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Immunology and Infection

इन्फ्लुएंजा ए वायरस nucleoprotein के साथ माउस MX1 प्रोटीन की सह immunoprecipitation

doi: 10.3791/52871 Published: April 21, 2015

Introduction

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Myxovirus प्रतिरोध (एमएक्स) प्रोटीन वायरल रोगजनकों के खिलाफ सहज प्रतिरक्षा रक्षा का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं। ये प्रोटीन प्रकार मैं और प्रकार III इंटरफेरॉन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं कि बड़े dynamin तरह GTPases हैं। इसी एमएक्स जीन एक या एकाधिक प्रतियों में लगभग सभी रीढ़ में मौजूद हैं और उनके जीन उत्पादों Orthomyxoviridae (जैसे।, इन्फ्लूएंजा वायरस), Rhabdoviridae (जैसे।, vesicular stomatitis वायरस), Bunyaviridae (जैसे सहित, वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला को रोकती हैं। ला CROSSE वायरस) और (जैसे, मानव इम्यूनो वायरस -1) 1-4 Retroviridae। इन प्रोटीनों वायरस के इस तरह के एक व्यापक सरणी को पहचान कैसे कोई स्पष्ट साझा प्राथमिक अनुक्रम इन वायरस में रूपांकनों के बिना यह स्पष्ट नहीं है। संभवतः, उनके वायरल लक्ष्य के साथ एमएक्स प्रोटीन की बातचीत का विश्लेषण अन्य मेजबान सेल कारकों के साथ उच्च आदेश परिसरों को शामिल, टी आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगीटोपी वायरस और उनके मेजबानों के बीच हथियारों की होड़ में विकसित किया है।

स्तनधारी एमएक्स प्रोटीन और वायरल लक्ष्यों के बीच बातचीत मानव MxA के लिए सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। मानव MxA orthomyxoviruses इन्फ्लूएंजा ए और Thogoto वायरस सहित कई वायरस, की प्रतिकृति को बाधित कर सकते हैं। MxA जिससे संक्रमण 5 के ब्लॉक में जो परिणाम अपने परमाणु प्रविष्टि, रोकने, Thogoto वायरस Ribonucleoprotein परिसरों (vRNPs) बांधता है। MxA और Thogoto वायरस vRNPs के बीच यह बातचीत सह अवसादन और सह immunoprecipitation प्रयोगों 6-9 के साथ प्रदर्शन किया गया है। एमएक्स प्रोटीन इन्फ्लूएंजा वायरस बाधा कैसे कम स्पष्ट है। एक बड़ी समस्या यह एक एमएक्स प्रोटीन और एक इन्फ्लूएंजा जीन उत्पाद के बीच एक संवाद प्रदर्शित करने के लिए सरल नहीं है। एक रिपोर्ट इन्फ्लूएंजा में एक वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को 10 मानव MxA और एनपी प्रोटीन के बीच एक संवाद का प्रदर्शन किया। यह बातचीत केवल सह immunopr द्वारा दिखाया जा सकता हैecipitation कोशिकाओं बातचीत क्षणिक और / या कमजोर है, सुझाव है कि सेल से पहले पार से जोड़ने अभिकर्मक dithiobis (succinimidyl प्रोपियोनेट) के साथ इलाज किया गया था। अधिक हाल के अध्ययनों से अलग इन्फ्लूएंजा ए उपभेदों के अंतर एमएक्स संवेदनशीलता एनपी प्रोटीन 11,12 की उत्पत्ति से निर्धारित होता है कि पता चला है। इस के साथ लाइन में, इन्फ्लूएंजा वायरस आंशिक रूप से एनपी प्रोटीन 13 में विशिष्ट अवशेषों परिवर्तनशील द्वारा एमएक्स नियंत्रण से बच सकते हैं। यह मेजबान एमएक्स के लिए इन्फ्लूएंजा वायरस का मुख्य लक्ष्य सबसे शायद एनपी vRNP परिसरों में इकट्ठे एनपी प्रोटीन, है कि पता चलता है। हालांकि, इन अधिक हाल के अध्ययनों से कोई भी इन्फ्लूएंजा एनपी या vRNPs और या तो मानव MxA या माउस MX1 के बीच एक संवाद का प्रदर्शन किया।

