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Immunology and Infection

L'isolamento dei leucociti di tessuti murini all'interfaccia materno-fetale

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52866
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,3,4
1Department of Obstetrics & Gynecology, Wayne State University School of Medicine, 2School of Paediatrics and Reproductive Health, Research Centre for Reproductive Health, the Robinson Research Institute, The University of Adelaide, 3Department of Immunology & Microbiology, Wayne State University School of Medicine, 4Perinatology Research Branch, NICHD/NIH/DHHS

Abstract

Tolleranza immunitaria in gravidanza richiede che il sistema immunitario della madre subisce cambiamenti distintivi, al fine di accogliere e nutrire il feto in via di sviluppo. Questa tolleranza è iniziata durante il coito, stabilito durante la fecondazione e l'impianto, e mantenuto per tutta la gravidanza. Mediatori attivi cellulari e molecolari della tolleranza materno-fetale sono arricchiti nel sito di contatto tra tessuti fetali e materni, noto come l'interfaccia materno-fetale, che comprende la placenta e l'utero e tessuti deciduali. Questa interfaccia è costituito da cellule stromali e leucociti infiltranti, e le loro caratteristiche fenotipiche abbondanza e cambiano nel corso della gravidanza. Leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale includono neutrofili, macrofagi, cellule dendritiche, mastociti, le cellule T, cellule B, le cellule NK e cellule NKT che creano insieme il micro-ambiente locale che sostiene la gravidanza. Uno squilibrio tra queste cellule o qualsiasi inappropalterazione riate nei loro fenotipo è considerato un meccanismo di malattia in gravidanza. Pertanto, lo studio di leucociti che si infiltrano l'interfaccia materno-fetale è essenziale al fine di chiarire i meccanismi immunitari che portano a complicazioni legate alla gravidanza. Qui descritto è un protocollo che utilizza una combinazione di dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta con proteolitica e cocktail enzimatica collagenolitica isolare i leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale. Questo protocollo consente l'isolamento di un alto numero di leucociti vitali (> 70%) con sufficientemente conservati proprietà antigeniche e funzionali. Isolati leucociti possono poi essere analizzati da diverse tecniche, tra cui immunofenotipizzazione, separazione delle cellule, l'imaging, immunoblotting, espressione di mRNA, coltura cellulare, e in vitro saggi funzionali quali reazioni contrastanti leucociti, la proliferazione, o saggi di citotossicità.

Introduction

Tolleranza immunitaria in gravidanza è un periodo in cui i cambiamenti caratteristici si verificano all'interno del sistema immunitario della madre. Queste modifiche permettono alla madre di tollerare il feto, un innesto semi-allogenico 1. Il feto esprime paterna complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) 2, e le cellule fetali sono stati trovati nel sangue materno 3; tuttavia, il feto non è respinta 4,5. Questo enigma non è pienamente compresa.

L'ipotesi più recente afferma che la tolleranza materno-fetale è creato durante il coito e la fecondazione 6,7 e mantenuto per sostenere una gravidanza a termine 8-10. La composizione della tolleranza materno-fetale è considerata un meccanismo di malattia durante i primi e ultime fasi della gravidanza, 10-16. Tolleranza materno-fetale prevede la partecipazione di varie sottopopolazioni di leucociti, comprese le cellule T (cellule T regolatorie, cellule Th1, Th2 e cellule Th17), macrophages, neutrofili, mastociti, cellule NK, e cellule NKT, cellule dendritiche e le cellule B, che il cambiamento nella densità e localizzazione per tutta la gravidanza 15,17-19. Tolleranza materno-fetale è arricchito all'interfaccia materno-fetale 20 - sede anatomica in cui il sistema immunitario della madre interagisce con gli antigeni fetali 20,21.

L'interfaccia materno-fetale viene creato durante placenta quando le cellule del trofoblasto extravilloso fetali invadono la mucosa uterina 22-24. Sul lato fetale di questa interfaccia, le membrane che circondano il feto creano una superficie epiteliale specializzata all'interno della placenta e le cellule syncytiotrophoblast controllano lo scambio di nutrienti attraverso il contatto diretto con il sangue materno 22. Sul lato materno dell'interfaccia, la decidua recluta un pool eterogeneo di leucociti che nei topi rappresentano il 30% al 50% di tutte le cellule deciduali. Oltre alla loro partecipazione a MaternAl tolleranza immunitaria, queste cellule sono fattori chiave per diversi processi durante la gravidanza, per esempio., la protezione del tratto riproduttivo dalle infezioni, la fecondazione, l'impianto dell'embrione 7,25, decidual angiogenesi 26, rimodellamento vascolare 24,27, trofoblasto invasione 28, placentare Sviluppo 24,25, e, in ultima analisi, il lavoro e la consegna 15,17. Pertanto, lo studio dei leucociti coinvolti nella tolleranza materno-fetale è essenziale per chiarire la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza.

