestation, voir les images trouvées dans le chapitre deux du Guide de Investigatisur la grossesse de la souris 42.

2. utérin, déciduale, et de dissociation des tissus placentaires

  1. Étiqueter plusieurs 2 ml stériles tubes coniques avec le nom de tissu approprié, et placer un flacon avec 1 000 pi de solution enzymatique sur la glace.
  2. De la boîte de Pétri remplie de solution PBS 1x, transférer deux pièces (100 - 150 mg) de l'utérus, déciduale, tissus placentaires ou à un tube conique de 2 ml étiqueté.
  3. Ajouter 500 pi de solution enzymatique froid dans chacune 2 ml tube conique.
  4. Avec des ciseaux stériles fines, commencent à dissocier le tissu plongé dans la solution enzymatique jusqu'à ce qu'il soit finement hachée. Au fil du temps, la suspension sera de développer un aspect laiteux. Cette étape ne doit pas dépasser de plus de 2 min pour éviter une sur-manipulation de l'échantillon.
  5. Une fois que le tissu a été dissocié, ajouter un supplément de 500 ul de solution enzymatique à froid le tube conique de 2 ml.
  6. Placer le tube conique de 2 ml sur la glace.
  7. Répétez les étapes 2.2 à 2.6 avec chaque tissu personne jusqu'à ce que tous les tissus ont été traités.
  8. Transférez tous les 2 ml tubes coniques avec tissu homogénéisé (tissu haché + solution enzymatique) des échantillons de la glace dans un incubateur à 37 ° C et effectuer une agitation orbitale douce (80 rpm). Incuber pendant 30 - 35 min. Assurez-vous que la température de l'incubateur est stabilisé avant de commencer le temps d'incubation.
  9. Après incubation, enlever les 2 ml tubes coniques avec des tissus dissociées de l'incubateur et les placer sur la glace pour empêcher toute nouvelle digestion.
  10. Étiquette stériles de 50 ml tubes coniques en fonction du type de tissu. Enlever les couvercles et les remplacer par un tamis cellulaire stérile (100 um de taille de pores).
  11. Pour les tissus dissocié du 2 ml tubes coniques à travers le tamis cellulaire en utilisant ~ 20 ml de solution PBS 1x. Les fragments de tissu restent dans le filtre de la cellule et la suspension de cellules passeront à travers elle.
  12. Laver le dissociated tissus dans le tamis cellulaire 2 - 3 reprises avec 20 ml d'une solution 1 x PBS à l'aide d'une pipette de transfert.
  13. Rincer les vides 2 ml tubes coniques avec une solution PBS 1x (1 ml) et verser le contenu à travers les filtres de cellules.
  14. Retirez les crépines de cellules de 50 ml tubes coniques et remplacer les couvercles. Centrifuger les tubes à 1250 g pendant 10 min à 4 ºC.
  15. Avec précaution, aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Le culot cellulaire contenant les leucocytes et les cellules stromales isolées.
  16. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de culture RPMI sans sérum bovin fœtal (FBS). Mélanger délicatement. Ne pas utiliser vortex.
  17. Ajouter 500 pl de FBS ordonnées dans un tube en plastique de polystyrène de 5 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire.
  18. Centrifuger pendant 10 min à 1100 x g sans le frein à la température ambiante pour obtenir un culot de cellules viables tout débris cellulaire est retenue à l'interface PBS / FBS.
  19. Aspirer le surnageant sans toucher le culot cellulaire. Le cell pastille contient principalement des cellules viables.
  20. Optionnellement: Pour concentrer les cellules mononucléaires, utiliser une solution de polysaccharide saturée à 20%, comme décrit ci-dessous.
    1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 000 ul de milieu de culture RPMI sans SVF.
    2. Ajouter 1 ml de solution à 20% de polysaccharide saturée à un tube de 5 ml en matière plastique et polystyrène superposer lentement la suspension cellulaire au-dessus de cette solution, conformément aux instructions du fabricant. Bien que la stratification de l'échantillon, éviter de mélanger la solution de polysaccharide saturée à 20% avec la suspension de cellules.
    3. Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à température ambiante sans frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et de perdre le gradient. Les cellules mononucléaires se trouvent dans l'interface entre la solution de polysaccharide saturée à 20% et la solution PBS 1x.
    4. Aspirer et jeter le surnageant. Le culot cellulaire contenant des cellules mononucléaires principalement.
      NonTE: Pour effectuer la viabilité coloration et une coloration intracellulaire, voir l'étape 3. Pour effectuer immunophénotypage, voir l'étape 4. Pour effectuer la viabilité coloration et une coloration extracellulaire seulement, voir l'étape 5. Pour effectuer une culture de cellules de leucocytes isolés, voir l'étape 6. Pour effectuer tri magnétique de cellules, voir l'étape 7.