हाल ही में हमने पहली बार के लिए, पता चला है, विस्तार से यहाँ वर्णन किया गया है जो एक अनुकूलित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल 14, साथ इन्फ्लूएंजा एनपी और माउस MX1 प्रोटीन के बीच एक संवाद। जनरल, सह-मैं मेंmmunoprecipitation प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल जैव रासायनिक तरीकों में से एक है। यह उनके प्राकृतिक वातावरण में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच करने की अनुमति देता है के बाद से इस तकनीक को अक्सर, वैकल्पिक तकनीकों, जैसे, खमीर दो संकर अधिक पसंद है। ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध हैं अगर सह immunoprecipitation endogenously व्यक्त प्रोटीन पर बाहर किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ब्याज की प्रोटीन अभिकर्मक या संक्रमण के माध्यम से सेल में व्यक्त किया जा सकता है और एक समानता टैग इस्तेमाल किया जा सकता है। उपर्युक्त फायदे के अलावा, वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल कमजोर और / या क्षणिक प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में मुख्य घटक सेल बफर में एन ethylmaleimide (NEM) के अतिरिक्त है। NEM 6.5-7.5 के पीएच पर, इस तरह के cysteines में उपहार के रूप में मुक्त thiol समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है कि एक क्षारीकरण अभिकर्मक है, एक स्थिर Thio-एस्टर के लिए फार्म(चित्र 1)। उच्च पीएच कम, NEM भी एमिनो समूहों के साथ प्रतिक्रिया या हाइड्रोलिसिस 15 से गुजरना कर सकते हैं। NEM आम तौर पर डाइसल्फ़ाइड बांड गठन को रोकने या enzymatic गतिविधि को बाधित करने के लिए, मुक्त thiol समूहों को ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, NEM अक्सर सिस्टीन प्रोटिएजों हैं जो desumoylating एंजाइमों, ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह इन्फ्लूएंजा प्रोटीन की sumoylation वायरल प्रोटीन 16 के बीच बातचीत प्रभावित कर सकते हैं कि सूचित किया गया था, क्योंकि वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल में, NEM शुरू में lysis बफर में शामिल किया गया था। अप्रत्याशित रूप से, NEM के अलावा सह immunoprecipitation द्वारा इन्फ्लूएंजा एनपी और माउस MX1 के बीच बातचीत करने के लिए दस्तावेज़ कुंजी साबित हुई। NEM के अलावा एनपी MX1 बातचीत का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है क्यों यह स्पष्ट नहीं है। संभवत: बातचीत भी क्षणिक और / या कमजोर है। NEM MX1 की एक विशिष्ट रचना, एक वायरल प्रोटीन या यहां तक कि एक अज्ञात तीसरे कम्पो संरक्षण के द्वारा, जैसे संपर्क, स्थिर कर सकतामाने। NEM के इस तरह के एक स्थिर प्रभाव ribonucleotide रिडक्टेस एम 1 और उसके अवरोध करनेवाला gemcitabine (F2dC) 17 के बीच बातचीत के लिए, उदाहरण के लिए, पहले देखा गया है। MX1 और एनपी दोनों NEM द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जो कई सिस्टीन अवशेष होते हैं। उदाहरण के लिए, रेनी एट अल। द्वारा हाल के एक अध्ययन एक stalkless MxA-संस्करण iodoacetamide द्वारा संशोधित किया जा सकता है, जो तीन विलायक उजागर सिस्टीन अवशेषों में शामिल है कि प्रदर्शन किया। Serines करने के लिए इन अवशेषों परिवर्तनशील MxA के enzymatic गतिविधि को प्रभावित है, लेकिन डाइसल्फ़ाइड की मध्यस्थता एकत्रीकरण 18 रोका नहीं था। इन cysteines MX1 में संरक्षित कर रहे हैं, इस MX1 में अनुरूप cysteines NEM से और इस तरह के प्रभाव अपनी रचना या विलेयता के रूप में संशोधित किया जा सकता है कि पता चलता है। इसके अलावा, NEM भी MX1 के विरोधी इन्फ्लूएंजा गतिविधि के लिए आवश्यक है जो MX1 के GTPase गतिविधि को प्रभावित है, और इस तरह MX1 और एनपी के बीच बातचीत को स्थिर कर सकते हैं। हालांकि, GTPase acti पर NEM का एक सीधा प्रभावNEM भी इन्फ्लूएंजा एनपी और GTPase MX1 प्रोटीन 14 के निष्क्रिय म्यूटेंट के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए आवश्यक है के रूप में MX1 की vity, संभावना नहीं है। जाहिर है, और अधिक शोध एनपी MX1 बातचीत पर NEM के प्रभाव को जानने की जरूरत है।

सारांश में, वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल एंटीवायरल MX1 प्रोटीन और उसके वायरल लक्ष्य, इन्फ्लूएंजा एनपी प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल भी विशिष्ट प्रोटीन रचना का स्थिरीकरण पर निर्भर करती है कि अन्य कमजोर या क्षणिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशिष्ट रचना पर निर्भर करती है कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत ऐसे Calmodulin 19 के रूप में कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के लिए, उदाहरण के लिए, पहले वर्णित किया गया है। अंत में, NEM का लाभकारी भूमिका भी इस तरह के सह अवसादन assays के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने कि अन्य तरीकों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