Mentre l'uso di immunoistochimica e immunofluorescenza ha generato i dati per la visualizzazione diretta e la localizzazione di uterina, decidua, o leucociti placentari 29,30, citofluorimetria analisi ha ulteriormente evidenziato specifici sottoinsiemi di leucociti in ciascuno di questi tessuti 31,32. Inoltre, la citometria a flusso è stata utilizzata per determinare la densità e la proporzione di maternal-fetale interfaccia leucociti 33 e di espressione livelli di proteine ​​extracellulari e intracellulari 8-10,34. Analisi citofluorimetrica dei leucociti all'interfaccia materno-fetale richiede una cella singola sospensione. Per isolare leucociti infiltranti dal decidua, uterino, e tessuti placentari, sono stati utilizzati due metodi di dissociazione tissutale: meccanica ed enzimatica. Entrambi i metodi consentono la separazione dei leucociti infiltrati dalla matrice extracellulare (ECM) di questi tessuti. Dissociazione enzimatica dei tessuti è superiore alla dissociazione dei tessuti meccanica in quanto consente una resa superiore di leucociti con danni meno shear-force-associati 35. Di conseguenza, la dissociazione tessuto meccanico richiede pooling tessuti 36, che possono aumentare la variabilità e l'eterogeneità dei campioni. Tuttavia, la dissociazione meccanica può essere la scelta quando l'antigene di interesse può essere modificato per dissociazione enzimatica o quando la funzionalità della cellas di necessità interessi da preservare (ad es., la citotossicità delle cellule NK) 35.

L'uso di proteolisi con enzimi specifici per degradare la ECM elimina le basse rese osservati con la dissociazione meccanica. Diversi studi hanno riportato l'uso di tripsina 32, collagenasi 37, DNase 31, dispasi 38, e cocktail commerciali di vari enzimi 32,39. Tuttavia, la natura e la concentrazione di diversi enzimi e la durata della digestione devono essere accuratamente definiti e convalidati, al fine di assicurare il mantenimento dell'integrità degli epitopi antigenici superficie cellulare necessari per immunofenotipizzazione. Le varie strutture superficiali sono differenzialmente sensibili alla distruzione da diversi enzimi, con alcuni enzimi, come la tripsina, essendo noto per strippaggio epitopi superficie leucociti riconosciuti da molti anticorpi monoclonali.

Introdotto nel presente documento è un metodo che utilizza un proteolytic e collagenolitica cocktail enzimatico, chiamato Accutase. Questa soluzione enzimatica è abbastanza delicato mentre ancora efficiente in dissociare tessuti murini all'interfaccia materno-fetale, e non richiede l'aggiunta di altri reagenti dissociazione o siero per terminare la reazione di dissociazione. Inoltre, è pronto per l'uso come fornito e, anche se il tempo di dissociazione deve essere convalidata, è più robusto rispetto ai sopra citati enzimi 40,41.

L'utilizzo di una combinazione di entrambi i tipi di disaggregazione tessuto migliora la qualità e la quantità di cellule ottenute; in tal modo, diversi studi hanno implementato l'uso combinato di dissociazione meccanica ed enzimatica con risultati soddisfacenti 31,32,37. Il protocollo qui descritto è stato fondato e validato nel nostro laboratorio; si utilizza una combinazione di una dissociazione meccanica delicata seguita da una disaggregazione enzimatica robusta. Questo protocollo permette lo studio ulteriore isolamento e dileucociti infiltranti in tessuti murini all'interfaccia materno-fetale (utero, decidua, e placenta). Il seguente protocollo mantiene anche l'integrità dei marcatori di superficie delle cellule e dei rendimenti cellule vitali sufficienti per applicazioni a valle come dimostrato dalle analisi di citometria di flusso. Infine, questo protocollo mantiene la consistenza della preparazione cellulare per l'analisi e il confronto dei diversi tessuti murini che compongono l'interfaccia materno-fetale.

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Protocol

Prima di lavorare con i campioni di cui al presente protocollo, l'approvazione etica animale deve essere dato dal Research Comitato Etico Locale e la revisione Istituzionali Boards. Quando si lavora con sangue animale, cellule, o di agenti pericolosi, come indicato in questo protocollo, le azioni di biosicurezza e di sicurezza di laboratorio adeguate devono essere seguite.