3. Viabilité coloration pour les cellules fixable

  1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 100 ul de solution PBS 1x. Mélanger délicatement à l'aide d'une micro-pipette.
  2. Transférer 100 pl de la suspension cellulaire dans un tube de 5 ml en matière plastique de polystyrène. Ajouter 400 ul de solution PBS 1x au tube de polystyrène de 5 ml. Ce tube est un contrôle pour le tissu auto-fluorescence. Stocker à 4 ° C jusqu'à l'étape 3.5.
  3. Transférer les 1000 ul restants de la suspension de cellules dans un nouveau tube de plastique polystyrène de 5 ml. Ajouter 1 pi de colorant de la viabilité et homogénéiser doucement. Incuber pendant 30 min à l'obscurité à 4 ºC.
  4. Après incubation, ajouter & # 1000181; l de solution PBS 1x. Mélanger délicatement à la main.
  5. Centrifugeuse deux 5 ml Les tubes en plastique polystyrène (étapes 3.2 et 3.3) à 1250 g pendant 10 min à 4 ºC. Aspirer et jeter le surnageant.
    Remarque: le culot de cellules (étape 3.3) est utilisé dans l'étape 4. Le culot de cellules (étape 3.2) servira de contrôle de tissu auto-fluorescence.

4. Immunophénotypage

  1. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ul d'anti-souris CD16 / CD32 (dilué 1: 100 dans du tampon FACS [0,1% de BSA, de l'azide de sodium à 0,05%, solution 1 x PBS, pH 7,4]). Mélanger délicatement la suspension cellulaire. Ne pas utiliser le vortex.
  2. Incuber la suspension de cellules dans le tube de polystyrène de 5 ml dans l'obscurité à 4 ° C pendant 10 min.
  3. Après l'incubation, ajouter 50 ul de chaque anticorps monoclonal anti-leucocyte réagir avec les marqueurs de la surface cellulaire ou extracellulaire anticorps de contrôle correspondant à l'isotype (dilutions d'anticorps doivent être validées). Par exemple, pour analyser les sous-populations de leucocytes, en utilisant anti-moutiliser des anticorps réagissant avec les marqueurs de surface des leucocytes CD45 suivants: cellule, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, et CD8 (Tableau 1).
  4. Une fois que des anticorps dirigés contre des marqueurs extracellulaires ont été ajoutés au tube plastique polystyrène de 5 ml, mélanger délicatement. Incuber dans l'obscurité pendant 30 min à 4 ° C.
  5. Au cours de cette incubation, préparer et préchauffer la solution de tampon de fixation (dilué avec de l'eau désionisée, 1: 5) à 37 ° C, si nécessaire. Gardez le tampon à 37 ° C dans l'obscurité jusqu'à ce que son utilisation est nécessaire.
  6. Après 30 minutes d'incubation, ajouter 500 pi de tampon FACS dans le tube plastique polystyrène de 5 ml et mélanger délicatement. Cette étape est nécessaire pour laver les cellules et enlever tout excès d'anticorps non lié.
  7. Centrifuger les échantillons à 1250 g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant.
    Remarque: Si une coloration intracellulaire est pas nécessaire, voir l'étape 5. Si une coloration intracellulaire est nécessaire, effectuer perméabilisation et intracellulairecoloration parti- ici, et puis procéder à la fixation (étape 4.8).
  8. Ajouter 500 ul de la solution tampon préchauffé de fixation pour le culot de cellules et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 37 ° C.
  9. Distribuer 500 pl de tampon FACS dans le tube en matière plastique de polystyrène de 5 ml. Mélanger délicatement.
  10. Centrifuger les échantillons à 1250 g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant.
  11. Ajouter 500 pl de tampon FACS à chaque échantillon. Ces échantillons peuvent maintenant être analysées par cytométrie de flux. Acquérir les échantillons immédiatement pour de meilleurs résultats.