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नोट: निम्न अभिकर्मक और सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल एक 9 सेमी पेट्री डिश प्रारूप के लिए स्थापित किया गया है। अन्य प्रारूपों प्रोटोकॉल स्केलिंग के बाद भी संभव है।

1. सीडिंग मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं

  1. 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी एल glutamine, 0.4 मिमी ना-पाइरूवेट के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 12 मिलीलीटर में 9 सेमी पेट्री डिश प्रति 1.2 x 10 6 कोशिकाओं में अभिकर्मक से पहले HEK293T कोशिकाओं एक दिन के बीज, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन।
  2. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए आगे बढ़ें।
  3. नेत्रहीन अभिकर्मक से पहले एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ आकृति विज्ञान और कोशिकाओं की व्यवहार्यता का निरीक्षण किया। कोशिकाओं इष्टतम अभिकर्मक दक्षता के लिए उप मिला हुआ होना चाहिए।

HEK293T कोशिकाओं की 2. कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक

ध्यान देंका प्रयोग करें: 0.5-1 pCAXL एनपी या 9 सेमी पकवान प्रति pCAXL-MX1 1-3 माइक्रोग्राम प्रति के साथ संयोजन में खाली pCAXL प्लाज्मिड की माइक्रोग्राम प्रति। सभी नमूनों में कुल प्लास्मिड डीएनए के बराबर राशि का उपयोग करें; खाली प्लाज्मिड यदि आवश्यक हो तो साथ समायोजित करें।

  1. निम्नलिखित अभिकर्मक बफ़र्स तैयार:
    1. 1.0 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0 और 0.1 मिमी EDTA 8.0 पीएच की सांद्रता के साथ Tris EDTA (ते) तैयार करें।
    2. 25 मिमी HEPES की सांद्रता के साथ बी एस / HEPES तैयार करें (5.96 ग्राम / एल, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड), 274 मिमी NaCl (16 जी / एल), 10 मिमी KCl (0.74 ग्राम / एल), 1.5 मिमी NaHPO 4 · 12H 2 हे (0.5 ग्राम / एल) और 11.1 मिमी डेक्सट्रोज (2 जी / एल)। 7.05 पीएच को समायोजित करें।
    3. 1.25 एम 2 CaCl · 2H 2 ओ (183.8 ग्राम / एल) और 125 मिमी HEPES (29.79 ग्राम / एल) की सांद्रता के साथ 2 CaCl / HEPES तैयार करें। NaOH के साथ 7.05 पीएच को समायोजित करें।
  2. उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक बफ़र्स गर्म।
  3. ते के 600 μl में प्लास्मिड डीएनए गिराए द्वारा प्लाज्मिड नमूने तैयार करें।6 अच्छी तरह से थाली के कुओं में इन मिश्रण तैयार करें।
  4. प्लाज्मिड नमूने के लिए एक बूंद बुद्धिमान तरीके से 2 CaCl / HEPES के 150 μl जोड़ें और ऊपर और नीचे 3 बार pipetting द्वारा मिश्रण।
  5. (; 750 μl ते + डीएनए + 2 CaCl / HEPES) एक ताजा 6 अच्छी तरह से थाली में प्रदान की बी एस / HEPES बफर के 750 μl के लिए बुद्धिमान प्लाज्मिड समाधान जोड़ने ड्रॉप द्वारा अभिकर्मक समाधान तैयार है। पूरा अच्छी तरह से युक्त बी एस / HEPES बफर पर समान रूप से प्लाज्मिड समाधान बांटो।
  6. 1000 आरपीएम पर 90 सेकंड के लिए एक थाली प्रकार के बरतन पर अभिकर्मक समाधान हिलाएँ।
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं।
  8. अभिकर्मक समाधान (1.5 एमएल) कोशिकाओं को बुद्धिमान बूंद जोड़ें। कोशिकाओं पर अभिकर्मक समाधान ड्रिप के लिए एक P1000 micropipet का प्रयोग करें। पूरा 9 सेमी पेट्री डिश के ऊपर मिश्रण फैलाने और बहुत धीरे थाली हिला।
  9. छह घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5%। फिर आकांक्षा से मध्यम हटाने और तुरंत वाई की जगह12 मिलीलीटर ताजा, पूर्व गर्म मध्यम वें। धीरे सेल टुकड़ी को रोकने के लिए कोशिकाओं को ताजा मध्यम जोड़ने। इस के लिए, अच्छी तरह से पक्ष के खिलाफ pipet के टिप पकड़ और धीरे मध्यम बाहर धक्का।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 16 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2।

