Summary
Resistens til målrettede lægemidler er udbredt, og behovet for at identificere resistensmekanismer - før eller efter kliniske udbrud - er afgørende for at lede alternative strategier kliniske ledelse. Her præsenterer vi en protokol til par afledning af resistente linier i vitro med sekventering at fremskynde opdagelsen af disse mekanismer.
Introduction
Detaljeret molekylær karakterisering af tumor genomer ved robuste sekventering teknologier og forbedrede data analytiske værktøjer har ført til opdagelsen af vigtige genetiske ændringer i bestemte kræfttyper 1,2. Udvikling af målrettede behandlinger rettet mod disse genetiske læsioner, såsom HER2, BCR-ABL, EGFR og ALK, markant har forbedret livskvalitet for patienterne 1,2. Men på trods specificitet denne tilgang, har den kliniske respons på de fleste enlige terapier været under det optimale som modstand i sidste ende opstår. For nylig er der gjort betydelige fremskridt i forståelsen af de molekylære fundament for resistens over for målrettede lægemidler. Interessant nok er det blevet klart, at en fremtrædende resistensmekanisme indebærer vedvarende target / pathway aktivitet. Som et eksempel herpå, androgen receptor (AR) -dirigerede enzalutamide behandling af prostatacancer fører til berigelse af aktiverende mutationer i AR selv, vedligeholdelse AR-signalering output i nærvær af inhibitoren 3-5. Denne viden har ført til en aggressiv kampagne for at 1) at udvikle tredje generation antagonister, der kan fortsætte med at undertrykke både WT og mutant-AR funktion i enzalutamide-resistent PCa 3 og 2) identificere potentielle downstream knudepunkter i AR-signalering, der kan målrettet til terapeutisk intervention . Tilsvarende modstand mod andre klasser af inhibitorer såsom dem rettet EGFR, BRAF og ABL ofte føre til mutationer, der genaktivere den oprindelige addicting kinasebanen 1.
Med den viden, at modstanden uundgåeligt opstår i de fleste patienter, at udvikle tilgange hurtigt bringe disse mekanismer for lys vil tillade udviklingen af effektive opfølgende behandlinger. Én metode, der bliver udbredt er at analysere genomforskning af kliniske ildfaste tumorer i forhold til behandlingsrelaterede naive eller -følsom tumorer at identificere berigelser / udtynding i genetiske læsioner, der kan være modtagelige for dtæppe opdagelse. På trods af sit løfte, er der to vigtige forpligtelser denne tilgang, der hæmmer hurtig opdagelse. For det første kan få rettidig adgang til tumor materiale til genomisk forhør tjene som en væsentlig forhindring i at flytte fra terapi til at helbrede. For det andet kan deconvolution af det utal af genetiske læsioner i den resistente indstillingen være udfordrende, da tumorer kan præsentere en betydelig intratumoral heterogenitet 6,7.
I lyset af disse udfordringer, har der været øget afhængighed af præklinisk opdagelse af resistensmekanismer. Denne fremgangsmåde kan tillade identifikation af prominente resistensmekanismer forud for de kliniske forsøg 1, som kan vejlede alternative strategier klinisk ledelse hos de patienter, der bærer disse mekanismer enten før behandling eller efter indtræden af resistens.
Et sådant prækliniske opdagelse værktøj, der bliver udbredt er at anvende upartiske funktionelle RNAi skærme. Til eksamenpel, anvendt Whittaker og kolleger et genom-skala RNAi skærmen for at identificere, at NF1 tab medierer resistens over for RAF og MEK-inhibitorer gennem vedvarende MAPK-aktivering 8. Disse resultater blev fundet for at være klinisk relevant, da tab af funktion mutationer i NF1 blev observeret i BRAF -mutant tumorceller, der er uløseligt resistente over for RAF hæmning og i melanomtumorer resistente over for vemurafenib aktivering 8. På trods af succesen af denne tilgang, mange klinisk relevante mål er ofte ikke identificeres, formodentlig på grund af tabet af funktion forspænding af denne fremgangsmåde.