1. Manipolazione Mouse e tessuto Collection

  1. Preparare una workstation sterile e ottenere strumenti sterili per la raccolta dei tessuti. Questi strumenti comprendono grandi e piccole forbici chirurgiche, pinze, pinzette e fine-tip. Includere piccoli piatti Petri etichettate con i nomi dei tessuti appropriati, riempite con soluzione 1x PBS (PBS) (3 - 5 ml) equilibrati a RT (20 - 22 ° C). Anche un grande capsula di Petri, senza etichetta, riempita con una soluzione 1x PBS (10 - 15 ml).
  2. Eutanasia di un mouse incinta (10,5-19,0 ​​giorni dopo coitum (DPC) o prima della consegna) utilizzando l'anidride carbonica (CO 2). Per assicurare che il mouse è eutanasia, utilizzare la tecnica dislocazione cervicale.
    Nota: Prima di 10.5 dpc, è difficile separare manualmente i tessuti deciduali dai tessuti uterini. Se non è necessario l'isolamento di leucociti decidui, leucociti dai tessuti uterini di topi non gravide o quelli di topi a <10,5 dpc possono essere eseguite anche seguendo questo protocollo.
  3. Utilizzando un paio di forbici chirurgiche sterili, rimuovere completamente la parte addominale inferiore della pelle e del tessuto muscolare. Con una pinza, farsi da parte tutti gli altri organi, fino dell'utero e delle ovaie sono visibili. Con l'utero ancora attaccato, utilizzare la pinza per spostarlo al di fuori della cavità peritoneale (Figura 1A).
  4. Individuare le ovaie distali al ovidotto e uterotubal svincolo di ogni corno uterino. Utilizzando le piccole forbici chirurgiche, fare una incisione a livello della giunzione uterotubal e separare le corna uterine dal mesentere contenente i vasi uterini; quindi,accise alla cervice per staccare le corna uterine dalla cavità peritoneale (Figura 1B).
  5. Con piccole forbici chirurgiche, fare un'incisione tra il collo dell'utero e il segmento inferiore delle corna uterine. Lascia attaccato una porzione della cervice durante questo processo (Figura 1C) per evitare l'apertura del corno uterino.
  6. Immergere le corna uterine (compreso il collo dell'utero) in un grande piatto di Petri riempite con soluzione PBS 1x (10 - 15 ml) per idratare i siti di impianto.
  7. Mentre era ancora immerso in soluzione PBS 1x, tagliare qualsiasi grasso dalle corna uterine con piccole forbici chirurgiche. Mantenere i tessuti immersi in soluzione PBS 1x per tutta la dissezione.
  8. Tenendo le corna uterine in posizione con le pinze, rimuovere uno dei siti di impianto dal dell'utero con un taglio trasversale attraverso la regione inter-impianto, utilizzando i piccoli forbici chirurgiche (Figura 1D). Il sito di impianto contiene il feto, circondato dallamembrana corioallantoidea, e il uterino, decidua e tessuti placentari.
  9. Utilizzando le pinze, tenere il sito al suo posto e fare una piccola incisione nella parete uterina adiacente al placentare e tessuti deciduali (Figura 1E). Tagliare lungo il perimetro della placenta / decidua finché questi separarsi sia dalla parete uterina e la membrana corioallantoidea che comprende il feto (Figura 1F).
  10. Rimuovere la placenta e tessuti deciduali annessi e posto in soluzione PBS 1x (3-5 ml; vedere il punto 1.12).
  11. Posizionare il feto circondato dalla membrana corioallantoidea attaccato ai tessuti uterini in una capsula di Petri riempita con soluzione PBS 1x (3 - 5 ml). L'idratazione di questi tessuti faciliterà la separazione della membrana corioallantoidea dalla parete uterina (vedere fase 1.14).
  12. Utilizzando un paio di pinzette fine-tip, buccia delicatamente il tessuto deciduali (strato bianco-grigio) dalla superficie placentare. Eseguire questomuoversi con cautela per mantenere l'integrità della placenta e dei tessuti deciduali (Figura 1G).
  13. Posizionare la placenta e tessuti deciduali in due piatti etichettati separatamente Petri riempite con soluzione PBS 1x (3-5 ml).
  14. Rimuovere delicatamente la parete uterina dalla membrana corioallantoidea con le pinzette fine-tip. Questi sono i tessuti uterini.
  15. Posizionare i tessuti uterini in una capsula di Petri riempita con una soluzione 1x PBS (3-5 ml).
  16. Ripetere i passaggi da 1.8 tramite 1.15 finché non sono stati elaborati tutti i siti di impianto.
  17. Raccogliere diversi uterino, decidua, e tessuti placentari per migliorare la resa delle celle durante la digestione enzimatica. La quantità di tessuti dipende dalla dimensione cucciolata; tuttavia, l'isolamento dei leucociti richiede> 2 pezzi di tessuto.
    Nota: Per informazioni più dettagliate in merito alla dissezione dei siti di impianto in giorni diversi gestazionali, visualizzare le immagini presenti nel secondo capitolo della Guida per investigatisu di mouse gravidanza 42.