3. सह immunoprecipitation

नोट: अभिकर्मक के बाद सह immunoprecipitation 24 घंटा प्रदर्शन करते हैं।

  1. कम नमक lysis बफर और उच्च नमक धोने बफर तैयार करना।
    1. NEM की राशि वजन और निरपेक्ष इथेनॉल में यह भंग करके 2 एम एन-ethylmaleimide (NEM) के एक शेयर के समाधान तैयार है। उपयोग करने से पहले ताजा NEM शेयर समाधान तैयार है।
      चेतावनी: nem, बहुत विषैला होता है तैयार करने और एक धूआं हुड में इस शेयर समाधान का उपयोग करें।
    2. 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1% NP40 और एक protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल की सांद्रता में कम नमक lysis बफर तैयार करें (1 टेबल भंग50 मिलीलीटर lysis बफर में टी)। 25 मिमी (यानी, 1:80 पतला) के एक अंतिम एकाग्रता के लिए NEM जोड़ें। प्रोटीज इनहिबिटर्स और NEM जोड़ने के बाद बर्फ पर रखें।
      नोट: हमेशा उपयोग करने से पहले हौसले प्रोटीज इनहिबिटर्स और NEM जोड़ें।
    3. 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 500 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA और 1% NP40 की सांद्रता में एक उच्च नमक धोने बफर तैयार करें। उच्च नमक धोने बफर NEM शामिल नहीं है कि ध्यान दें।
  2. सेल lysates की तैयारी।
    1. मध्यम निकालें और बर्फ के ठंडे फॉस्फेट बफर खारा के 2 मिलीलीटर (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें। HEK293T कोशिकाओं को आसानी से अलग कर के रूप में बहुत धीरे से, धो बफर जोड़ें।
    2. पीबीएस निकालें और 9 सेमी पेट्री डिश प्रति बर्फ ठंड कम नमक lysis बफर के 600 μl जोड़ें।
    3. बर्फ पर 20 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं। प्लेटें क्षैतिज रखा जाता है कि lysis बफर के साथ थाली सतह की पूरी कवरेज आश्वस्त करने के लिए, सुनिश्चित करें। धीरे हर 5 मिनट प्लेटों हिला।
    4. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge में सेल lysate लीजिए4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट और 16,000 XG के लिए ट्यूब और अपकेंद्रित्र अघुलनशील अंश गोली।
    5. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब सेल lysate यानी, घुलनशील अंश स्थानांतरण और बर्फ पर रहते हैं। तुरंत बातचीत प्रोटीन की हदबंदी को रोकने के लिए, सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल के साथ जारी है। Lysates में प्रोटियोलिटिक गतिविधि को सीमित करने के रूप में बर्फ पर संभव के रूप में ज्यादा या 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी निम्न चरणों का पालन।
  3. प्रतिरक्षा परिसरों का सृजन।
    नोट: इस चरण में, ब्याज की प्रोटीन उपयुक्त एंटीबॉडी से बाध्य है। एनपी MX1 बातचीत का अध्ययन करने के लिए, एक माउस विरोधी एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    1. प्रत्येक नमूना के लिए, विरोधी एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 2 μl और कम नमक lysis बफर (250 μl की कुल मात्रा) के 113 μl के साथ lysate के 135 μl मिश्रण। , इस तरह के पश्चिमी सोख्ता के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष lysate स्टोर अनुमान लगाया intera की अभिव्यक्ति के स्तर करने के लिए दस्तावेज़ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में ction के भागीदारों।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक lysate के लिए, उदाहरण के लिए, 400 माइक्रोग्राम प्रति (ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ उदाहरण के लिए) lysate के प्रोटीन एकाग्रता मापने के लिए और कुल प्रोटीन की एक निश्चित राशि का उपयोग करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मोड़ पहिया पर तीन घंटे के लिए एंटीबॉडी lysate मिश्रण सेते हैं। यह कदम एक रात ऊष्मायन के लिए बढ़ाया जा सकता है।
  4. प्रोटीन जी मोतियों की तैयारी।
    नोट: प्रोटीन जी मोती भेज दिया और संरक्षण के लिए 20% इथेनॉल में जमा हो जाती है। मनका-गारा सामान्य रूप से 50% मोती के होते हैं और वे प्रतिरक्षा परिसरों immunoprecipitate करने के लिए उपयोग किया जाता है पहले इन मोतियों धोया जा करने की जरूरत है।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए, यानी मोती, के 50 μl, मनका-गारा के 100 μl का प्रयोग करें। एक ट्यूब में सह immunoprecipitation परख में सभी नमूनों के लिए आवश्यक मोतियों की राशि धो लें। मनका-गारा का pipetting के कम करने के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप टिप कट।
