Abstract
妊娠中の免疫寛容は、母親の免疫系が発達中の胎児を受け入れ、育成するために、特徴的な変化を受けることが必要です。この公差は、性交中に開始受精および注入中に設立され、妊娠中を通して維持されています。母体·胎児の寛容の活性細胞および分子メディエーターは、胎盤と子宮と脱落膜組織を含む母体胎児のインターフェイスとして知られている胎児と母体組織との接触部位に濃縮されています。このインタフェースは、間質細胞および浸潤白血球で構成され、その豊かさと表現型の特徴は、妊娠の経過とともに変化します。母体胎児のインターフェイスにおける浸潤白血球は、一緒に妊娠を維持局所微小環境を作成し、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、T細胞、B細胞、NK細胞およびNKT細胞を含みます。これらの細胞間の不均衡、または任意inappropそれらの表現型でriate変化は、妊娠中の病気のメカニズムと考えられています。したがって、母体胎児のインターフェイスに侵入白血球の研究は、妊娠関連の合併症を引き起こす免疫機構を解明するために不可欠です。本明細書に記載の母体胎児の界面でのマウス組織から浸潤白血球を分離するために、タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素カクテルと強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用するプロトコルです。このプロトコルは、十分に保存された抗原性および機能的特性を有する生存可能な白血球（> 70％）の高い数の分離を可能にします。単離された白血球は、その後、免疫表現型、細胞選別、イメージング、免疫ブロット法、mRNA発現、細胞培養物、およびこのような混合白血球反応、細胞増殖、または細胞傷害性アッセイなどのインビトロの機能的アッセイを含むいくつかの技術によって分析することができます。
Introduction
妊娠中の免疫寛容は、独特の変化が母親の免疫システム内で発生する期間です。これらの変更は、母親が胎児、半同種移植片1を許容することができます。胎児が父親の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）は2抗原発現、および胎児細胞が母体循環3において見出されています。しかし、胎児は4,5を拒否されていません。この謎は完全には理解されていません。
最新の仮説は、母体·胎児寛容は性交と受精6,7中に作成され、満期妊娠8-10を維持するために維持されていることを述べています。この母体·胎児寛容の内訳は、妊娠10〜16の初期および後期の段階で病気のメカニズムを考えられています。母体胎児の耐性は、Mac、T細胞（調節性T細胞、Th1細胞、Th2細胞、およびTh17細胞）を含む様々な白血球サブ集団の参加を含みますrophages、好中球、マスト細胞、NK細胞、及びNKT細胞、樹状細胞、及びB細胞、妊娠15,17-19を通して密度および局在のその変化。母親の免疫系が胎児性抗原20,21と相互作用する解剖学的部位-母体·胎児許容範囲は、母体·胎児の界面20で濃縮されています。
胎児の絨毛外栄養膜細胞が子宮粘膜22-24に侵入したときに母体胎児のインターフェイスは、胎盤形成中に作成されています。このインタフェースの胎児側には、胎児の周囲の膜は、胎盤内で特殊な上皮表面を作成し、合胞体栄養細胞が母体血22との直接接触を介して栄養交換を制御します。インターフェイスの母体側では、脱落膜は、マウスですべての脱落膜細胞の50％〜30％を占めて白血球の異種のプールを募集しています。 maternへの参加に加えて、アル免疫寛容、これらの細胞は、妊娠中の異なるプロセス、 例えば 、感染症、受精から生殖器官の保護、胚移植の7,25、脱落膜血管新生26、血管リモデリング24,27、栄養膜浸潤28、胎盤に重要な貢献者であります開発24,25、および、最終的には、分娩15,17。したがって、母体·胎児寛容に関与する白血球の研究は、妊娠関連の合併症の病因を解明するために不可欠です。
免疫組織化学および免疫蛍光法の使用は、直接可視化および子宮、脱落膜、または胎盤白血球29,30のローカリゼーションのためのデータを生成しているが、さらに、これらの組織31,32のそれぞれに白血球の特定のサブセットを明らかにしたフローサイトメトリー分析。さらに、フローサイトメトリー母校の密度および割合を決定するために使用されていますNAL-胎児のインターフェイス白血球33と外および細胞内タンパク質8-10,34の発現レベル。母体胎児の界面での白血球のフローサイトメトリー分析は、単一細胞懸濁液を必要とします。脱落膜、子宮、胎盤組織から浸潤白血球を単離するために、組織解離の二つの方法が使用されてきた：機械的および酵素。両方の方法は、これらの組織の細胞外マトリックス（ECM）の浸潤白血球の分離を可能にします。それはより少ないせん断力関連の損傷35と白血球のより高い収率を可能にするような酵素組織解離は、機械的組織解離よりも優れています。その結果、機械的な組織解離は、サンプルの変動性と不均一性を高めることができるプールの組織36を必要とします。しかし、機械的解離は、目的の抗原を酵素的解離または時によって変更することができるときに選択することができる細胞の機能興味のあるのは、（ 例えば 、NK細胞の細胞傷害性）を保持する必要がある35。