2. uterino, deciduale e placentare Tissue dissociazione

  1. Etichetta diversi sterile 2 ml provette coniche con il nome di tessuto adeguato e inserire una fiala con 1.000 ml di soluzione enzimatica su ghiaccio.
  2. Dalla piastra Petri riempita con una soluzione 1x PBS, trasferire due pezzi (100-150 mg) del uterina, decidua, o tessuti placentari per una etichetta 2 ml tubo conico.
  3. Aggiungere 500 pl di soluzione enzimatica fredda in ciascuna 2 ml tubo conico.
  4. Con sottili forbici sterili, cominciare dissociare il tessuto immerso nella soluzione enzimatica finché non viene finemente macinata. Nel corso del tempo, la sospensione svilupperà un aspetto lattiginoso. Questa operazione non deve superare più di 2 minuti per evitare un eccesso di manipolazione del campione.
  5. Una volta che il tessuto è stato dissociato, aggiungere un extra di 500 ml di soluzione enzimatica fredda al tubo conico 2 ml.
  6. Posizionare il tubo conico 2 ml su ghiaccio.
  7. Ripetere i passaggi da 2.2 a 2.6 con ciascun tessuto fino a quando sono stati elaborati tutti i tessuti.
  8. Trasferire 2 ml provette coniche con il tessuto omogeneizzato (tessuto tritato + soluzione enzimatica) campioni dal ghiaccio in un incubatore a 37 ° C ed effettuare un'agitazione orbitale dolce (80 rpm). Incubare per 30 - 35 min. Assicurarsi che la temperatura dell'incubatrice è stabilizzata prima di iniziare il tempo di incubazione.
  9. Dopo l'incubazione, rimuovere le 2 ml conici con i tessuti dissociate dal termostato e disporli sul ghiaccio per evitare ulteriori digestione.
  10. Etichetta sterili 50 ml provette coniche in base al tipo di tessuto. Togliere i coperchi e sostituirli con un colino cellula sterile (100 micron dimensione dei pori).
  11. Versare i tessuti dissociate dalle ml 2 tubi coniche attraverso il filtro delle cellule utilizzando ~ 20 ml di soluzione 1x PBS. I frammenti di tessuto rimarranno nel filtro cella e la sospensione cellulare passeranno attraverso di esso.
  12. Lavare il ditessuti ssociated nel colino cella 2 - 3 volte con 20 ml di soluzione 1x PBS utilizzando una pipetta di trasferimento.
  13. Sciacquare i vuoti 2 ml provette coniche con la soluzione PBS 1x (1 ml) e versare il contenuto attraverso i filtri di cella.
  14. Rimuovere i filtri cellulari dai tubi coniche ml 50 e sostituire i coperchi. Centrifugare le provette a 1.250 g per 10 minuti a 4 ° C.
  15. Con cautela, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Il pellet cellulare contiene i leucociti isolati e cellule stromali.
  16. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di terreno di coltura RPMI senza siero fetale bovino (FBS). Mescolare delicatamente. Non usare vortice.
  17. Aggiungere 500 ml di FBS ordinate in una provetta di polistirene plastica da 5 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare.
  18. Centrifugare per 10 minuti a 1100 xg senza il freno a RT a pellet cellule vitali mentre debris cellulare viene mantenuto all'interfaccia PBS / FBS.
  19. Aspirare il surnatante senza toccare il pellet. Il cell pellet contiene cellule per lo più vitali.
  20. Facoltativamente: per concentrare le cellule mononucleate, utilizzare una soluzione satura polisaccaride 20%, come descritto di seguito.
    1. Risospendere il pellet cellulare in 1.000 ml di RPMI terreno di coltura senza FBS.
    2. Aggiungere 1 ml di 20% di soluzione satura polisaccaride in una provetta di plastica di polistirene da 5 ml e lentamente sovrapporre la sospensione cellulare in cima a questa soluzione, secondo le istruzioni del produttore. Mentre stratificazione del campione, evitare di mescolare la soluzione satura polisaccaride 20% con la sospensione cellulare.
    3. Centrifugare con un rotore oscillante a 500 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno. E 'molto importante disattivare il freno per evitare di mescolare le cellule e perdere il gradiente. Le cellule mononucleari si trovano nell'interfaccia tra la soluzione satura polisaccaride 20% e la soluzione PBS 1x.
    4. Aspirare e scartare il surnatante. Il pellet cellulare contiene cellule mononucleari per lo più.
      Note: Per eseguire la vitalità di colorazione e colorazione intracellulare, vedere il passaggio 3. Per eseguire immunofenotipizzazione, vedere il passaggio 4. Per eseguire la vitalità di colorazione e solo la colorazione extracellulare, vedere il passaggio 5. Per eseguire una coltura cellulare di leucociti isolati, vedere il passaggio 6. Per eseguire separazione delle cellule magnetico, vedi punto 7.

3. Viability colorazione delle celle risolvibile

  1. Risospendere il pellet cellulare in 1.100 ml di soluzione PBS 1x. Mescolare delicatamente con un micro-pipetta.
  2. Trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in un tubo di plastica 5 ml polistirene. Aggiungere 400 ml di soluzione PBS 1x al tubo di polistirene da 5 ml. Questo tubo è un controllo per il tessuto auto-fluorescenza. Conservare a 4 ° C fino al punto 3.5.
  3. Trasferire le restanti 1.000 ml di sospensione cellulare in una nuova provetta di polistirene plastica 5 ml. Aggiungere 1 ml di tintura viabilità e omogeneizzare delicatamente. Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C.
  4. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,000 & #181; l di soluzione 1x PBS. Mescolare delicatamente a mano.
  5. Centrifuga entrambi provette da 5 ml in polistirolo di plastica (i punti 3.2 e 3.3) a 1250 g per 10 minuti a 4 ° C. Aspirare e scartare il surnatante.
    Nota: Il pellet cellulare (passo 3,3) saranno utilizzati al punto 4. L'pellet (punto 3.2), servirà come controllo per il tessuto auto-fluorescenza.

