Protocol
Etik erklæring: Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret i retningslinjerne i vejledningen for brug og pleje af forsøgsdyr: Ottende Edition fra Institute for Laboratory Animal Research (ma-, 2011) og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Michigan (PRO0001553).
1. Mus Kirurgiske Procedurer
BEMÆRK: Brug 8-10 uger gamle C57BL / 6 mus. Andre aldre, baggrunde og stammer af mus kan også anvendes til at teste forskellige betingelser eller genetiske sammensætning. For tenotomy del af proceduren, opretholde sterile betingelser ved anvendelse af ansigtsmaske, hår motorhjelm, og sterilt kjole, handsker og instrumenter. Kirurgiske steder bør sterilt fremstillet med povidon-iod og sterilt drapering. Undgå hypotermi ved anvendelse af en veterinær varmepude og opvarmning genoplivning løsninger til 37 ° C før adminition.
- Anesthetize mus under anvendelse af 2,5% isofluran inhaleret. Brug en næsekegle at forlade randen og Hind-lemmer let tilgængelige. Juster hastigheden af isofluran administration for at opretholde passende respirationsfrekvens og farvning af slimhinder og sikre anæstesi ved at kontrollere muskeltonus, tå knibe, og hornhinde refleks. Anvend kedelig oftalmologiske salve til musens øjne til at forhindre tør øjenskader under proceduren. Oprethold tilstrækkelig kropstemperatur ved hjælp af en veterinær varmepude eller varmt vand cirkulationspumpe under kirurgiske område.
- Administrere buprenorphin, 0,1 mg / kg, subkutant umiddelbart før kirurgi for analgesi.
- Nøje barbere det kirurgiske sted til venstre bagpote ved hjælp trimming fra hælen til knæet.
- Nøje barbere dorsum af musen, begyndende i rygsøjlen og strækker det barberede område til venstre for den dorsale midtlinie, rydde et område på mindst 2 cm x 3 cm til at rumme forbrændingsskade.
- Forbered operationsstedet, herunder bagpoten til knæet ved hjælp af 3 skiftende povidon-jod scrubs.
- Udfør en langsgående indsnit langs den mediale side af den venstre akillessenen. Forlæng snittet så akillessenen kan nemt visualiseres; ca. 0,5 cm.
- Udfør en Achilles tenotomy med skarp dissektion af senen ved midtpunktet med skarpe væv saks. Sæt en kniv af væv saks i vævet flyet under senen og dissekere langs planet, indtil klingen er i senen midtpunktet. Luk scissor knive til at bryde senen kraftigt.
BEMÆRK: Sørg for inddragelse af alle posteriore sener herunder Gastrocnemius, Soleus og plantaris sener. - Opnå hæmostase ved at anvende pres med steril gaze (der bør være minimal blødning) og luk hudincision med en 5-0 Vicryl søm.
- Udfør dorsale partiel tykkelse brænde den med en aluminium blok vejer 35 g med omtrentlige measurements 2 cm x 2 cm x 3 cm opvarmes til 60 ° C i et vandbad påført det barberede dorsum af musen til 17 sek.
BEMÆRK: Opnå den relevante brænde dybde ved at hvile blokken oven på den bedøvede mus, der sikrer, at hele overfladearealet af blokken er i kontakt med musen imidlertid undgå at anvende yderligere tryk til blokken, dvs. tillade tyngdekraften at være den eneste kraft der holder blokken på plads. En tynd plast håndtag fastgjort til den ene side af blokken er bekvemt for manipulation, stabilisering og genfinding fra det varme vandbad. Dette vil skabe en ca. 30% total legemsoverflade brænde i en 8-10 uger gamle C57BL / 6 mus. Denne kontakt Brænd blev valgt frem for andre metoder (flamme eller skolde brænde) på grund af ensartetheden af brænde dybde over såret og reproducerbarheden mellem dyr. - Tør brænde site med gaze og anvende en Tegaderm forbinding.
- Administrere opvarmet genoplivning væsker: Ringerlaktat løsning 1 mlintraperitoneal injektion og 0,5 ml subkutan injektion. Denne ene gang administration af genoplivning er tilstrækkelig til nyttiggørelse fra forbrændinger og tenotomy.
BEMÆRK: Du må ikke vende tilbage bedøvede mus til boliger bure med andre mus, hus individuelt i rene bure under overvågning, indtil mus fuldt tilbagebetalt. Typisk genvinding sker inden 1-6 timer. Burn sites generelt heler inden for 2-4 uger, og er sjældent kompliceres af sårinfektion, hvis de holdes i rene boliger miljøer. - Administrere Buprenorphin 0,1 mg / kg subkutan injektion hver 12 timer i 3 dage efter proceduren. Overvåg HO vækst med serielle μCT scanninger med passende mellemrum. Ektopisk knoglevækst er først tydelig omkring 3 uger efter op af μCT.