    2. 8000 एक्स में प्रोटीन जी मनका-गारा अपकेंद्रित्रग्राम और 30 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस। इथेनॉल समाधान निकालें और कम नमक lysis बफर के एक बराबर मात्रा में जोड़ें। अपकेंद्रित्र प्रोटीन जी 8000 XG पर मनका-गारा और 30 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और धीरे सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इस धोने कदम तीन बार दोहराएँ।
      नोट: प्रोटीज inhibitors या NEM को नियंत्रित करने की जरूरत नहीं है मोती धोने के लिए इस्तेमाल कम नमक lysis बफर।
    3. प्रोटीन जी मोतियों की मात्रा का अनुमान और कम नमक lysis बफर के एक बराबर मात्रा कम नमक lysis बफर में एक नया 50% मनका-गारा बनाने के लिए जोड़ सकते हैं।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए, एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मनका-गारा के 100 μl हस्तांतरण और उपयोग करें जब तक बर्फ पर दुकान। इन मोतियों जल्दी ट्यूब के नीचे तलछट के रूप में विभाजित करने से पहले मनका-गारा resuspend करने के लिए सावधान रहें।
  5. प्रोटीन जी मोती और उनके क्षालन द्वारा प्रतिरक्षा परिसरों की immunoprecipitation।
    1. , अपकेंद्रित्र सभी ट्यूबों 30 सेकंड 8000 XG पर और 4 डिग्री सेल्सियस और immunoprecipitation के लिए प्रोटीन जी मोती उपयोग करने से पहलेसभी नमूनों में मौजूद मोतियों की एक समान राशि है कि वहाँ दृश्य निरीक्षण द्वारा सत्यापित करें। यदि आवश्यक हो फिर से नमूने और अपकेंद्रित्र में से कुछ में मोतियों की राशि को समायोजित। Supernatants त्यागें। Pelleted प्रोटीन जी मोती परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    2. संक्षेप में प्रतिरक्षा परिसरों अपकेंद्रित्र (अर्थात्।, एंटीबॉडी, 250 μl साथ lysates) 8000 XG पर 30 सेकंड और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब के नीचे पूरा नमूना लेने के लिए। प्रोटीन जी मोती (50 μl) के लिए प्रतिरक्षा-परिसरों स्थानांतरण।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मोड़ पहिया पर 60 मिनट सेते हैं। प्रोटीन जी मोती के लिए प्रोटीन की अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए इन प्रतिरक्षा परिसरों मोतियों के साथ लंबे समय तक की तुलना में 75 मिनट सेते हैं मत करो।
    4. 8000 XG पर 30 सेकंड के लिए (बन्धे प्रतिरक्षा परिसरों के साथ) प्रोटीन जी मोती अपकेंद्रित्र और 4 डिग्री सेल्सियस और supernatants हटा दें। Pelleted प्रोटीन जी मोती परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। वैकल्पिक: या -20 बाद में विश्लेषण के लिए डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस पर इस supernatants की दुकान,जैसे, अनबाउंड प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए।
    5. उच्च नमक lysis बफर के 900 μl के साथ लगभग 5 मिनट के लिए प्रोटीन जी मोती धो लें। मोती पूरी तरह से इष्टतम धोने के लिए धोने बफर में resuspended हैं कि सुनिश्चित करें। 8000 XG पर 30 सेकंड के लिए प्रोटीन जी मोती अपकेंद्रित्र और 4 डिग्री सेल्सियस और supernatants त्यागें। इस धोने चरण 4 बार दोहराएँ। Immunoprecipitated सामग्री के नुकसान से बचने के लिए pelleted प्रोटीन जी मोती परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    6. पिछले धोने के कदम के बाद, मोती 2x Laemmli नमूना बफर के 50 μl जोड़ने और (CO) immunoprecipitated प्रोटीन elute करने के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए निलंबन की गर्मी।
      1. सोडियम dodecyl सल्फेट के 1 ग्राम, ग्लिसरॉल के 3.5 मिलीग्राम, 1 एम Tris-एचसीएल पीएच 6.8 और β-mercaptoethanol के 420 μl के 3.5 मिलीलीटर के साथ 6x Laemmli बफर के 10 एमएल तैयार करें। आसुत जल जोड़कर 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा को समायोजित करें। 2x Laemmli बफर प्राप्त करने के लिए आसुत जल में 3 बार पतला।
        चेतावनी: &# 946; -mercaptoethanol विषैला होता है, तैयार करने और एक धूआं हुड में Laemmli बफर का उपयोग करें।
    7. गर्म करने के बाद, 8000 XG पर 30 सेकंड के लिए प्रोटीन जी मोती अपकेंद्रित्र और 4 डिग्री सेल्सियस (शॉर्ट टर्म) या -20 सी (दीर्घावधि) डिग्री पर नमूनों की दुकान।