ECMを分解する特定の酵素を用いたタンパク質分解の使用は、機械的解離で観察された低い収率を排除します。いくつかの研究は、37 32コラゲナーゼ、トリプシンの使用を報告している、DNアーゼ31は、38ディスパーゼ、および種々の酵素32,39の商業カクテル。しかし、自然と異なる酵素の濃度と消化の期間は、細心の注意を払って定義され、免疫表現するために必要な細胞表面抗原エピトープの完全性の維持を確実にするために検証する必要があります。さまざまな表面構造は、多数のモノクローナル抗体によって認識される白血球の表面エピトープを除去するための悪名高いされ、トリプシンなどのいくつかの酵素を用いて、異なる酵素による破壊に差次受けやすいです。
本明細書の導入proteolytを用いる方法でありますICおよびコラーゲン分解酵素カクテルは、のAccutaseと呼ばれます。この酵素溶液は、母体胎児の界面でのマウス組織を解離まだ効率的ながら十分に穏やかであり、解離反応を停止し、他の解離試薬または血清の添加を必要としません。また、解離の時間を検証する必要があるが、それは上記の酵素40,41よりも堅牢で、供給として使用する準備ができていると。
組織の脱凝集の両方のタイプの組合せの利用は、得られた細胞の質および量を改善します。このように、いくつかの研究は、満足のいく結果31,32,37に機械的および酵素的解離の併用を実装しています。本明細書に記載されるプロトコルが確立され、我々の研究室で確認されました。それは強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用しています。このプロトコルは、の単離およびさらなる研究を可能にします母体·胎児の界面でのマウス組織における浸潤白血球（子宮、脱落膜、および胎盤）。フローサイトメトリー分析によって示されるように、以下のプロトコルは、細胞表面マーカー及び収率下流アプリケーションのための十分な生存可能な細胞の完全性を維持します。最後に、このプロトコルは、母体·胎児のインターフェイスを構成する種々のマウス組織の分析と比較のための細胞調製物の整合性を維持します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、動物の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査委員会によって与えられなければなりません。このプロトコルで述べたように、動物の血液、細胞、または危険な薬剤で作業している場合は、適切なバイオセーフティと実験室の安全行動に従わなければなりません。
1.マウスの取扱い及び組織収集
- 無菌ワークステーションを準備し、組織収集のための無菌のツールを入手してください。これらのツールは、大小の手術用ハサミ、ピンセット、および先の細いピンセットが含まれます。 （ - 22°C 20）を室温に平衡化 - （5ミリリットル3）1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を充填し、適切な組織名で標識された小さなペトリ皿が挙げられます。 （10〜15ミリリットル）も1×PBS溶液で満たされた標識されていない大きなペトリ皿を、含みます。
- 妊娠中のマウスを安楽死させる（10.5から19.0日後交尾（DPC）または送達の前に）二酸化炭素を使用して（CO 2）。マウスを安楽死させていることを確実にするために、頸椎脱臼技術を使用しています。
注：10.5 DPCの前に、それは手動で子宮組織から脱落膜組織を分離することは困難です。脱落膜白血球の分離が必要でない場合、子宮非妊娠マウスの組織または10.5 DPC <におけるマウス由来のものからの白血球は、このプロトコルに従うことによって行うことができます。 - 無菌手術用ハサミを使用して、完全に皮膚や筋肉組織の下腹部の部分を削除します。子宮と卵巣が表示されるまで、ピンセットで、さておき、他のすべての臓器に移動します。子宮がついたままで、腹腔（ 図1A）の外に移動するために鉗子を使用しています。
- 各子宮角の卵管と子宮卵管接合部の遠位に卵巣の位置を確認します。小さな手術用はさみを使用して、子宮卵管接合部で切開を行い、子宮血管を含む腸間膜から子宮角を分離します。その後、子宮頸部での消費税は腹腔（ 図1B）から子宮角をデタッチします。
- 小さな手術用ハサミで、子宮頸部と子宮角の下側セグメント間の切開を行います。子宮角を開けないようにするために、このプロセス（ 図1C）の間、子宮頸部の一部を添付しておきます。
- 移植部位を水和するために - （15ミリリットル10）1×PBS溶液で満たされた大きなペトリ皿に（子宮頸部を含む）子宮角を浸し。
- まだ1×PBS溶液に浸漬しているが、小さな手術用ハサミで子宮角から任意の脂肪をトリミングします。解剖を通して1×PBS溶液に浸漬した組織にしてください。
- ピンセットで所定の位置に子宮角を持ち、小さな手術用はさみ（ 図1D）を使用して、インター注入領域を切断横と子宮からの移植部位の1つを削除します。移植部位はに囲まれ、胎児が含まれています漿尿膜、および子宮、脱落膜、および胎盤組織。
- 鉗子を使用して、所定の位置にサイトを保持し、胎盤と脱落膜組織（ 図1E）に隣接した子宮壁に小さな切開を行います。これらは子宮壁と胎児を含む漿尿膜（ 図1F）の両方から分離された状態になるまで、胎盤/脱落膜の周囲にトリム。
- 胎盤を除去し、1×PBS溶液中に脱落膜組織と場所を添付（3〜5ミリリットル;ステップ1.12を参照してください）。
- （3〜5ミリリットル）1×PBS溶液で満たされたペトリ皿に子宮組織に取り付けられた絨毛尿膜に囲まれた胎児を配置します。これらの組織の水和は、子宮壁（ステップ1.14参照）からの漿尿膜の分離を容易にします。