4. Immunofenotipizzazione

  1. Risospendere il pellet cellulare in 50 ml di anti-topo CD16 / CD32 (diluito 1: 100 in tampone FACS [0.1% di BSA, 0,05% di sodio azide, soluzione 1x PBS, pH 7.4]). Mescolare la sospensione cellulare con delicatezza. Non utilizzare il vortice.
  2. Incubare la sospensione di cellule in provette di polistirene da 5 ml al buio a 4 ° C per 10 min.
  3. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 ml di ogni anti-leucociti anticorpo monoclonale che reagisce con marcatori di superficie cellulare extracellulari o anticorpo controllo isotipico corrispondenza (diluizioni degli anticorpi devono essere convalidati). Ad esempio, analizzare leucociti sottopopolazioni, utilizzare anti-moutilizzare gli anticorpi che reagiscono con i seguenti marcatori di superficie di leucociti-cell: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabella 1).
  4. Una volta che gli anticorpi contro marcatori extracellulari sono stati aggiunti al tubo di polistirene di plastica da 5 ml, mescolare delicatamente. Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C.
  5. Durante questa incubazione, preparare e pre-riscaldare la soluzione tampone di fissaggio (diluito con acqua deionizzata, 1: 5) a 37 ° C, se necessario. Tenere il tampone a 37 ° C al buio fino a quando il suo utilizzo è necessario.
  6. Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 500 ml di tampone FACS nel tubo di plastica polistirolo 5 ml e mescolare delicatamente. Questo passo è necessario per lavare le cellule ed eliminare ogni eccesso di anticorpo non legato.
  7. Centrifugare i campioni a 1.250 xg a 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante.
    Nota: se non è richiesta la colorazione intracellulare, vedere punto 5. Se è necessaria colorazione intracellulare, eseguire permeabilizzazione e intracellularicolorazione lare qui, e poi procedere con la fissazione (passo 4.8).
  8. Aggiungere 500 microlitri della soluzione di tampone di fissaggio pre-riscaldato al pellet e incubare al buio per 10 min a 37 ° C.
  9. Dispensare 500 ml di tampone FACS nella provetta di polistirene di plastica da 5 ml. Mescolare delicatamente.
  10. Centrifugare i campioni a 1.250 xg a 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante.
  11. Aggiungere 500 microlitri di tampone FACS per ogni campione. Questi campioni possono essere analizzati mediante citometria a flusso. Acquisire subito i campioni per i migliori risultati.

5. Viability colorazione delle celle irreparabili

  1. Dopo immunofenotipizzazione extracellulare, risospendere il pellet cellulare in 500 ml di buffer di FACS.
  2. Aggiungere 1 ml di 4 ', 6-dicloridrato diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 200 mg / ml) appena prima di acquisire il campione.
  3. Visualizzare i campioni entro 1-2 minuti dopo l'aggiunta di DAPI utilizzando un citofluorimetro.

  1. Preparare una stazione di lavoro sotto una cappa aspirante sterile. Pre-riscaldare il terreno di coltura RPMI a 37 ° C utilizzando un bagno di acqua.
  2. Risospendere il pellet cellulare in 1000 ml di tampone FACS per la conta cellulare.
  3. Contare il numero di cellule vitali mediante un contatore di cellule automatico o emocitometro e la soluzione blu 0,4% trypan, seguendo le istruzioni del produttore. Registrare il conteggio totale delle cellule vive.
  4. Centrifugare le cellule a 1250 xga 4 ° C per 10 minuti per rimuovere il tampone FACS.
  5. Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di terreno di coltura RPMI preriscaldata pipettando delicatamente 2 a 3 volte.
  6. Piatto il numero desiderato di cellule in una piastra da 24 pozzetti sterili e incubare a 37 ° C. Il tempo di incubazione sarà determinato dalla domanda di ricerca.

7. ordinamento delle cellule magnetiche

  1. Impostare una stazione di lavoro pulito, con i seguenti materiali: colonne MS, separatore cellulare magnetico, 15tubi ml coniche, 30 micron filtri pre-separazione, e un multi-stand.
  2. Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di tampone MACS (0,5% di BSA, 2 mM EDTA, soluzione 1x PBS, pH 7,2).
  3. L'utilizzo di un contatore di cellule automatico o emocitometro e lo 0,4% trypan soluzione blu, contare e registrare il conteggio totale delle cellule vive.
  4. Centrifugare le cellule a 1250 xga 4 ° C per 10 min. Aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere altri 500 ml di tampone MACS.
  5. Procedere per eseguire la separazione magnetica seguendo le raccomandazioni del produttore.
  6. Determinare purezza, in citometria di flusso o microscopia.