5. Viabilité coloration pour les cellules unfixable

  1. Après immunophénotypage extracellulaire, remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon FACS.
  2. Ajouter 1 pi de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI, 200 ug / ml) juste avant l'acquisition de l'échantillon.
  3. Visualisez les échantillons dans 1 - 2 min après l'ajout DAPI l'aide d'un cytomètre de flux.

  1. Préparer un poste de travail sous une hotte stérile. Pré-réchauffer le milieu de culture RPMI à 37 ° C en utilisant un bain d'eau.
  2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 000 ul de tampon pour FACS pour le comptage des cellules.
  3. Comptez le nombre de cellules viables à l'aide d'un compteur automatique de cellules ou hémocytomètre et solution de bleu trypan 0,4%, suivant les instructions du fabricant. Enregistrez le nombre total de cellules vivantes.
  4. Centrifuger les cellules à 1250 x g à 4 ° C pendant 10 min pour éliminer le tampon FACS.
  5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu de pré-culture RPMI chauffé en pipettant doucement 2 à 3 fois.
  6. Plaque le nombre désiré de cellules dans une plaque de 24 puits stérile et incuber à 37 ° C. Le temps d'incubation est déterminée par la question de recherche.

7. magnétique Tri cellulaire

  1. Mettre en place un poste de travail propre avec les matières suivantes: colonnes MS, séparateur magnétique de cellules, 15ml tubes coniques, 30 um filtres de pré-séparation, et un multi-support.
  2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon MACS (0,5% de BSA, 2 mM d'EDTA, solution 1 x PBS, pH 7,2).
  3. L'utilisation d'un compteur de cellules automatique ou hémocytomètre et solution de bleu de trypan 0,4%, compter et enregistrer le nombre total de cellules vivantes.
  4. Centrifuger les cellules à 1250 x g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. Ajouter un autre 500 pi de tampon MACS.
  5. Passez à effectuer la séparation magnétique suivant les recommandations du fabricant.
  6. Déterminer la pureté par cytométrie en flux ou microscopie.

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Representative Results

La dissection des tissus murins provenant de l'interface materno-fœtale est représenté sur la figure 1; Cette procédure comprend l'ouverture de la cavité peritoneale (figure 1A, B), les cornes utérines (Figure 1C), y compris les sites d'implantation (Figure 1D), et la collecte des tissus utérins (figure 1E), le placenta (Figure 1F), et des tissus déciduales (figure 1G) à 16,5 dpc. La figure 2 montre la morphologie des macrophages isolés (F4 / 80 +) recueillies à partir des tissus de déciduales utérines et à 16,5 dpc utilisant tri cellulaire magnétique. Macrophages isolés à maintenir la capacité de libérer des cytokines (données non présentées). Le rendement en cellules viables isolées à partir de la caduque, de l'utérus, placenta et est représenté sur la figure 3, et la viabilité des cellules est supérieure à 70% dans tous les tissus. La figure 4 représente la stratégie de déclenchement pour l'analyse polymorphonucle leucocytes ar et mononucléaires dans les singulets et des portes de viabilité, y compris les cellules T (CD45 + CD3 +), les neutrophiles (CD45 + Ly6G +), les macrophages (CD45 + F4 / 80 +), des cellules dendritiques (CD45 + CD11c +), et les cellules NK (CD45 + CD49b +) à 16,5 dpc. Une forte proportion de macrophages CD11c co-express. La figure 5 montre les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T dans la déciduale, de l'utérus et des tissus placentaires à 16,5 dpc. La figure 6 montre la stratégie de déclenchement pour l'analyse des lymphocytes dans les maillots et les portes de viabilité, y compris (cellules T CD45 + CD3 +) et les cellules B (CD45 + B220 +) à 16,5 dpc. Les cellules comprennent des cellules T CD4 + et CD8 +. Tissus murins à l'interface materno-fœtale également CD3 + CD4-CD8 (cellules T gamma-delta) dans des proportions élevées. La figure 7 montre des cellules T et des cellules B dans le déciduale, de l'utérus et les tissus placentaires à 16,5 dpc.