4. immunoprecipitated प्रोटीन (सह) का विश्लेषण

  1. एसडीएस पृष्ठ 20 और 21,22 सोख्ता पश्चिमी द्वारा सेल lysate और सह immunoprecipitation की eluate में मौजूद प्रोटीन कल्पना। आमतौर पर जेल पर Laemmli eluate के आधे लोड। जेल लोड करने के लिए नमूने लेने के दौरान pelleted प्रोटीन जी मोती परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। MX1 और एनपी अभिव्यक्ति विरोधी MX1 और विरोधी एनपी एंटीबॉडी, क्रमशः 14 एक साथ पता चला रहे थे। बैंड एचआरपी-आधारित chemiluminescence और एक एक्स-रे फिल्म डेवलपर के साथ पाया गया।

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Representative Results

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एन ethylmaleimide अचल सिस्टीन प्रोटिएजों (चित्रा 1) को बाधित करने के लिए, उदाहरण के लिए नि: शुल्क thiol समूहों को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कार्बनिक यौगिक है।

एंटीवायरल MX1 प्रोटीन इन्फ्लूएंजा वायरल nucleoprotein के साथ बातचीत के द्वारा एक वायरस प्रतिकृति को रोकता है। यहाँ वर्णित अनुकूलित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल इस एनपी MX1 बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। HEK293T कोशिकाओं इन्फ्लूएंजा एनपी प्रोटीन के अभाव या उपस्थिति में एंटीवायरल MX1 प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। अगला, एनपी प्रोटीन एक एनपी विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ कुल सेल lysates से खींच-नीचे था। दो MX1 प्रोटीन केवल सह immunoprecipitated सह व्यक्त एनपी की उपस्थिति में है कि पता चलता है। एनपी के अभाव में MX1 के संभावित अविशिष्ट सह immunoprecipitation विरोधी एनपी एंटीबॉडी द्वारा या करने MX1 की अविशिष्ट बंधन से MX1 प्रोटीन की अविशिष्ट पुल से नीचे या तो की वजह से हैप्रोटीन जी मोती। इसलिए, हमेशा इस अविशिष्ट सह immunoprecipitation का आकलन करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं। 3 एनपी MX1 बातचीत केवल NEM की उपस्थिति में पता लगाया जा सकता है कि पता चलता है। इस प्रयोग में, प्रोटीन जी मोती को MX1 की अविशिष्ट बंधन विरोधी एनपी एंटीबॉडी के अभाव में एक नियंत्रण सह immunoprecipitation प्रतिक्रिया के साथ मूल्यांकन किया गया था।

इस प्रोटोकॉल भी MX1 और संक्रमित कोशिकाओं से या virions से अलग इन्फ्लूएंजा एनपी प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस आवेदन के लिए, ऊपर प्रोटोकॉल थोड़ा MX1 सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले वायरल एनपी प्रोटीन युक्त lysates के साथ कोशिकाओं को व्यक्त करने का lysates के संयोजन के द्वारा रूपांतरित किया गया। 4 चित्रा एनपी साथ MX1 के सह immunoprecipitation ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, संक्रमित कोशिकाओं से अलग दिखाता है या virions।

अंत में, इन परिणामों इस सह immunoprecipitation prot बताते हैं किocol एक antiviral प्रोटीन और उसके वायरल लक्ष्य के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। एन ethylmaleimide से मुक्त thiol समूहों के अपरिवर्तनीय संशोधन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
MX1 और एनपी दोनों मौजूद हैं, जिनमें से एक में और एनपी प्रोटीन अनुपस्थित है, जिसमें एक नियंत्रण सेटअप: चित्रा 2:। दो नमूनों के साथ एक सह immunoprecipitation प्रयोग के MX1 एनपी के साथ सूचना का आदान प्रदान पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। एनपी विरोधी एनपी और एनपी और MX1 साथ immunoprecipitated गया था पश्चिमी सोख्ता द्वारा कल्पना थे। यह आंकड़ा च संशोधित किया गया हैROM 14।

चित्र तीन
। चित्रा 3: - MX1 बातचीत एन ethylmaleimide की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रदर्शन एक सह immunoprecipitation प्रयोग के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण एन ethylmaleimide महत्वपूर्ण है एनपी पता लगाने के लिए। एनपी विरोधी एनपी और MX1 और एनपी साथ immunoprecipitated गया था पश्चिमी सोख्ता द्वारा कल्पना थे।