I modsætning mindre forudindtaget værktøj til præklinisk opdagelse af resistensmekanismer, involverer dannelse af resistente cellelinier ved længerevarende eksponering for forbindelsen af interesse sammen med NGS-baserede genomisk eller transkriptomisk profilering. Denne tilgang er blevet succesfuldt implementeret af flere grupper for at identificere spontantilbagevendende enkelt nukleotid varianter eller ekspressionsvektorer ændringer, der muliggør resistens 5,9,10. For eksempel blev et tilbagevendende F876L mutation i AR nylig opdaget hos resistente kloner in vitro 3-5 og xenograft-tumorer in vivo 5 forud for identifikation af denne mutation i klinikken 4. For ganske nylig, Bhang og kolleger (2015) 11 brugte ClonTracer i to klinisk relevante modeller til at vise, at størstedelen af resistente kloner, der opstår ved langvarig stof eksponering var en del af en allerede eksisterende delpopulation tyder på, at mest funktionelt relevante mutationer er sandsynligvis allerede eksisterende der bliver udvalgt til under selektion 11.
I modsætning til den genomiske profilering af tumorer diskuteret tidligere, er denne fremgangsmåde fordelene ved mindre heterogenitet som "homogene" resistente kloner anvendes til analyse lette mere nøjagtig genetisk dissektion af potentielle chauffører. Furthermmalm, spændende, ud over mulighederne for at afdække resistensmekanismer, denne metode kan også anvendes til at identificere de cellulære virkningsmekanismer og mål af bioaktive små molekyler, som denne information er ukendt 10. I betragtning af de klare fordele og de mange anvendelser af denne fremgangsmåde, her præsenterer vi en protokol beskriver vellykket implementering af en sådan prækliniske skærm for at maksimere potentialet for klinisk betydningsfulde opdagelser.
Protocol
1. Vurdering af GI 50 for forbindelse (r) af interesse
- Generer vækstkurve (er) for cellelinjer af interesse at vurdere den passende seeding tæthed. Plotte celletallet på forskellige tidspunkter efter såning (dag 2, 4, 6 og 8) i forhold til dag 0. Dette vil give en relativ vækst i cellelinie af interesse og bør bruges til at vurdere den indledende seeding sådan tæthed, at konfluens ikke nås i 96-brønds plader inden for 7 dage.
- Når vækstkurver er blevet bestemt, at frø passende antal celler i ikke-gennemsigtige, klare nederste plader med 96 brønde i 100 pi cellemedier vurdere GI 50. Seed antallet af celler baseret på cellelinien anvendes og bestemmes i 1.1. Typisk frø 3x10 3 celler for hurtigt voksende cellelinjer med en fordobling tid på ~ 24 timer, f.eks., HCT116.
- Forbered en assay plade (dag-1). For assaypladen, frø celler ved ønskede densitet i 100 pi dyrkningsmedier In brønde skraverede i blå (Figur 1). Wells fremhævet i hvidt kun indeholde medier.
- Forbered en kontrol plade (dag-1). For styrepladen, frø samme tæthed af celler som i trin 1.2.1 i 100 pi dyrkningsmedier i en separat plade med 96 brønde. Denne "dag 0" læsning vil bidrage til at fortolke den cytostatiske / cytotoksiske karakter af forbindelserne, der analyseres (figur 2).
- Den næste dag (dag 0), læse styrepladen. Ækvilibrere luminescerende cellelevedygtighed reagens (CellTiter-Glo substrat blandet med puffer i overensstemmelse med producentens anvisninger) til stuetemperatur og blandes forsigtigt ved at vende indholdet til opnåelse af en homogen opløsning. Der tilsættes 80 pi reagens til 100 pi celle / mediemix og ryst indholdet i 30 minutter for at inducere cellelyse.
- Optag luminescens med et luminometer indstillet til en eksponering på 0,1-1,0 sek og afsløring bølgelængde på 560 nm.
- Tilføj testforbindelser (forbindelseraf interesse) til assayplader (dag 0). Lav en 1: 4 seriefortynding af forbindelserne i DMSO ved 200x slutkoncentration for i alt 10 koncentrationer (9 fortyndinger indeholdende forbindelse og en DMSO kun forbindelse plade). Som et første udgangspunkt, tilstræbe en 200x laveste dosis af 0,03 uM og en top dosis på 2.000 uM (endelig volumen 200 ul).