- 先の細いピンセットを使用して、静かに胎盤表面から脱落膜組織（白灰色の層）を剥離。これを実行します胎盤および脱落膜組織（ 図1G）の完全性を維持するために慎重に進みます。
- （ - 5 mlずつ3）1×PBS溶液で充填された2つの別々に標識されたペトリ皿中の胎盤および脱落膜組織を配置します。
- 静かに先の細いピンセットで絨毛尿膜から子宮壁を取り除きます。これらは、子宮組織です。
- （3〜5ミリリットル）1×PBS溶液で満たされたペトリ皿に子宮組織を配置します。
- すべての移植部位が処理されるまで繰り返して、1.15を介して1.8を繰り返します。
- 酵素消化の間に細胞の収率を向上させるためにいくつかの子宮、脱落膜、および胎盤組織を収集します。組織の量は、ごみの大きさに依存します。しかし、白血球の分離が組織の> 2枚が必要です。
注：別の妊娠日に移植部位の解剖に関する詳細情報については、Investigatiにガイドの第二章で見られる画像を表示マウスの妊娠42の上。
2.子宮、脱落膜、および胎盤組織解離
- 適切な組織名を使用して、いくつかの滅菌2ミリリットルをコニカルチューブにラベルを付けて、氷上で酵素液を1000μlのバイアルを置きます。
- 標識された2ミリリットルの円錐管に子宮、脱落膜、または胎盤組織の - （150から100mg）、1×PBS溶液で満たされたペトリ皿から、二枚を転送します。
- 各2ミリリットルコニカルチューブに冷酵素溶液500μlを追加します。
- 細かい滅菌ハサミで、それは細かくみじん切りされるまで酵素溶液に浸漬した組織を解離し始めます。時間が経つにつれて、懸濁液は乳白色の外観を開発します。このステップでは、サンプルの過剰な操作を防止するために、以上の2分を超えてはなりません。
- 組織が解離された後、2ミリリットルコニカルチューブに冷酵素液の余分な500μlを添加します。
- 氷上で2ミリリットルコニカルチューブを置きます。
- すべての組織が処理されるまで繰り返し、個々の組織に2.6を介して2.2を繰り返します。
- 37ºCでインキュベーターに氷からホモジナイズした組織（みじん切り組織+酵素溶液）サンプルを用いて、すべての2ミリリットルを円錐管に移し、穏やかな軌道撹拌（80 rpm）を行ってください。 35分 - 30インキュベートします。インキュベーターの温度はインキュベーション時間を開始する前に安定化していることを確認します。
- インキュベーション後、インキュベーターから解離組織と2ミリリットルを円錐管を除去し、それ以上の消化を防止するために氷の上に置きます。
- 組織タイプに応じて滅菌50mlコニカルチューブにラベルを付けます。ふたを取り外し、滅菌セルストレーナー（100μmの孔サイズ）に置き換えます。
- 〜1×PBS溶液20mlをセルストレーナーを介して、円錐管が使用して2ミリリットルから解離した組織を注ぎます。組織の断片は、セルストレーナーに残る細胞懸濁液は、それを通過します。
- ジを洗いますセルストレーナーでssociated組織2 - トランスファーピペットを用いて1×PBS溶液20mlで3回。
- 空の2ミリリットルを1×PBS溶液（1ml）で円錐管を洗浄し、セルストレーナーを介してコンテンツを注ぎます。
- 50mlコニカルチューブからの細胞ストレーナーを取り外し、蓋を交換してください。 4ºCで10分間、1,250×gでチューブを遠心。
- 慎重に、細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。細胞ペレットは、単離された白血球との間質細胞が含まれています。
- ウシ胎児血清（FBS）を含まないRPMI培地1ml中の細胞ペレットを再懸濁します。穏やかに混合します。渦を使用しないでください。
- 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにきちんとFBSの500μlを添加して、ゆっくりと細胞懸濁液をオーバーレイ。
- 細胞破片をPBS / FBSの界面に保持される生細胞をペレット化するために、室温でブレーキなしで1100×gで10分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを触れることなく、上清を吸引除去します。セルLペレットは、主に生細胞が含まれています。
- オプション：以下に説明するように、20％の飽和多糖溶液を使用し、単核細胞を濃縮します。
- FBSを含まないRPMI培地1000μlの細胞ペレットを再懸濁します。
- 製造業者の説明書に従って5mlのポリスチレンプラスチックチューブに20％飽和の多糖溶液1mlを加え、ゆっくりとこの溶液の上に細胞懸濁液をオーバーレイ。サンプルを重ねているが、細胞懸濁液を20％飽和多糖溶液を混合することは避けてください。
- ブレーキなしで室温で30分間、500×gで、スイングアウトローターで遠心します。これは、細胞を混合し、勾配が失われないようにブレーキをオフにすることが非常に重要です。単核細胞を、20％飽和多糖類溶液と1×PBS溶液との間のインターフェイスに記載されています。
- 吸引し、上清を捨てます。細胞ペレットは、主に単核細胞が含まれています。
いいえテ：、生存性染色および細胞内染色を行い免疫表現を実行するには、手順3を参照して、唯一の生存性染色および細胞外染色を実行するには、手順4を参照して、分離された白血球の細胞培養を実行するには、手順5を参照して、実行するには、手順6を参照するには磁気細胞選別は、ステップ7を参照してください。
修正可能細胞3.生存率染色