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Representative Results

La dissezione dei tessuti murini dall'interfaccia materno-fetale è mostrato in Figura 1; questa procedura prevede l'apertura della cavità peritoneale (Figura 1A, B), corna uterine (Figura 1C), compresi i siti di impianto (Figura 1D), e la raccolta di tessuti uterini (Figura 1E), la placenta (Figura 1F), e tessuti decidua (Figura 1G) a 16.5 dpc. La Figura 2 mostra la morfologia dei macrofagi isolati (F4 / 80 +) raccolti dai deciduali e uterini tessuti a 16.5 dpc utilizzando cell sorting magnetico. Isolato macrofagi mantengono la capacità di rilasciare citochine (dati non mostrati). La resa di cellule vitali isolate dalla decidua, utero e placenta viene mostrato nella Figura 3, e la vitalità cellulare è maggiore del 70% in tutti i tessuti. La Figura 4 mostra la strategia di gating per l'analisi polymorphonucle leucociti ar e mononucleari all'interno delle canottiere e cancelli viabilità, comprese le cellule T (CD45 + CD3 +), neutrofili (CD45 + Ly6G +), macrofagi (CD45 + F4 / 80 +), le cellule dendritiche (CD45 + CD11c +), e le cellule NK (CD45 + CD49b +) a 16,5 dpc. Un'alta percentuale di macrofagi CD11c co-express. Figura 5 mostra neutrofili, macrofagi e cellule T nel decidua, uterina, e tessuti placentari a 16,5 dpc. Figura 6 illustra la strategia di gating per l'analisi i linfociti nei canottiere e cancelli vitale, in particolare cellule T CD45 + (CD3 +) e delle cellule B (CD45 + B220 +) a 16.5 dpc. Le cellule T sono cellule CD4 + e CD8 + T. Tessuti murini all'interfaccia materno-fetale includono anche CD3 + CD4-CD8- (linfociti T gamma-delta) in proporzioni elevate. La Figura 7 mostra cellule T e cellule B nella decidua, uterina, e tessuti placentari a 16.5 dpc.

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Figura 1. Tissue dissezione. Corna (A) uterini al 16,5 DPC in un mouse B6. Le corna uterine sono attaccati alla mesentere e dei vasi drenanti. Corna (B) uterini sezionati dal mesentere e ancora attaccati alla cervice. corna (C) uterini, compresi i siti di impianto e della cervice. (D) dissezione di un sito d'impianto. (E) La dissezione dei tessuti uterini dal sito di impianto. (F) Separazione della placenta e decidua dal sito di impianto. (G) distacco della decidua (strato bianco-grigio) dalla placenta. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. I macrofagi isolati da deciduali e uterine tessuti. I macrofagi (F4 / 80 + cellule) isolati dai deciduali e uterine tessuti a 16.5 dpc utilizzando l'ordinamento delle cellule magnetiche. 20X di ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. vitalità delle cellule isolate. Le cellule vitali (cellule DAPI- rappresentati con frecce) isolati da decidual, uterino, e tessuti placentari. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. strategia di gating per polimorfonucleati e leucociti mononucleari. Popolazione leucocitaria totale è stato sorvegliato nelle canottiere e cancelli di vitalità. Cellule cellule T (CD45 + CD3 +), macrofagi (CD45 + F4 / 80 +), neutrofili (CD45 + Ly6G +), le cellule dendritiche (CD45 + CD11c +) e NK (CD45 + CD49b +) sono stati gated all'interno del cancello total-leucociti ( CD45 +). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Cellule Figura 5. neutrofili, macrofagi e cellule T nei tessuti murini all'interfaccia materno-fetale. I neutrofili (CD45 + Ly6G +), macrofagi (CD45 + F4 / 80 +) e T (CD45 + CD3 +) sono stati gated all'interno della redditività e total-leucociti (CD45 +) cancelli in decidua isolato, uterino, e le cellule placentari.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. strategia di gating per i linfociti. Mononuclear cellule sono state gated all'interno delle canottiere e cancelli di vitalità. Le cellule T (CD3 +) e le cellule B (B220 +) sono stati gated all'interno del cancello della redditività. Cellule CD4 + e CD8 + T sono state gated all'interno del cancello a cellule T (CD3 +). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. sottopopolazioni linfocitarie nei tessuti murini all'interfaccia materno-fetale. Cellule T (CD3 +)e cellule B (B220 +) sono stati gated all'interno del cancello redditività nel decidua isolato, uterino, e le cellule placentari. Cellule CD4 + e CD8 + T sono state gated all'interno del cancello a cellule T (CD3 +). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Marcatore cellulare Fluorocromo Clone Azienda Numero di catalogo
LIVE / MORTO DAPI - Life Technologies L23105
CD45 V450 30-F11 BD Biosciences 560501
CD3 FITC 145-2C11 BD Biosciences 553.062
CD4 APC RM4-5 BD Biosciences 553.051
CD8 PE-CF594 53-6,7 BD Biosciences 562.283
B220 APC-Cy7 RA3-6B2 BD Biosciences 552.094
F4 / 80 PE BM8 eBiosciences 12-4801-82
Ly6G APC-Cy7 1A8 BD Biosciences 560600
CD49b APC DX5 BD Biosciences 560628
CD11c PE-Cy7 HL3 BD Biosciences 558.079