- Tilføj serielt fortyndede forbindelser til medium til at gøre en forbindelse-medium mix på 10x endelig koncentration (slutvolumen 100 pi, mellemliggende plade). Opbevar forbindelsen plade ved -20 ° C til brug på dag 3 af assayet. Tilsæt 10 pi af forbindelse-medium blanding til celler in triplo, således at den højeste dosis er 10 uM (f.eks., Række B, C og D, dag 0) (Figur 1). Inkubér assayplader i 3 dage ved 37 ° C. Kassér mellemplade (r) efter brug.
- På dag 3, udarbejde en 400 pi 1x sammensatte-medium mix ved hjælp af sammensatte plader udarbejdet i 1.4. Vend assayplader at fjerne medier og dup tør på autoclaved papirhåndklæder 2-3x at fjerne resterende medier. Tilføj forbindelse / media (100 pi / brønd) til brønde med blå skygge, og der tilsættes 100 pi medier til perimeter brønde for at forhindre fordampning (figur 1). Re-inkubere assaypladerne ved 37 ° C i yderligere 3 dage.
- På dag 6, vurdere relative antal af levedygtige celler ved at udføre en luminescens aflæsning som beskrevet i trin 1.3.
- Brug dag 0 læsning at vurdere den statiske / toksisk karakter forbindelser. Giftige stoffer inducere apoptose mens cytostatika inducerer cellecyklusstandsning. Hvis forbindelsen er giftigt (dag 6 læsning er under dag 0 læsning), overveje at vælge GI 50, og GI 50 x 5 koncentrationer for modstand analyser. Men hvis forbindelsen inducerer stasis (lig med eller højere end d0 læsning), overveje GI 100 og GI 100 x5 for modstand analyser (figur 2).
2. Opsætning Drug Resistance Analyser
- Hvis arbejdet witha cytostatiske middel, frø celler ved et sammenløb på 30-40% i 150 mm 2 vævskulturskåle (volumen = 30 ml) i modstanden assay. Hvis du arbejder med et giftigt stof, frø på en 70-80% sammenløb.
- For cellelinjer, som huser en intakt mismatch repair (MMR) mekanisme, inkuberes celler fra trin 2.1 O / N ved 37 ° C med kræftfremkaldende N-ethyl-N-nitrosourea (ENU). Behandl celler med 30 pi af en stamopløsning af 50 mg / ml ENU (slutkoncentration 50 ug / ml) for at forbedre genomisk ustabilitet. For cellelinjer, der har en defekt MMR (tabel 2 og 3), ikke kan være nødvendigt behandling med ENU eller andre kræftfremkaldende stoffer.
- For andre cellelinjer, fastlægge MMR-mangel ved NIC kriterier ved hjælp mikrosatellit ustabilitet 12, eller på grundlag af offentliggjorte karakterisering ved hjælp mikrosatellitmarkører ustabilitet assays eller genomisk / epigenomic profilering af MMR-gener 13-15.
- Treat celler med testforbindelsen (r)interesse på koncentrationen bestemt i trin 1.8. For meget giftige forbindelser, der forårsager celledød i en typisk tre-dages levedygtighed assay 10, starte med en lav dosis behandling (dvs. GI 50) og gradvist øge koncentrationen (multipla af GI 50) forbindelse hver 2-3 uger, indtil robust observeres modstand. Genopbygge medier og sammensatte hver 3 d.
- Når valget er igangsat, ændre medier / forbindelse mix hver 3-4 dage, indtil resistente kloner dukke. Resistens ved definition opstår, når behandlede celler udviser større vækst / levedygtighed under lægemiddelbehandling forhold til akut behandling af DMSO-behandlede kontrolceller.
3. Isolering encellede Kloner
- Undersøg dyrkningsskål under anvendelse af fasekontrastmikroskopi (forstørrelse 40x) for levedygtige klynger af celler.
- Mark tilfredsstillende kloner i bunden af skålen med en markeringspen. Pick kloner, der er af gennemsnitlig størrelse (større kolonier kanstammer fra flere celler) og godt isoleret fra andre kolonier. Pick kloner ved anvendelse af en af to fremgangsmåder, der er beskrevet i trin 3.3.
- Tilgang 1: Ved hjælp af en Pipettor (figur 3)
- Fjern vækstmedier og skyl med 1x PBS for at fjerne eventuelle flydende celler.
- Brug sorte mærker som vejledning til "plukke" kloner med pipette spids (knyttet til pipette, P200 helst).
- Overfør kloner i 48-brønds plader med 200 pi frisk medium (med halv forbindelse fusions muliggøre optimal genvinding af celler).