- 1×PBS溶液を1100μlの細胞ペレットを再懸濁します。マイクロピペットを用いて穏やかに混合します。
- 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに100μlの細胞懸濁液を転送します。 5ミリリットルポリスチレンチューブに1×PBS溶液400μlを添加します。このチューブは、組織の自家蛍光のためのコントロールです。ステップ3.5まで4ºCで保管してください。
- 新しい5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに細胞懸濁液の残りの千μLを転送します。生存性色素の1μLを加え、穏やかに均質化します。 4ºCで暗所で30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、千＆＃を追加181; 1×PBS溶液のL。手で穏やかに混合します。
- 遠心分離機の両方の5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブは、4ºCで10分間1250×gで（3.2と3.3ステップ）。吸引し、上清を捨てます。
注：細胞ペレット（ステップ3.3）は、細胞ペレット（ステップ3.2）は、組織の自家蛍光のための対照となるステップ4で使用されます。
4.免疫表現
- 抗マウスCD16 / CD3250μlに細胞ペレットを再懸濁し（1希釈：FACS緩衝液で100 [0.1％BSA、0.05％アジ化ナトリウム、1×PBS溶液を、pHが7.4]）。静かに細胞懸濁液を混ぜます。渦を使用しないでください。
- 10分間4℃で暗所での5mlポリスチレンチューブ中の細胞懸濁液をインキュベートします。
- インキュベーション後、細胞外の細胞表面マーカーまたはアイソタイプ適合対照抗体と反応する各抗白血球モノクローナル抗体50μlの（抗体希釈液を検証する必要があります）を追加します。例えば、白血球亜集団を分析するために、抗MOを使用CD45、Ly6G、F4 / 80、CD11cの、CD49b、B220、CD3、CD4、およびCD8（ 表1）：以下の白血球の細胞表面マーカーと反応する抗体を使用しています。
- 細胞外マーカーに対する抗体は、5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに追加された後、穏やかに混合します。 4℃で30分間、暗闇の中でインキュベートします。
- このインキュベーションの間、固定緩衝液調製及び前ウォーム（脱イオン水で希釈し、1：5）37ºCに、必要に応じ。その使用が必要になるまで、暗闇の中で37ºCでバッファをしてください。
- 30分間のインキュベーション後、5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにFACS緩衝液の500μlを添加し、穏やかに混合します。この工程は、細胞を洗浄し、未結合の抗体のいずれかの過剰を除去するために必要です。
- 10分間4℃で1,250×gでサンプルを遠心。吸引し、上清を捨てます。
注：細胞内染色を必要としない場合、細胞内染色が必要な場合は、ステップ5を参照の透過を行い、セル内その後、ウラルここ染色、および固定（ステップ4.8）に進みます。 - 細胞ペレットに予熱した固定緩衝溶液500μlを添加し、37ºCで10分間暗闇の中でインキュベートします。
- 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにFACS緩衝液500μlの分注します。穏やかに混合します。
- 10分間4℃で1,250×gでサンプルを遠心。吸引し、上清を捨てます。
- 各サンプルにFACS緩衝液500μlのを追加します。これらのサンプルは、現在、フローサイトメトリーによって分析することができます。最良の結果を得るためにすぐにサンプルを取得します。
修理不可能細胞5.生存率染色
- 細胞外免疫表現した後、FACS緩衝液500μlの細胞ペレットを再懸濁します。
- サンプルのみを取得する前に4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI、200 / mlの）の1μlを添加します。
- フローサイトメーターを使用して、DAPIを追加した後、2分 - 1内のサンプルを可視化します。
- 滅菌ヒュームフードの下にワークステーションを準備します。水浴を用いて37℃にRPMI培地を事前に温めます。
- 細胞計数のためにFACS緩衝液1000μlの細胞ペレットを再懸濁します。
- 製造者の指示に従って、自動細胞カウンターまたは血球計および0.4％トリパンブルー溶液を使用して生細胞の数を数えます。総生細胞数を記録します。
- 遠心分離機FACS緩衝液を除去するために10分間、4℃で1,250×gで細胞。
- 静かに2〜3回ピペッティングすることによって予め温めておいたRPMI培養培地500μlで細胞ペレットを再懸濁します。
- 滅菌した24ウェルプレート中の細胞の所望の数をプレートし、37℃でインキュベートします。インキュベーション時間は、調査の質問によって決定されます。
7.磁気細胞ソーティング
- MSカラム、磁気細胞分離、15：次の物質とクリーンワークステーションをセットアップしますmlのコニカルチューブ、30μmの分離前フィルタ、およびマルチスタンド。
- MACS緩衝液（0.5％BSA、2mMのEDTA、1×PBS溶液、pH7.2）で500μlの細胞ペレットを再懸濁します。
- 自動セルカウンターまたは血球計および0.4％トリパンブルー溶液を使用して、全生細胞数をカウントし、記録します。