Tabella 1. Elenco degli anticorpi utilizzato per leucociti sottoinsieme immunofenotipizzazione

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Discussion

La raccolta di dati coerenti che registra le caratteristiche fenotipiche e abbondanza di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale è essenziale per comprendere la patogenesi delle complicanze legate alla gravidanza. Sono state descritte diverse tecniche che facilitano l'isolamento di leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale durante la gravidanza 31,38,39,43-46. Tuttavia, ogni tecnica è differente, utilizza enzimi o combinazioni di enzimi diversi, richiede diversi tempi di dissociazione, non specifica quantità di tessuto, e, soprattutto, non specifica sempre la vitalità delle cellule isolate. Il protocollo qui descritto permette l'isolamento di infiltrazione leucociti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale con elevata redditività, e fornisce informazioni dettagliate sui reagenti commerciali, la preparazione di buffer, le quantità di tessuto, e tempi di incubazione convalidato nellaboratorio.

Una delle fasi più critiche del processo di isolamento dei leucociti è la dissociazione dei tessuti; questa fase prevede omogeneizzazione meccanica e / o reazioni enzimatiche che può alterare l'integrità delle proteine ​​extracellulari utilizzati nella caratterizzazione fenotipica 47. Il protocollo qui descritto offre un nuovo approccio che combina l'uso di tecniche dolci dissociazione tissutale meccaniche ed enzimatiche per preservare l'integrità dei marcatori extracellulari nei leucociti isolate dalla placenta e deciduali e uterini tessuti di topi.

Enzimi singoli e combinazioni di enzimi differenti sono stati utilizzati per isolare leucociti infiltranti dai tessuti murini all'interfaccia materno-fetale 31,32,39,44. In molti casi, questi enzimi che vengono preparati a concentrazioni specifiche a mano in laboratorio possono essere soggetti a errore umano. Qui, invece, un collagenasi purificata / prot neutro ready-to-usefacilità cocktail, Accutase, è stato implementato in laboratorio; come preparato enzimatico disponibile in commercio, è stato dimostrato di fornire risultati affidabili in coltura cellulare 48. Questa soluzione enzimatica è noto per staccare efficacemente macrofagi dalle piastre di coltura senza raschiare e, soprattutto, senza perdere superficie antigeni 48. Questo enzima preparato è stato anche utilizzato per elaborare la digestione dei tessuti del sistema nervoso umani e animali, con conseguente cellule isolate che rimangono vitali sostenibile per lunghi periodi, che ne consenta la successiva coltura 47. Inoltre, questa soluzione enzimatica preserva CD24 antigenicità in cellule isolate da tessuti del sistema nervoso centrale 47. Rispetto al Liberase-1, un altro cocktail di collagenasi e proteasi neutra, né Accutase nè Liberase-1 generare aggregati DNA libero; tuttavia, Accutase è più delicato di Liberase-1 durante la dissociazione dei tessuti 47. La collagenasi / co proteasi neutracktail utilizzato in questo protocollo ha anche dimostrato la superiorità di tripsina nella conservazione di CD44, un gambo cancro marcatore superficie cellulare 49. Gli studi di questo laboratorio hanno sempre osservato che questa soluzione enzimatica preserva antigeni di superficie del mouse leucociti. Infatti, le differenze informative sono state trovate in l'espressione di marcatori extracellulari nei macrofagi (CD11b + F4 80 + cellule /), neutrofili (+ Ly6G + cellule CD11b), cellule NKT (CD3 + CD49b + cellule), le cellule T (CD3 + cellule) e B cellule (B220 + CD19 + cellule), tra cui CD4, CD8, CD69, CD25, CD40L, PD1, CD44, CD62L e CTLA4, e in rilascio di citochine. Pertanto, il metodo qui descritto è ottimale per immunofenotipizzazione di leucociti infiltranti all'interfaccia materno-fetale nei topi, come mostrato nei risultati rappresentativi.

Un importante vantaggio di questo metodo è la determinazione simultanea di diversi antigeni extracellulari ed intracellulari all'interno del cancello redditività. Il colorante più utilizzato per devitalità cellulare Termine è ioduro di propidio (PI); tuttavia il suo uso è limitato in quanto può essere utilizzato solo in combinazione con FITC. Questo perché PI non può essere distinto adeguatamente dalla maggior parte fluorocromi eccitati da laser blu e rosso 50. Una soluzione è quella di utilizzare DAPI 50 o qualsiasi altro colorante che viene eccitato dal laser UV ma non da laser blu e rosso comunemente usati per immunofenotipizzazione. Questo protocollo permette immunofenotipizzazione di cellule vitali in quanto prevede l'utilizzo di DAPI 50 per celle irreparabili o l'uso della redditività tintura per cellule fissabili.