- Tillad celler til at inddrive i 2-3 dage, før du tilføjer 200 pi frisk medier / ideel sammensatte koncentration.
- Fortsæt med at ændre medierne / forbindelse hver 3-4 dage, og fortsætte med at udvide kloner.
- Tilgang 2: Brug Kloning diske (figur 3)
- Mærk kloner som beskrevet i trin 3.2.
- Place 3 mm kloning skiver i en 10 cm vævskulturskål indeholdende 5 ml 0,25% trypsin-EDTA i 2 minutter.
- Aspirer medier fra skål indeholdende resistente kloner og overtrække kloner med trypsin gennemvædet klonings- diske med sterile engangs pincet.
- Efterlad i 1-2 minutter, afhængigt af hvor let kloner løft pladerne, i en 37 ° C inkubator.
- Saml kloning diske med steril pincet og overføres til 48-brøndsplader med 200 pi frisk medium og halvdelen koncentration af forbindelse.
- Pipette op og ned forsigtigt for at løsne cellerne fra kloning diske og inkuberes O / N ved 37 ° C (lad kloning diske i brønde).
- Den næste morgen, fjerne kloning diske fra 48 brønde og opfyld brønde med 200 pi frisk media / forbindelse (halv ideelle sammensatte koncentration).
- Tre dage senere, genopbygge medier med den ideelle koncentration af forbindelse.
- Fortsæt med at ændre medierne / forbindelse hver 3-4 dage, og fortsætte med at udvide kloner.
4. Vurdering Grad af Resistance af isolerede kloner
- Når 10-20 kolonier ekspanderes, generere GI 50 kurver som beskrevet i trin 1 for at vurdere graden af resistens.
- Altid omfatte kontrol befolkninger behandlet med DMSO under udvælgelsesprocessen. Det er meget sandsynligt, at spektret af resistens vil være store (nogle viser delvis mens andre viser fuld modstand). Saml et par kloner fra hver af disse klasser som mekanismen for resistens kan variere mellem de to grupper.
5. Næste generation sekventering
- Spin ned 2 millioner celler (kontrol og resistente kloner) (500 x g i 5 min) i 15 ml koniske hætteglas for både gDNA og RNA samling (derfor 2 x 2 millioner).
- Vask to gange med 1x PBS og fryse træpiller i -80 ° C indtil klar til isolation.
- Brug et kommercielt ekstraktionskit at isolere RNA eller gDNA ifølge producentens protokol.
- Indsend prøver til næste generation sekventeringved hjælp af leverandørens protokol 10.
6. Bioinformatik analyse af prøver (hel-exome sekventering)
- Preprocess sekvens data i henhold til en bedste praksis-DNA-seq rørledning 16.
- Kort alle læser til at henvise til humane genom GRCh37 hjælp BWA 17. Konverter ukomprimerede SAM formaterede alignments til komprimeret BAM-format med Samtools 18. Sorter alignments ved koordinere med Samtools. Tilføj læste grupper ved hjælp af Picard. (For specifik BWA, Samtools og Picard-kommandoer, se supplerende Tekst 1, linje 1-4)
- Markér alle dubletter læser ved hjælp af MarkDuplicates kommando fra Picard værktøjssæt 19. Indeks denne fil med Samtools. (Supplerende Tekst 1, linje 5-6)
- For at minimere forskudte baser på tværs af alle læser, justere læser lokalt på regioner huser små indsættelser eller sletninger ved hjælp af et Indel realigner 20. (Supplerende Tekst 1, linje 7-8)
- For yderligere at forbedre accuracy af variant kald, empirisk kalibrere basis kvalitetsresultater hjælp en base kvalitet score rekalibrering værktøj. Den kalibreringsværktøj basen kvalitet bør ikke kun korrekt indledende kvalitetsresultat, men også tage hensyn samvariation af flere funktioner, herunder læst gruppe, maskine cyklus, basen position og dinukleotid kontekst (tidligere + nuværende baser). Generer kalibreres BAM med Picard PrintReads. (For specifikke kommandoer til dette trin, se supplerende tekst 1, linie 9-10)
- Gentag trin 6.1.1 gennem 6.1.4 (supplerende tekst 1, linie 1-10) for hver prøve sekventeret.