- 10分間4℃で1,250×gで細胞を遠心。吸引し、上清を捨てます。 MACS緩衝液の別の500μlのを追加します。
- 製造メーカーの推奨事項に従って、磁気分離を行うに進みます。
- フローサイトメトリーまたは顕微鏡によって純度を決定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
母体·胎児のインターフェイスからのマウスの組織の切開は、 図1に示されています。この手順は、移植部位（ 図1D）を含む、腹腔（ 図1A、B）、子宮角（ 図1C）を開くと、子宮組織の集合（ 図1E）、胎盤（ 図1F）、および脱落膜組織16.5で（ 図1G）が DPC。 図2は、単離されたマクロファージの形態を示している（F4 / 80 +）、磁気細胞選別を使用して16.5 DPCにおける脱落膜および子宮組織から採取しました。単離されたマクロファージは、サイトカイン（データは示さず）を放出する能力を維持します。脱落膜、子宮、胎盤から単離された生存細胞の収量は、 図3に示し、細胞生存率は全ての組織において70％以上である。 図4は、polymorphonucleを分析するためのゲーティング戦略を示しています T細胞（CD45 + CD3 +）、好中球（CD45 + Ly6G +）、マクロファージ（CD45 + F4 / 80 +）、樹状細胞（CD45 +のCD11c +）を、およびNK細胞（CD45を含むシングレットおよび生存率ゲート内のARと単核白血球、 + 16.5 DPCにおけるCD49b +）。共発現のCD11cマクロファージの割合が高い。5図は 16.5 DPCにおける好中球、マクロファージ、およびT細胞脱落膜、子宮内、および胎盤組織を示している。6図は 、一重および生存率ゲート内のリンパ球を分析するなどのためのゲーティング戦略を示していますT細胞（CD45 + CD3 +）および16.5 DPCにおけるB細胞（CD45 + B220 +）。 T細胞は、CD4 +およびCD8 + T細胞を含みます。母体胎児のインターフェイスにおけるマウスの組織はまた、高い割合のCD3 + CD4-CD8-（ガンマ-デルタT細胞）が挙げられる。 図7は、脱落膜、子宮内のT細胞およびB細胞を示し 、そして16.5 DPCにおける胎盤組織。
JPG "幅=" 700 "/>
図1.組織切開。B6マウスで16.5 DPCにおける（A）子宮角。子宮角を腸間膜および排水容器に取り付けられています。 （B）子宮角が腸間膜から解剖し、まだ子宮頸部に取り付けられました。移植部位と子宮頸部を含む（C）子宮角。 （D）移植部位の解剖。移植部位からの子宮組織の（E）解剖。移植部位から胎盤および脱落膜の（F）分離。脱落膜の（G）剥離（白灰色の層）胎盤から。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.マクロファージは脱落膜および子宮組織から単離された。マクロファージ（F4 / 80 +細胞）、磁気細胞選別を使用して16.5 DPCにおける脱落膜および子宮組織から単離されました。 20X倍率。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
脱落膜、子宮、胎盤組織から単離された単離された細胞の生存率を図3。生存細胞（矢印で表さDAPI-細胞）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
"/>
多形と単核白血球図4.ゲーティング戦略。総白血球集団はシングレット及び生存率ゲート内にゲートされました。 T細胞（CD45 + CD3 +）、マクロファージ（CD45 + F4 / 80 +）、好中球（CD45 + Ly6G +）、樹状細胞（CD45 +のCD11c +）を、およびNK細胞（CD45 + CD49b +）は、（総白血球ゲート内にゲートしましたCD45 +）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
母体·胎児の界面でのマウスの組織図5.好中球、マクロファージ、およびT細胞。好中球（CD45 + Ly6G +）、マクロファージ（CD45 + F4 / 80 +）、およびT細胞（CD45 + CD3 +）は、生存能力の範囲内ゲートしましたおよび単離された脱落膜、子宮、および胎盤細胞における全白血球（CD45 +）のゲート。TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/52866/52866fig5highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6.リンパ球のためのゲーティング戦略。単核細胞は、一重および生存率ゲート内にゲートしました。 T細胞（CD3 +）およびB細胞（B220 +は）生存ゲート内にゲートしました。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、T細胞ゲート（CD3 +）内にゲートした。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
母体·胎児の界面でのマウスの組織図7.リンパ球亜集団。T細胞（CD3 +）およびB細胞（B220 +）は、単離された脱落膜、子宮、および胎盤細胞における生存率ゲート内にゲートしました。 CD4 +およびCD8 + T細胞は、T細胞ゲート（CD3 +）内にゲートした。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| 細胞マーカー | 蛍光色素 | クローン | 会社 | カタログ番号 |