चित्रा 4
चित्रा 4:। इन्फ्लूएंजा ए virions से अलग संक्रमित कोशिकाओं या vRNPs से vRNPs, vRNPs ट्रांसफ़ेक्ट एक नियंत्रण lysate (कोई vRNPs),: MX1 युक्त एनपी संक्रमित कोशिकाओं से या virions से पृथक साथ MX1 सूचना का आदान प्रदान lysates विभिन्न स्रोतों से एनपी युक्त lysates के साथ संयुक्त थे । Lysates मिश्रण, सह immunopre के बादविरोधी एनपी साथ cipitation प्रदर्शन किया था और MX1 और एनपी पश्चिमी सोख्ता द्वारा कल्पना थे।

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Discussion

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एंटीवायरल प्रोटीन और उनके वायरल लक्ष्यों के बीच बातचीत का अध्ययन कर इन प्रोटीनों की एंटीवायरल तंत्र के विवरण को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इस नए एंटीवायरल रणनीतियों के विकास के लिए आधार वायरस और उनके मेजबानों-विकसित सह कैसे में नए अंतर्दृष्टि देने के लिए और किया जा सकता है। यहाँ वर्णित अनुकूलित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल माउस MX1 प्रोटीन और उसके वायरल लक्ष्य, इन्फ्लूएंजा एनपी प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। एनपी MX1 बातचीत NEM (चित्रा 3) के अभाव में undetectable है के रूप में इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण पहलू है, lysis बफर में NEM के अतिरिक्त है। तिथि करने के लिए, यह NEM की उपस्थिति इस बातचीत का पता लगाने के लिए आवश्यक है कि क्यों नहीं जाना जाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल cysteines शामिल कर रहे हैं, खासकर अगर विशिष्ट प्रोटीन रचना का स्थिरीकरण पर निर्भर करती है जो अन्य कमजोर और / या क्षणिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

एकसामान्य रूप में सह immunoprecipitation assays के महत्वपूर्ण सीमा उच्च आत्मीयता के साथ बातचीत के भागीदारों में से एक में गठनात्मक epitopes समझते हैं कि विशिष्ट और उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता है। एनपी MX1 बातचीत घर में एंटी-MX1 पॉलीक्लोनल सीरमरोधी उत्पादित हमारे साथ प्रदर्शन नहीं किया जा सका। इस सीरमरोधी भी MX1 के अभाव में, इन्फ्लूएंजा एनपी प्रोटीन immunoprecipitates। इसके अलावा, इस्तेमाल किया गया था कि विरोधी एनपी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, ए / प्योर्टो रिको / 8/34 इन्फ्लूएंजा तनाव की एनपी प्रोटीन पहचानता है, लेकिन दुर्भाग्य से यह एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस उपभेदों के एनपी नीचे खींचने के लिए उपयुक्त नहीं है। इस सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल की एक और सीमा प्रोटीन जी मोती को MX1 की अविशिष्ट बाध्यकारी है। उत्तरार्द्ध धोने बफर में नमक एकाग्रता बढ़ती है और lysate और प्रोटीन जी मोती के बीच संपर्क समय को कम करने से दूर किया जा सकता बाध्यकारी। इसके अलावा, मोतियों की राशि को कम करने के लिए प्रत्येक immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया25 μl 50 μl से प्रतिक्रिया है, आगे इन मोतियों को MX1 के बंधन अविशिष्ट कम कर सकते हैं। सामान्य में, प्रोटीन जी मोती को अविशिष्ट बंधन की वजह से contaminating प्रोटीन के अनपेक्षित पुल से नीचे, यह भी अन्य रणनीतियों से कम किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इन प्रोटीनों इन प्रोटीनों एंटीबॉडी के अभाव में प्रोटीन जी मोतियों के साथ lysate incubating से हटा रहे हैं, जिसमें एक पूर्व स्पष्ट कदम है, के दौरान हटाया जा सकता है। contaminating प्रोटीन तो मोतियों के साथ एक साथ निकाल रहे हैं और पूर्व मंजूरी दे दी lysate सह immunoprecipitation के लिए प्रयोग किया जाता है। Contaminating प्रोटीन अध्ययन के तहत प्रोटीन (एस) से अलग कर रहे हैं तो यह रणनीति ही लाभदायक है। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन पर unspecific बाध्यकारी साइटों जी मोती बीएसए के साथ अवरुद्ध किया जा सकता है। मोती पहली एंटीबॉडी के साथ लेपित हैं अगर बीएसए भी (यानी, कम एंटीबॉडी लेपित-मोतियों से बाध्यकारी) प्रतिरक्षा परिसरों की तेज़ी कम कर सकते हैं लेकिन, जैसा कि इस रणनीति ही, की सिफारिश की है। में ले लीएक साथ, यह प्रोटीन जी मोती करने या इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए अविशिष्ट हित के प्रोटीन के बंधन को छोड़ने के लिए उचित नियंत्रण शामिल करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