- Identificer enkelt nukleotid variation (SNV) i hver klon ved hjælp af en parret variant ringer tool19, 21-23. For hver klon sekventeret, køre parret variant telefonerer via forældrenes klon som matchede "normale". (Supplerende Tekst 1, linje 11)
- Filter tilbagevendende, varianter af høj kvalitet og forberede kommentering med en variant anmærkning værktøj 24. Deprioritize variants ikke fælles for alle resistente kloner. (Se R script i supplerende tekst 2)
- Anmærke varianter med en anmærkning værktøj 25, 26. Mange variant annoteringsværktøjer har en ledsagende web-app giver data, der skal uploades og behandles af en ekstern server.
- Brug en funktionel effekt forudsigelse værktøj 27-29 at prioritere de varianter forudsagt for at have høj funktionel effekt. Ligesom variant anmærkning, er tilgængelige for funktionel effekt forudsigelse via en web-grænseflade flere værktøjer.
Representative Results
For at maksimere potentialet for at opdage centrale funktionelle førere af modstand, skal du vælge en enkelt celle kloner for ekspansion, fænotypisk test og sekventering. Som illustreret i figur 4A, HCT116-celler behandlet i en længere periode med cytotoksisk forbindelse # 1 førte til den spontane fremkomst af resistente kloner, som fortsatte med at vokse under behandlingen (stiplede sorte cirkler). Disse kloner blev plukket hjælp tilgang # 1 fremhævet i Figur 3 og efterfølgende udvides til fænotypisk analyse. Som vist i figur 4B, resistente kloner 1-3 viste alle signifikant resistens over for Compound # 1 og dens nære analoge forbindelse # 2 (større levedygtighed / vækst), mens alle kloner udviste følsomhed over for en uafhængig cytotoksisk forbindelse VELCADE. Efter bekræftelse af fænotypisk resistens, blev gDNA isoleret og forelægges til hel-exome sekventering analyse. Bioinformatiske værktøjer blev anvendt til at indsnævre ind på de strukturelle varianter, derer 1) tilbagevendende og 2) har potentiale for funktionelle effekt (figur 5A). Strukturelle varianter, der mødte disse to kriterier blev bekræftet af en uafhængig sekventering værktøj. Som illustreret i figur 5B, en heterozygot missense mutation, blev identificeret ved anvendelse af hele exome sekventering blev bekræftet under anvendelse af Sanger-sekventering metoden (øvre panel, WT-sekvens; nedre panel, mutant sekvens). Efter sekvensbekræftelse den parentale cellelinje oprindeligt brugt til modstanden assay blev gensplejset til at udtrykke mutant cDNA til funktionelt bekræfte rolle mutationen. Som illustreret i figur 6, mens overekspression af WT cDNA undlod at bibringe resistens, tvungen ekspression af mutant cDNA signifikant tillagt fænotypisk resistens til forbindelse # 1, hvilket bekræfter den funktionelle rolle af denne strukturelle variation som drivkraft for resistens. Alle reagenser anvendt til dette eksperiment er angivet i tabel 1 Trong>.
Figur 1. Layout af assay og kontrol plader. Blå skygge, sammensatte behandling brønde. Hvid skygge, kun medium. Forbindelser seriefortyndes 1: 4 og administreres i tre eksemplarer (BD eller EG). 2 forbindelser kan anvendes per plade.
Figur 2. Repræsentative levedygtighed kurver. Røde stiplede linie repræsenterer dag 0 læsning. X-aksen angiver stigende doser af forbindelsen til højre og y-aksen repræsenterer levedygtighed i forhold til DMSO kontrolbrønde. GI 100 = dosis, der anvendes til at opnå 100% vækstinhibering; GI 50 = dosis, der anvendes til at nedsætte levedygtigheden til 50% af DMSO-kontrol.
_upload / 52879 / 52879fig3.jpg "/>
Figur 3. To metoder til plukning resistente kloner for ekspansion. Approach 1- brug pipette til at samle op og overføre veldefinerede kloner til 48 brønde. Tilgang 2 brug trypsin-gennemblødt kloning diske at løfte kloner og overføre til 48 brønde.
Figur 4. Bekræftelse af resistens opnås for HCT116 kloner til forbindelse # 1 in vitro. (A) Compound # 1-resistente kloner HCT116 opstået som følge af kontinuerlig tre ugers selektion. (B) Levedygtighed af kontrol- og resistente kloner blev testet efter 72 timer behandling med forskellige forbindelser. Forbindelse # 2 er en tæt analog af forbindelse # 1. Velcade blev anvendt som en kontrol cytotoksisk middel. Data er vist som gennemsnit + standardafvigelse af tre biologiske replikater.