BEMÆRK: Flertallet af HO udvikling er komplet med 9 uger efter op. Vi har ikke observeret en forskel i HO volumen eller placering med gentagen μCT scanninger hver anden uge i 15 uger sammenlignet med en enkelt endepunkt μCT scanne ved 15 uger.Ved afslutningen af forsøgene, aflive alle mus med CO2 inhalation efter institutionelle retningslinier og verificere døden med cervikal dislokation efter 10 min.
2. μCT Køb og analyse
- Fastgør bedøvet musen på scannerpladen i liggende stilling. Tape bagbenene sikkert til sengen for at forhindre vejrtrækning bevægelse artefakt. Omfatter luft, vand og hydroxyapatit indeholder fantom under musen til billedet kalibrering.
- Åbn Bone Analysis-softwaren og definere et område af interesse (ROI), der omfatter begge bagben fra hofteleddet proximalt til spidsen af den bagpote distalt. Få et billede ved hjælp af følgende parametre:. 80 kV, 500 pA og 1.300 ms eksponering, 48 um voxel størrelse 14,15
- Kalibrer billedet til Hounsfield enheder (HU) ved at trække en ROI i hver af de tre fantom kamre og indtaste den gennemsnitlige tæthed i de relevante felter isoftwaren.
- Brug af "grabber" værktøj i softwaren, re-orientere billedet, så skinnebenet af den venstre bagben er parallel langs Z-aksen for at tillade den klareste anatomiske udsigt til afgrænsning af ortotopisk kortikale knogle strukturer og HO.
- Begyndende ved knæet, skal du rulle distalt gennem billedudsnit indtil HO er stødt. Bruger den manuelle spline værktøjet, foretage en ROI omkring ektopisk knogledannelse på hver 5 th skive fortsætter distalt gennem poten eller indtil HO er blevet overgået. Brug ekstrapolere værktøj til at udvide og sy ROIs sammen til en ROI, der indeholder alle de HO.
- Lav en 3D ROI og vælg analysen menuen. Beregn knoglevolumen ved at indstille den nedre og øvre tærskelværdier, der bedst viser knoglen vinduet. Brug de samme faste tærskelværdier for alle scanninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I nærværende undersøgelse er den protokol, der er beskrevet for den tidligere offentliggjorte musemodel af traumer / brænde induceret HO. 14-17 Dette indebærer oprettelsen af samtidige lokaliseret bevægeapparatet skade med en Achilles tenotomy og global inflammatorisk fornærmelse med en delvis tykkelse brænde skade. Dette resulterer i pålidelig dannelse af reaktive knogle på tenotomy hjemmeside, som kan følges med seriel billeddannelse. Til dato har alle mus (mere end 50), der har lidt både Achilles tenotomy og brænde skade udviklet en målbar mængde HO på tenotomy site. For at kvantificere dannelse af ektopisk knogle, er en kalibreret billede μCT protokol, der bruges på hver ønskede tidspunkt-punkt. Tilføjelsen af en brænde skade i kombination med Achilles tenotomy har vist sig at være nøglen i fremkaldelse af betydelig HO. Med begge skader sker samtidigt er der en betydelig stigning i mængden af ektopisk knogle, der dannes i tenotomy stedet sammenlignet med AcHilles tenotomy alene (figur 1). 17
Figur 1. HO udvikling efter Achilles tenotomy med eller uden samtidig forbrændinger. Alle mus modtog en Achilles tenotomy af venstre bagben, halvdelen af musene fik også en 30% TBSA partiel tykkelse forbrændinger på dorsum. μCT scanninger blev afsluttet på 5 dage og 3, 5, 7, 9, og 15 uger efter skade. (A). Repræsentative 3D rekonstruktioner vises med ortotopisk knogle hvide og HO farvet blå. Røde cirkler angiver niduses HO. Ektopisk knogle udvikler sig i det område, som tenotomy samt steder distale og proximale til skadestedet i benet. Svarende til HO set clnically, kan denne reaktive knogle være sammenhængende med skelet knogle eller udvikle eksternt i blødt væv. (B). Kvantificering af HO var comafsluttet med et kalibreret billede protokol og vist i grafen. HO har varet over 15 uger dog udvikling plateauer mellem 9-15 uger med den største vækst hastighed typisk ses mellem 5-9 uger. Data er middel +/- standardafvigelse, n = 4 pr gruppe, Students t-test, * P <0,05 (Bemærk, at dette tidligere offentliggøres data, modificeret fra 17). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