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Figure 1. dissection tissulaire. Cornes (A) de l'utérus à 16,5 dpc dans une souris B6. Les cornes utérines sont fixés au mésentère et les vaisseaux de drainage. Cornes (B) utérins disséqués à partir du mésentère et encore fixés au col de l'utérus. cornes (C) utérins, y compris les sites d'implantation et col. (D) Dissection d'un site d'implantation. (E) La dissection des tissus utérins à partir du site d'implantation. (F) la séparation du placenta et caduque à partir du site d'implantation. (G) Détachement de la caduque (couche gris-blanc) à partir du placenta. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Les macrophages isolés à partir de tissus et déciduales utérines. Les macrophages (F4 / 80 + cellules) isolées à partir de tissus utérins et déciduales à 16,5 dpc en utilisant le tri de cellules magnétique. Un grossissement de 20x. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. La viabilité des cellules isolées. De cellules viables (cellules DAPI- représentés par des flèches) isolées à partir décidual, de l'utérus et des tissus placentaires. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. Stratégie Gating pour polynucléaires et mononucléaires leucocytes. Total de la population de leucocytes a été fermée dans les maillots et les portes de viabilité. Cellules lymphocytes T (CD45 + CD3 +), les macrophages (CD45 + F4 / 80 +), les neutrophiles (CD45 + Ly6G +), les cellules dendritiques (CD45 + CD11c +), et NK (CD45 + CD49b +) ont été bloqués dans le porte totale des leucocytes ( CD45 +). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Cellules Figure 5. neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes T dans les tissus murins à l'interface materno-fœtale. Neutrophiles (CD45 + Ly6G +), les macrophages (CD45 + F4 / 80 +), et T (CD45 + CD3 +) ont été bloqués à l'intérieur de la viabilité et totale des leucocytes (CD45 +) portes dans décidual isolé, de l'utérus, et les cellules placentaires.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. stratégie gate pour les lymphocytes. Mononucléés cellules ont été bloqués dans les maillots et les portes de viabilité. Les lymphocytes T (CD3 +) et les cellules B (+) de B220 ont été bloqués à l'intérieur de la grille de viabilité. Cellules CD4 + et CD8 + ont été bloqués à l'intérieur de la porte des cellules T (CD3 +). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. lymphocytes sous-populations dans les tissus murins à l'interface materno-fœtale. Cellules T (CD3 +)et les cellules B (+) de B220 ont été bloqués à l'intérieur de la porte de la viabilité dans déciduale isolé, de l'utérus, et les cellules placentaires. Cellules CD4 + et CD8 + ont été bloqués à l'intérieur de la porte des cellules T (CD3 +). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

marqueur cellulaire Fluorochrome Cloner Entreprise Numéro de catalogue
Vivants / morts DAPI - Life Technologies L23105
CD45 V450 30-F11 BD Biosciences 560501
CD3 FITC 145-2C11 BD Biosciences 553062
CD4 APC RM4-5 BD Biosciences 553051
CD8 PE-CF594 53 à 6,7 BD Biosciences 562283
B220 APC-Cy7 RA3-6B2 BD Biosciences 552094
F4 / 80 PE BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G APC-Cy7 1A8 BD Biosciences 560600
CD49b APC DX5 BD Biosciences 560628
CD11c PE-Cy7 HL3 BD Biosciences 558079

Tableau 1. Liste des anticorps utilisé pour leucocytes sous-ensemble immunophénotypage