Figur 5. Identifikation af en unik, tilbagevendende mutation (single nucleotide varianter, SNVs) i gen-A i forbindelse # 1-resistente kloner. HCT116 (A) Work flow for at identificere SNVs stede i alle resistente kloner og forudsiges at have en høj funktionel effekt af MutationAssessor. (B) Bekræftelse af mutation i genet A af Sanger-sekventering.
Figur 6. Re-ekspressionen af muterede gen A tillagt resistens over for sammensatte # 1 in vitro. Levedygtighed de konstruerede HCT116 cellelinier blev testet efter 72 timer behandling med forbindelse # 1. HCT116-WT eller mutante cellelinier der stabilt udtrykker WT eller mutant cDNA'er af gen A, henholdsvis. Data er vist som gennemsnit + standardafvigelse of tre biologiske gentagelser.
| Prøve navn | Aminosyre | Primært væv | Zygositet | |
| C-33-A | p.E768fs * 44 | livmoderhalsen | Heterozygot | |
| C-33-A | p.S860 * | livmoderhalsen | Heterozygot | |
| CML-T1 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| CP66-MEL | p.C822F | hud | Heterozygot | |
| CTV-1 | p.0? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| EFO-27 | p.Q130fs * 2 | æggestok | Heterozygot | |
| EFO-27 | s.? | æggestok | Heterozygot | |
| p.E467K | bryst | Heterozygot | ||
| J-RT3-T3-5 | p.R711 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| LNCaP | s.? | prostata | Homozygot | |
| LoVo | s.? | tyktarmen | Homozygot | |
| MOLT-13 | p.R711 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| Nalm-6 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NCI-H630 | p.R680 * | tyktarmen | Heterozygot | |
| Skut-1 | p.L787fs * 11 | endometrium | Homozygot | |
| Skut-1B | pL787fs * 11 | endometrium | Homozygot | |
| SUP-T1 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
Tabel 1. MSH2 -mutated cellelinier. Cellelinje (prøve navn), aminosyresubstitution er slægt oprindelse og zygositet angivet.
| Prøve navn | Aminosyre | Primært væv | Zygositet | |
| CCRF-CEM | p.R100 * | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Heterozygot | |
| CCRF-CEM | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Heterozygot | |
| CW-2 | p.Y130fs * 6 | tyktarmen | Homozygot | |
| DU-145 | s.? prostata | Homozygot | ||
| GR-ST | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| HCT-116 | p.S252 * | tyktarmen | Homozygot | |
| IGROV-1 | p.S505fs * 3 | æggestok | Homozygot | |
| MN-60 | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| NCI-SNU-1 | p.R226 * | mave | Homozygot | |
| P30-OHK | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue | Homozygot | |
| PR-Mel | s.? | hud | Homozygot | |
| REH | s.? | haematopoietic_and_lymphoid_tissue Homozygot | ||
| SK-OV-3 | p.0? | æggestok | Homozygot | |
| SNU-1544 | p.S2L | tyktarmen | Heterozygot | |
| SNU-1746 | p.E523K | tyktarmen | Homozygot | |
| SNU-324 | p.C233R | bugspytkirtel | Heterozygot | |
| SNU-324 | p.V384D | bugspytkirtel | Heterozygot | |
| SNU-478 | p.V384D | bugspytkirtel | Heterozygot | |
Tabel 2. MLH1 -mutated cellelinier. Cellelinje (prøve navn), aminosyresubstitution er slægt oprindelse og zygositet angivet.
Discussion
Udvælgelse af cellelinje (r): Karakterisering af genetiske tilstand og genomisk ustabilitet
Utvivlsomt, den mest kritiske faktor i en vellykket afdække klinisk relevante resistensmekanismer er den første udvælgelse cellelinje. To faktorer bør overvejes. Først til formål at markere cellelinje (e) i samme afstamning / undertype huser de definerende genetiske træk af sygdommen (f.eks., BRAF V600E i melanom). Forhør af offentligt tilgængelige transkriptom og mutation data for begge cellelinier 30-32 og primær / metastase tumorer for en række indikationer 33,34 vil lette udvælgelsesprocessen. Selvom identifikation af cellelinier med klinisk relevante genetiske ændringer er ideel, i nogle tilfælde kan dette ikke være muligt på grund af mangel på tilgængelige cellelinjer eller muligt på grund af faktorer såsom vanskeligheder og længden af screeningsprocessen.