Un secondo importante vantaggio del protocollo qui descritto è che permette l'isolamento di leucociti con un alto rendimento di cellule vitali. I dati rappresentante mostra che il 70% e il 89% delle cellule isolate sono vitali. Questo è di grande importanza in quanto questo protocollo ha consentito lo studio delle proprietà funzionali delle cellule isolate da tessuti murini all'interfaccia materno-fetale. Fo l'esempio, le culture dei deciduali e uterine macrofagi e lo studio di rilascio di citochine sotto stimolazione sono stati condotti con questo metodo.

Per ottenere risultati soddisfacenti, l'applicazione del protocollo descritto è importante quando si considerano i seguenti fattori: 1) la raccolta dei tessuti deve essere eseguita entro 5 a 10 minuti dopo l'apertura della cavità peritoneale, e questi tessuti devono essere posti su ghiaccio per mantenere la vitalità di le cellule isolate; 2) omogeneizzazione tessuto meccanico deve essere effettuata con le forbici fine-tip e non può superare i 2 min da periodi più lunghi hanno dimostrato di ridurre la resa di cellule vitali; 3) la durata di incubazione con soluzione enzimatica deve essere inferiore a 1 ora dalla sua attività diminuisce dopo questo periodo di tempo; 4) la temperatura di incubazione con la soluzione enzimatica deve essere mantenuta a 37 ° C per ottenere l'attività ottimale di questo cocktail di enzimi; 5) pellet di cellule maniplamento deve essere fatto delicatamente con micropipette perché l'uso del vortice può danneggiare l'integrità delle cellule (cellule isolate sono manipolazione differenziate e brusco può ridurre facilmente la loro vitalità); 6) e buffer temperature centrifuga devono essere mantenute alla stessa temperatura come la sospensione cellulare; 7) cellule isolate devono essere trattati per immunofenotipizzazione o utilizzati immediatamente come loro redditività riduce rapidamente; e 8) durante l'esecuzione immunofenotipizzazione, i campioni devono essere acquisite mediante citometro immediatamente un flusso per i migliori risultati.

Una limitazione di questo protocollo è il costo della soluzione enzimatica, che è più costoso di altri enzimi con funzioni simili, ad esempio, tripsina, dispasi II e collagenasi. Tuttavia, i vantaggi che questa soluzione enzimatica visualizza oltre gli enzimi descritti sono superiori.

Oltre immunofenotipizzazione e coltura cellulare e la cernita, le future applicazioni di questo protocollo sono numerous e varia. Ad esempio, è ora possibile determinare metilazione del DNA, l'espressione di geni bersaglio, in funzionalità vitro leucociti (ad esempio, la fagocitosi, citotossicità, proliferazione delle cellule T e plasticità saggi, etc.), e la produzione di specie reattive dell'ossigeno nei leucociti isolati da tessuti murini all'interfaccia materno fetale. Infatti, descrizione di nuove e rare leucociti nei tessuti murini all'interfaccia materno-fetale può essere eseguita anche.

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Disclosures

Gli autori rilevano conflitti di interesse.

Acknowledgments

NGL è stato sostenuto dalla Wayne State University perinatale Iniziativa in materna, perinatale e la salute del bambino. Noi riconosciamo con gratitudine Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) per la loro lettura critica del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Magentic Cell Separation
MS Columns Militenyi Biotec 130-042-201
Cell Separator Militenyi Biotec 130-042-102
30 μm pre-separation filters Militenyi Biotec 130-041-407
Multistand Militenyi Biotec 130-042-303
15 ml conical tubes Thermo Fisher 339650
MACS Buffer Militenyi Biotec Laboratory preparation (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2)
Reagents
Accutase enzymatic solution Life Technologies A11105-01
Anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 533142
Anti-mouse extracellular antibodies BD Bioscences/eBiosciences Table 1
Sodium azide Fisher S227-500
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
LIVE/DEAD viability dye Life Technologies L23105
Fixation buffer solution BD Biosciences 558049
FACS Buffer BD Biosciences Laboratory preparation 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4
Trypan blue solution 0.4% BIO-RAD 145-0013
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies 16000-044
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MaxQ 4450
Flow cytometer BD LSRFortessa
Centrifuge Thermo Scientific Legend LXTR
Vacuum system laboratory constructed
Incubator Thermo Scientific Incubator 3307
Water bath Precision 51221035
Cell counter BIO-RAD TC20 Automated Cell Counter
Optical and fluorescence microscopes Zeiss and Olympus Zeiss LSM780 and Olympus CKX41

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Arenas-Hernandez, M., Sanchez-Rodriguez, E. N., Mial, T. N., Robertson, S. A., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52866, doi:10.3791/52866 (2015).

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