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Discussion

La collecte de données cohérentes qui enregistre les caractéristiques de l'abondance et phénotypiques de leucocytes infiltrants à l'interface materno-fœtale est essentielle pour comprendre la pathogenèse des complications liées à la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites qui facilitent l'isolement de l'infiltration des leucocytes à partir des tissus murins à l'interface materno-fœtale pendant la grossesse 31,38,39,43-46. Cependant, chacune de ces techniques est différente, met en oeuvre des enzymes ou des combinaisons d'enzymes différentes, nécessite des temps de dissociation, ne précise pas les quantités de tissu, et, surtout, ne précise pas toujours la viabilité des cellules isolées. Le protocole décrit ici permet l'isolement des leucocytes infiltrant des tissus murins à l'interface materno-fœtale avec une viabilité élevée, et fournit des informations détaillées sur les réactifs commerciaux, la préparation de la mémoire tampon, les quantités de tissu, et des temps d'incubation validé dans lelaboratoire.

L'une des étapes les plus critiques du procédé d'isolement des leucocytes est la dissociation du tissu; cette étape implique une homogénéisation mécanique et / ou de réactions enzymatiques qui peuvent altérer l'intégrité des protéines extracellulaires utilisés dans la caractérisation phénotypique 47. Le protocole décrit ici offre une nouvelle approche qui combine l'utilisation de techniques mécaniques et enzymatiques dissociation du tissu doux pour préserver l'intégrité des marqueurs extracellulaires dans les leucocytes isolés à partir de placenta et les tissus et déciduales utérines de souris.

Enzymes uniques et des combinaisons de différentes enzymes ont été utilisées pour isoler les leucocytes infiltrant des tissus murins à l'interface materno-fœtale 31,32,39,44. Dans de nombreux cas, ces enzymes qui sont préparés à des concentrations spécifiques à la main dans le laboratoire peuvent être soumis à l'erreur humaine. Ici, au contraire, une collagénase purifiée / prot neutre prête à l'emploifaciliter cocktail, Accutase, a été mis en œuvre dans le laboratoire; en tant que préparation d'enzyme disponible dans le commerce, il a été montré pour fournir des résultats fiables en culture cellulaire 48. Cette solution enzymatique est connu pour détacher efficacement les macrophages des plaques de culture sans gratter et, surtout, sans perdre antigènes de surface 48. Cette enzyme préparée a également été utilisé pour traiter la digestion des tissus du système nerveux humaine et animale, conduisant à des cellules viables qui restent isolées durable pendant une longue période, ce qui permet leur culture ultérieure 47. De plus, cette solution enzymatique conserve une antigénicité CD24 dans des cellules isolées provenant de tissus du système nerveux central 47. Lorsque comparé à Libérase-1, un autre cocktail de la collagénase et la protéase neutre, ni Accutase ni Libérase-1 générer des agrégats d'ADN libres; Toutefois, Accutase est plus doux que Libérase-1 pendant la dissociation des tissus 47. La collagénase / protéase neutre cocktail utilisé dans ce protocole a également démontré la supériorité de la trypsine dans la préservation de CD44, une tige de cancer surface cellulaire marqueur 49. Les études de ce laboratoire ont toujours souligné que cette solution enzymatique conserve leucocytes de souris antigènes de surface. En effet, les différences d'information ont été trouvées dans l'expression des marqueurs extracellulaires dans les macrophages (CD11b + F4 / 80 Les cellules +), les neutrophiles (CD11b cellules + Ly6G +), les cellules NKT (CD3 + CD49b + cellules), des cellules T (CD3 + cellules) et B (cellules B220 + CD19 + cellules), y compris les CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L, et CTLA4, et la libération de cytokines. Par conséquent, le procédé décrit ici est optimal pour l'immunophénotypage de leucocytes d'infiltration à l'interface materno-fœtale chez la souris, comme le montrent les résultats représentatifs.

Un avantage important de ce procédé est la détermination simultanée de plusieurs antigènes intracellulaires et extracellulaires au sein de la grille de viabilité. Le colorant la plus utilisée pour déla viabilité des cellules est Termine l'iodure de propidium (PI); Toutefois, son utilisation est limitée car il peut être utilisé uniquement en combinaison avec FITC. En effet, PI ne se distingue pas de façon adéquate à partir de la plupart des autres fluorochromes excités par des lasers bleus et rouges 50. Une solution consiste à utiliser DAPI 50 ou tout autre colorant qui est excité par les lasers UV mais pas par des lasers bleus et rouges couramment utilisés pour l'immunophénotypage. Ce protocole permet l'immunophénotypage de cellules viables comme il inclut l'utilisation de DAPI à 50 cellules unfixable ou l'utilisation de la viabilité des cellules colorant pouvant être fixés.