35. Baseret på COSMIC database, der findes flere kandidat-cellelinier med mangler i en af to hyppigt muterede MMR-gener, MSH2 eller MLH1 (tabel 2 og 3). Alternativt, hvis cellelinier af interesse ikke findes forsynet defekter i MMR, akut behandling med fysiske eller DNA reaktive kemiske mutagener såsom alkyleringsmidlet N-ethyl-N -nitrosourea (ENU) kan anvendes til at øge genomisk ustabilitet. Selv om begge metoder kan betydeligt findesHorten tid til at nå resistente kloner og opfølgning sekventering, bør strenge funktionel test udføres på kandidatgener som et større antal ikke-funktionelt, vil sandsynligvis dukke passager mutationer. SNVs kan være rang beordret til at maksimere chancerne for at identificere funktionelt relevante mutationer. For det første, at vælge disse mutationer, der er tilbagevendende i uafhængige kloner vil øge sandsynligheden disse mutationer er førere af resistens. I tilfælde tilbagevendende mutationer er ikke identificeret, fokuserer på SNVs der passer virkningsmekanismen af lægemidlet (f.eks målet lægemiddel eller en kendt nedstrømseffektor af målet lægemiddel) kan være meningsfuld. I sidste ende, guldstandarden er altid eksperimenterende evaluering af resistens-aktivitet kandidatlandene SNVs ved ektopisk cDNA udtryk i narkotikarelaterede følsomme parentale celler.
DNA vs RNA-sekventering
Når de resistente kloner er blevet frembragt, DNA og / eller RNAkan sekventeres afhængigt af behovet. DNA-sekventering, enten exome eller hel-genom sekventering, vil gøre det muligt at identificere germline og somatiske varianter, såsom SNP'er, indels og eksemplarnummer varianter. Hvorimod mere omkostningseffektiv venlige exome sekventering fokuserer på generering læser fra kendte kodende regioner, vil hel-genom sekventering generere sekventering data for hele genomet, som kan bidrage til at identificere mutationer i ikke-kodende elementer, såsom forstærkere eller miRNA 36. Men da genekspression data ikke måles under DNA-sekventering, er det vanskeligt at forudsige, hvilken mutation (s) vil sandsynligvis være en funktionel driver. I denne henseende sekventering af RNA, men dyrere, tilbyder denne fordel. Den omstændighed, at mutation kald kun udføres på udtrykte RNA-arter øger sandsynligheden for, at mutationen af interesse kan være en funktionel driver. Ud over at tillade en mere fokuseret undersøgelse af mutationer for opfølgning funktionel test, RNA-sekventering ogsågiver den fordel at kunne identificere genekspression ombygninger, alternativ splejsning og nye kimære RNA arter, herunder genfusioner, der også kan tjene som potente førere af resistens.
Bioinformatik rørledning
Eksempel kommandoer leveres til illustration formål, men mere detaljeret dokumentation og tutorials er tilgængelige fra de overordnede Institut 16 og bør læses grundigt, før du begynder NGS analyse. Følgende kommandoer er designet til en UNIX shell miljø på et system, hvor alle værktøjer og referencedata er pre-installeret. Disse kommandoer også antage FASTQ filer indeholder parret ende sekvens læser fra to prøver, der hedder "parental" og "resistente", er modtaget fra leverandøren, og placeres i "data" mappe. I de fleste tilfælde er disse kommandoer bør tilpasses eller optimeret til en specifik anvendelse ved hjælp af ekstra kommandolinjen argmenter (fx tilføje "-t 8" til BWA kommandoen tillader flertrådede drift på 8 CPU-kerner). Læs grupper (der tildeler linjeføringer for biologiske prøver), må ofte føjes til BAM filer, selvom der kun er én prøve pr bam-fil, for at opfylde krav til visse værktøjer filformat. Læs gruppe parametre RGID, RGSM, RGPL, RGPU og RGLB kan være vilkårlige strenge beskriver prøven navn, sekventering platform og bibliotek strategi.