| LIVE / DEAD | DAPI | - | ライフテクノロジーズ | L23105 |
| CD45 | V450 | 30-F11 | BD Biosciences社 | 560501 |
| CD3 | FITC | 145-2C11 | BD Biosciences社 | 553062 |
| CD4 | APC | RM4-5 | BD Biosciences社 | 553051 |
| CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | BD Biosciences社 | 562283 |
| B220 | APC-Cy7を | RA3-6B2 | BD Biosciences社 | 552094 |
| F4 / 80 | PE | BM8 | eBiosciences | 12-4801-82 |
| Ly6G | APC-Cy7を | 1A8 | BD Biosciences社 | 560600 |
| CD49b | APC | DX5 | BD Biosciences社 | 560628 |
| のCD11c | PE-Cy7の | HL3 | BD Biosciences社 | 558079 |
白血球サブセットの免疫表現のために利用する抗体の表1のリスト
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
母体·胎児の界面に浸潤白血球の豊かさと表現型の特徴を記録する一貫性のあるデータの収集は、妊娠関連の合併症の病因を理解するために不可欠です。いくつかの技術は、妊娠31,38,39,43-46を通して母体胎児の界面でのマウス組織からの白血球浸潤の単離を容易にすることが記載されています。しかし、それぞれの技術は、異なる別の酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを酵素、異なる解離時間を必要とする、最も重要なのは、常に単離された細胞の生存率を指定していない、組織の量を指定し、しません。本明細書に説明されたプロトコルは、高い生存率母体·胎児の界面でのマウス組織から浸潤白血球の単離を可能にし、検証に市販の試薬、バッファの準備、組織量、およびインキュベーション時間についての詳細な情報を提供します研究室。
白血球の単離プロセスの最も重要なステップの一つは、組織の解離です。このステップは、機械的な均質化および/ または表現型の特徴47で使用される細胞外タンパク質の完全性を変化させることができる酵素反応を伴います。本明細書に記載されるプロトコルは、胎盤およびマウスの脱落膜および子宮組織から単離された白血球中の細胞外マーカーの整合性を保持するために、穏やかな機械的および酵素組織解離技術の使用を組み合わせた新しいアプローチを提供しています。
単一の酵素と異なる酵素の組み合わせは、母体胎児の界面31,32,39,44でネズミ組織から浸潤白血球を単離するために使用されてきました。多くの場合、実験室で手で特定の濃度に調製され、これらの酵素は、人間のエラーを受ける可能性があります。ここで、代わりに、すぐに使用できる精製されたコラゲナーゼ/ニュートラルPROTカクテルを緩和、のAccutaseは、実験室で実施されています。市販の酵素製剤としては、細胞培養物48で信頼性のある結果を提供することが示されています。この酵素溶液は、効果的に表面抗原48を失うことなく、最も重要なことは、こするとせずに培養プレートからマクロファージをデタッチすることが知られています。この調製された酵素は、それらのその後の培養47を可能にする、長時間持続残る生存単離された細胞で得られた、ヒトおよび動物の神経系組織の消化を処理するために使用されてきました。また、この酵素液は、中枢神経系組織47から単離された細胞でのCD24抗原性を保持します。リベラーゼ-1、コラゲナーゼと中性プロテアーゼの別のカクテル、どちらのAccutaseもリベラーゼ-1遊離DNAの凝集体を生成するために比較すると、しかし、のAccutaseは組織解離47時のリベラーゼ-1よりも緩やかです。コラゲナーゼ/中性プロテアーゼの共同このプロトコルで使用さcktailもCD44、癌幹細胞表面マーカー49の保存にトリプシンの優位性を実証してきました。この研究室での研究は、一貫してこの酵素溶液は、マウス白血球表面抗原を保持することに注目しました。実際に、有益な違いはマクロファージにおいて、細胞外のマーカーの発現が見出されている（のCD11b + F4 / 80 +細胞）、好中球（のCD11b + Ly6G +細胞）、NKT細胞（CD3 + CD49b +細胞）、T細胞（CD3 +細胞）およびB CD4、CD8、CD69、CD25、CD40L、PD1、CD44、CD62L、およびCTLA4を含む細胞（B220 + CD19 +細胞）、およびサイトカイン放出で。したがって、本明細書に記載の方法は、代表的な結果に示すように、マウスにおける母体胎児の界面での白血球浸潤の免疫表現のために最適です。
この方法の1つの重要な利点は、生存能力ゲート内のいくつかの細胞外および細胞内抗原の同時決意です。ドに最も使用される染料Termineの細胞生存率はヨウ化プロピジウム（PI）です。それだけFITCと組み合わせて使用することができるので、その使用は制限されています。 PIは、適切に青と赤のレーザ50によって励起され、ほとんどの他の蛍光色素から区別することができないからです。解決策は、DAPI 50またはUVレーザーによってではなく、一般的に免疫表現に使用青 と赤のレーザーによって励起される他の染料を使用することです。それは修理不可能細胞または固定可能な細胞のための生存性染料を使用するためのDAPI 50の使用を含むように、このプロトコルは、生細胞の免疫表現を可能にします。