Un deuxième avantage important du protocole décrit ici est qu'il permet l'isolement des leucocytes avec un rendement élevé de cellules viables. Les données montrent que représentant de 70% à 89% des cellules sont viables isolées. Ceci est d'une grande importance que ce protocole a permis l'étude des propriétés fonctionnelles des cellules isolées à partir de tissus murins à l'interface materno-fœtale. Fou par exemple, les cultures des déciduales utérines et les macrophages et l'étude de la libération de cytokines sous stimulation ont été effectuées en utilisant cette méthode.

Pour obtenir de bons résultats, l'application du protocole décrit est important lorsque l'on considère les facteurs suivants: 1) la collecte de tissus doit être effectuée dans les 5 à 10 minutes après l'ouverture de la cavité péritonéale, et ces tissus doivent être placés sur la glace pour conserver la viabilité de les cellules isolées; 2) homogénéisation de tissu mécanique doit être réalisée à l'aide de ciseaux à pointe fine et ne peut excéder 2 min depuis de longues périodes ont été démontrées pour réduire le rendement des cellules viables; 3) la durée de l'incubation avec la solution enzymatique doit être inférieure à 1 heure depuis son activité diminue après cette période de temps; 4) la température de l'incubation avec la solution enzymatique doit être maintenue à 37 ° C pour obtenir l'activité optimale de ce cocktail d'enzymes; 5) culot cellulaire manipulation doit être fait doucement avec micropipettes parce que l'utilisation du vortex peut endommager l'intégrité des cellules (cellules isolées sont différenciées et la manipulation brusque peut facilement réduire leur viabilité); 6) tampon et à des températures de centrifugation doivent être maintenus à la même température que la suspension de cellules; 7) des cellules isolées doivent être traitées pour immunophénotypage ou utilisés immédiatement comme leur viabilité diminue rapidement; et 8) lors de l'exécution immunophénotypage, les échantillons doivent être acquises en utilisant un cytomètre de flux immédiatement pour de meilleurs résultats.

Une limitation de ce protocole est le coût de la solution enzymatique, ce qui est plus cher que d'autres enzymes ayant des fonctions similaires, par exemple, la trypsine, la dispase II, et la collagénase. Toutefois, les avantages que cette solution enzymatique affiche en plus des enzymes décrites sont supérieurs.

Outre immunophénotypage et de la culture de cellules et de tri, les applications futures de ce protocole sont numères et varié. Par exemple, il est désormais possible de déterminer la méthylation de l'ADN, l'expression de gènes cibles, de fonctionnalité in vitro de leucocytes (par exemple, la phagocytose, la cytotoxicité, la prolifération des lymphocytes T et de la plasticité des dosages, etc.), et la production d'espèces réactives de l'oxygène dans les leucocytes isolés à partir de tissus murins à l'interface foeto-maternelle. En effet, la description des nouvelles et rares leucocytes dans les tissus murins à l'interface materno-fœtale peut être également effectuée.

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Disclosures

Les auteurs décrivent aucun conflit d'intérêt.

Acknowledgments

NGL a été soutenu par l'Initiative de l'Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l'enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty et Amy E. Furcron (Wayne State University) pour leur lecture critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

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References

  1. Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
  2. King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
  3. Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
  4. Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
  5. Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
  6. Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
  7. Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
  8. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  9. Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
  10. Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
  11. Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
  12. Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
  13. Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
  14. Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
  15. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
  16. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
  17. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  18. Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
  19. Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
  20. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  21. Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
  22. Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
  23. Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
  24. Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
  25. Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
  26. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  27. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  28. Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
  29. Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
  30. Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
  31. Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
  32. Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
  33. Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
  34. Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
  35. Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
  36. Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
  37. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
  38. Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
  39. Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
  40. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  41. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  42. Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
  43. Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
  44. Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
  45. Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
  46. Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
  47. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  48. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  49. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
  50. Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).

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Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

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