In vitro vs in vivo-assays
Selv om flere resistensmekanismer identificeret af in vitro-selektion er blevet verificeret til at være klinisk relevant, findes der en mulighed for, at de mekanismer, der ikke kan tjene som relevante eller fremherskende mekanismer klinisk resistens. En årsag til dette kan omfatte en væsentlig rolle for mikro-miljø i kørsel resistens over for terapi, en komponent, der er blottet i forsøgsprotokollen / opsætning discussed hidtil. Faktisk har flere undersøgelser vist, at anti-cancermidler, der er i stand til at dræbe tumorceller gøres ineffektive, når tumorcellerne dyrkes i nærværelse af stromaceller indebærer medfødte resistensmekanismer, som følger af stroma 37,38. At identificere sådanne stroma-induceret erhvervede resistensmekanismer, kan man overveje at udføre in vitro-co-kultur eller in vivo tumor modstand analyser. Da den tidligere assay er meget komplekse, har mange tyet til generering lægemiddelresistente tumorxenoplantater at løse potentielle rolle af stroma i køremodstanden. Sådanne undersøgelser har afsløret både identiske 5 og unikke 39 resistensmekanismer i forhold til in vitro-selektion, hvilket indebærer, at stroma faktisk kan spille en rolle i sidstnævnte. Dog skal man være opmærksom på, hvor lang tid det kan tage at generere sådanne resistente tumorer og kompleksiteten af opfølgningen genomisk analyse-complexities på grund af intratumoral molekylær og cellulær heterogenitet.
Target identifikation
Ud over at afdække lægemiddelresistensmekanismer, kan denne NGS-baserede genomiske profilering tilgang også anvendes til at identificere cellulære mål af kemiske prober. Historisk set har flere uvildige metoder blevet anvendt til at identificere de cellulære virkningsmekanismer og mål med lav molekylvægt kemikalier med biologiske aktiviteter, herunder affinitetsoprensning kombineret med kvantitative proteomics, gær genomiske metoder, RNAi screening, og beregningsmæssige inferens tilgange 40. Som en udvidelse til belysning af lægemiddel-resistensmekanismer hjælp NGS-baserede genomisk eller transkriptom profilering af fænotypisk resistente cellepopulationer, identifikation af unikke tilbagevendende enkelt nukleotid variationer (SNVs) eller udtryk ændringer, der muliggør modstand kan tilbyde indsigt i funktionelle cellulære mål af forbindelser. Thans er baseret på idéen om, at en delmængde af resistensmekanismer observerede kan indebære tilbagevendende mutationer i gener, der koder de direkte mål for lille molekyle protein. For nylig, flere rapporter valideret nytten af den fremgangsmåde, især ved at kombinere med andre tilgange, herunder storstilet cancercellelinje følsomhed profilering, at afsløre de cellulære mål af små-molekyle sonder 9,10.
Disclosures
Offentliggørelse gebyrer for denne artikel, er betalt af H3 biomedicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
| Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
| Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
| RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
| Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
| GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
| MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
| Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
| MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |
References
- Sellers, W. R. A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy. Cell. 147 (1), 26-31 (2011).
- Housman, G., et al. Drug resistance in cancer: an overview. Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).
- Balbas, M. D., et al. Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design. Elife. 2, e00499 (2013).
- Joseph, J. D., et al. A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509. Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).
- Korpal, M., et al. An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide). Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).
- Lawrence, M. S., et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes. Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Whittaker, S. R., et al. A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition. Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).
- Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance. Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).
- Adams, D. J., et al. NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes. ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).
- Bhang, H. E., et al. Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding. Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).
- Boland, C. R., et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).
- Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein. Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).
- Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes. Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).
- Ahmed, D., et al. Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines. Oncogenesis. 2, e71 (2013).
- GATK. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/gatk/guide (2015).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Picard. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: http://broadinstitute.github.io/picard (2015).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).
- Cibulskis, K., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
- Oncotator. , The Broad Institute. Cambridge, Massachusetts, USA. Available from: https://www.broadinstitute.org/oncotator (2015).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly. 6 (2), 80-92 (2012).
- Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Ng, P. C., Henikoff, S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).
- Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2. Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Abaan, O. D., et al. The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology. Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).
- Forbes, S., et al. Cosmic 2005. Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).
- Shah, S. P., et al. The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers. Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).
- Behjati, S., et al. Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma. Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).
- de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance. J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).
- Kotani, A., et al. A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells. Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).
- Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase. Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery. Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).