वर्णित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल संक्रमित कोशिकाओं में या शुद्ध vRNPs में एक अलग वातावरण में मौजूद एनपी प्रोटीन, जैसे, साथ MX1 की बातचीत का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। MX1 इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण से 23 के दौरान, एनपी सहित वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति को रोकता है। इसलिए, यह बाद में संक्रमित हैं कि MX1 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में एनपी MX1 बातचीत का अध्ययन करने के लिए तकनीकी रूप से बेहद मुश्किल है। फिर भी, यह सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल भी MX1 एनपी MX1 बातचीत के सफल पता लगाने के लिए अनुमति देता है, (चित्रा 4) कोशिकाओं और संक्रमित कोशिकाओं को व्यक्त करने का lysates के संयोजन के बाद किया जा सकता है। NEM का महत्वपूर्ण लक्ष्य नहीं जाना जाता है के रूप में, NEM दोनों सेल आबादी के lysis के दौरान जोड़ा गया है। अगर वांछित, के पीएचlysis बफर बदला जा सकता है। यहाँ वर्णित प्रयोगों (तुरन एट अल। 10 के रूप में) पीएच 8 पर प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन एनपी MX1 सह immunoprecipitation भी सफलतापूर्वक एक पीएच 7.2 lysis बफर के साथ प्रदर्शन किया गया था। इस पीएच NEM मुक्त thiol समूहों के साथ विशेष रूप से प्रतिक्रिया करता है और इस पीएच भी MX1 प्रोटीन की निकासी पैदावार बढ़ जाती है पर क्योंकि असल में 7.2 की एक पीएच, पसंद किया जाता है। इसके अलावा, प्रोटीन जी मोती इस्तेमाल किया एंटीबॉडी प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें से मेजबान प्रजातियों पर निर्भर करता है, प्रोटीन एक मोती द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हालांकि, क्लीनर परिणाम प्रोटीन जी मोतियों के साथ प्राप्त कर रहे हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल भी जैसे MX1 और अन्य इन्फ्लूएंजा प्रोटीन, PB2 14 के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी V5 के agarose आत्मीयता जेल के साथ जोड़ा जा सकता है जो एक V5 के मिलान PB2 इस्तेमाल किया गया था में चिह्नित इस मामले में।

भविष्य प्रयोगों में, इस प्रोटोकॉल MX1 में क्षेत्रों की पहचान करने के लिए मूल्यवान हो सकता है औरएनपी MX1 बातचीत के लिए महत्वपूर्ण हैं कि एनपी। इस लूप MxA और Thogoto वायरस एनपी 8,9 के बीच बातचीत के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है के रूप में MX1 में ऐसा ही एक क्षेत्र है, पाश L4 हो सकता है। उपयुक्त एनपी विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध हो जाते हैं, तो इस प्रोटोकॉल भी MX1 के लिए एवियन इन्फ्लूएंजा ए उपभेदों की वृद्धि की संवेदनशीलता एमएक्स संवेदनशीलता के तंत्र को समझने में मदद कर सकता है जो एक मजबूत एनपी MX1 बातचीत या नहीं, के साथ संबद्ध अगर निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा। इसके अलावा, MX1 और Orthomyxoviridae के अलावा अन्य परिवारों से संबंधित वायरस के घटकों के बीच बातचीत भी इस अनुकूलित सह immunoprecipitation प्रोटोकॉल के द्वारा संबोधित किया जा सकता है। अंत में, आगे की पढ़ाई के लिए बेहतर इस विशिष्ट बातचीत को समझने के लिए बहुत मूल्यवान होगा एनपी MX1 पर NEM के प्रभाव को जानने के लिए, लेकिन यह भी सेल और सह immunoprecipitation प्रयोगों के दौरान इस परिसर के अलावा के व्यापक अनुप्रयोगों में जानकारी हासिल करने के लिए।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

इस काम FWO-Vlaanderen, IOF परियोजना IOF10 / StarTT / 027 और गेन्ट विश्वविद्यालय के विशेष अनुसंधान अनुदान BOF12 / गोवा / 014 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM high glucose Gibco 52100-047
N-Ethylmaleimide Sigma E-3876 Toxic
Igepal CA-630 Sigma I-30212 also known as NP40
Protease inhibitor cocktail Roche 11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository NR-4282 ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository NR-3133 directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF GE Healthcare 17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm GE Healthcare 28-9068-36
ECL western blotting substrate Pierce 32106

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References

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इन्फ्लुएंजा ए वायरस nucleoprotein के साथ माउस MX1 प्रोटीन की सह immunoprecipitation
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Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J. Vis. Exp. (98), e52871, doi:10.3791/52871 (2015).More

Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J. Vis. Exp. (98), e52871, doi:10.3791/52871 (2015).

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