本明細書に記載されたプロトコルの第二の重要な利点は、生細胞の高収率での白血球の単離を可能にすることです。代表的なデータは、単離された細胞の89％〜70％が生存可能であることを示しています。このプロトコルは、母体·胎児の界面でのマウス組織から単離された細胞の機能的特性の研究を可能にしたので、これは非常に重要です。 Fまたは例えば、脱落膜および子宮マクロファージおよび刺激下サイトカイン放出の研究の文化は、この方法を使用して行われています。
1）組織収集は、腹腔を開いた後5から10分以内に行わなければならないし、これらの組織はの生存能力を維持するために氷の上に配置する必要があります：次の要因を考慮すると良好な結果を達成するために、記載されたプロトコルの適用が重要です単離された細胞; 2）機械的な組織の均質化は、微細なチップのはさみを使用して実行する必要があり、より長い期間を生存細胞の収率が低下することが実証されているので、2分を超えることはできません。その活性は、この期間の後に減少するので3）、酵素溶液とのインキュベーションの持続時間は1時間未満でなければなりません。 4）酵素溶液とのインキュベーションの温度は、酵素のこのカクテルの最適な活性を得るために、37℃に維持されなければなりません。 5）細胞ペレットのマニピュレータ渦の使用は、細胞の完全性を損傷する可能性があるためピュレーションは、（単離された細胞が分化していると突然の操作が簡単に自分の生存率を減少させることができる）マイクロピペットを用いて穏やかに行う必要があります。 6）緩衝液および遠心分離温度は、細胞懸濁液と同じ温度に保たれなければなりません。 7）単離された細胞は、免疫表現のために処理されるか、またはそれらの生存率は急激に減少するように、すぐに使用する必要があります。免疫表現を行う際に、図8）、サンプルが最良の結果を得るためにすぐにフローサイトメーターを用いて取得する必要があります。
このプロトコルの制限は、 例えば 、トリプシン、ディスパーゼII、およびコラゲナーゼ同様の機能を持つ他の酵素よりも高価である酵素液のコストです。しかし、この酵素液はオーバーと説明した酵素の上に表示されるという利点が優れています。
免疫表現および細胞培養およびソートの他に、このプロトコルの将来のアプリケーションは、NUですmerous多様。例えば、単離された白血球をインビトロで白血球の機能（ 例えば、食作用、細胞毒性、T細胞の増殖および可塑性アッセイなど ）、および反応性酸素種の産生をDNAメチル化、標的遺伝子の発現を決定することが可能です母体胎児の界面でのマウスの組織から。実際、母体胎児の界面でのマウス組織における新規および希少白血球の説明を行うこともできます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、利害の対立を開示していません。
Acknowledgments
NGLは、ウェイン州立大学周産期母子でイニシアティブ、周産期や小児保健によってサポートされていました。私たちは感謝して、原稿の彼らの重要な読書のためのモーリーンMcGertyとエイミーE. Furcron（ウェイン州立大学）を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell Separator | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μm pre-separation filters | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Multistand | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 15 ml conical tubes | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS Buffer | Militenyi Biotec | Laboratory preparation | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1x PBS, pH 7.2) |
| Reagents | |||
| Accutase enzymatic solution | Life Technologies | A11105-01 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| Anti-mouse extracellular antibodies | BD Bioscences/eBiosciences | Table 1 | |
| Sodium azide | Fisher | S227-500 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| LIVE/DEAD viability dye | Life Technologies | L23105 | |
| Fixation buffer solution | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS Buffer | BD Biosciences | Laboratory preparation | 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 1x PBS, pH 7.4 |
| Trypan blue solution 0.4% | BIO-RAD | 145-0013 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| Flow cytometer | BD LSRFortessa | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| Vacuum system | laboratory constructed | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Incubator 3307 | |
| Water bath | Precision | 51221035 | |
| Cell counter | BIO-RAD | TC20 Automated Cell Counter | |
| Optical and fluorescence microscopes | Zeiss and Olympus | Zeiss LSM780 and Olympus CKX41 | |
References
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
- Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
- Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
- Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
- Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
- Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
- Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
- Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
- Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
- Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
- Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring's health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
- Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
- Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
- Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
- Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
- Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
- Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
- Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
- Blaisdell, A., Erlbacher, E. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 619-635 (2014).
- Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
- Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
- Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
- Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
- Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
- Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. , Elsevier Academic Press. 21-42 (2014).
- Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
- Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
- Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
- Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
- Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).
