Protocol
Dichiarazione etica: Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le buone pratiche animale come definito nelle linee guida fornite nella Guida per l'uso e la cura di animali da laboratorio: Ottava Edizione del Institute for Research Laboratory Animal (ILAR, 2011) e sono stati approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale dell'Università del Michigan (PRO0001553).
1. mouse Procedure chirurgiche
NOTA: Usare 8-10 settimane vecchio C57BL / 6 topi. Altre epoche, sfondi e ceppi di topi possono anche essere utilizzati per testare le condizioni diverse o make-up genetico. Per la parte tenotomia del procedimento, mantenere condizioni di sterilità utilizzando la maschera di protezione, cofano capelli, e camice sterile, guanti e strumenti. Siti chirurgici devono essere sterilmente preparati con iodopovidone e drappeggio sterile. Evitare l'ipotermia utilizzando una piastra elettrica veterinaria e il riscaldamento soluzioni rianimazione a 37 ° C prima di amministrazione.
- Anestetizzare il mouse utilizzando 2,5% isoflurano per via inalatoria. Utilizzare un cono di lasciare il dorso e arti posteriori facilmente accessibile. Regolare la velocità di somministrazione isoflurano per mantenere la frequenza respiratoria adeguata e la colorazione delle mucose e per garantire l'anestesia controllando il tono muscolare, pizzico piedi, e di riflesso corneale. Applicare blando pomata oftalmica agli occhi del mouse per evitare lesioni agli occhi asciutti durante la procedura. Mantenere un'adeguata temperatura corporea usando una piastra elettrica veterinaria o circolatore acqua calda sotto il campo operatorio.
- Somministrare buprenorfina, 0,1 mg / kg, per via sottocutanea immediatamente prima di un intervento chirurgico per l'analgesia.
- Strettamente radere sito chirurgico sulla zampa posteriore sinistra utilizzando tagliaunghie dal tallone al ginocchio.
- Strettamente radere dorso del mouse, iniziando sopra la colonna vertebrale ed estendendo l'area rasata a sinistra della linea mediana dorsale, aprendo una superficie di almeno 2 cm x 3 cm per accogliere il ustioni.
- Preparare il sito chirurgico, compresa la zampa posteriore al ginocchio con 3 alternati scrub povidone-iodio.
- Eseguire una incisione longitudinale lungo la faccia mediale del tendine d'Achille sinistro. Estendere l'incisione in modo che il tendine di Achille può essere facilmente visualizzato; di circa 0,5 cm.
- Eseguire una tenotomia di Achille con tagliente dissezione del tendine a metà con le forbici tessuti taglienti. Inserire una lama delle forbici del tessuto sul piano tessuto sotto il tendine e sezionare lungo il piano finché la lama è al punto medio del tendine. Chiudere le lame a forbice per tagliare il tendine bruscamente.
NOTA: Assicurare l'inclusione di tutti i tendini posteriori tra cui gastrocnemio, soleo, e tendini Plantaris. - Raggiungere emostasi facendo pressione con garza sterile (ci dovrebbe essere minimo sanguinamento) e chiudere l'incisione cutanea con un punto 5-0 Vicryl.
- Eseguire la dorsale parziale spessore di masterizzazione con un blocco di alluminio del peso di 35 g con measuremen approssimativits 2 centimetri x 2 cm x 3 cm riscaldata a 60 ° C in un bagno d'acqua applicata al dorso rasata del mouse per 17 sec.
NOTA: ottenere la profondità ustione appropriata posizionando il blocco superiore del mouse anestetizzato, garantendo che l'intera superficie del blocco è in contatto con il mouse, però evitare di applicare qualsiasi ulteriore pressione al blocco, cioè permettono gravità essere l'unica forza tiene il blocco in posizione. Una maniglia di plastica sottile fissato su un lato del blocco è conveniente per la manipolazione, la stabilizzazione, e recupero dal bagno di acqua calda. Questo creerà un organo di totale superficie di circa il 30% a bruciare in un 8-10 settimane di età C57BL / 6 del mouse. Questo ustione contatto è stata scelta rispetto ad altri metodi (fiamma o scottature masterizzazione) a causa della uniformità della profondità dell'ustione sulla ferita e la riproducibilità tra animali. - Asciugare il sito ustione con una garza e applicare una medicazione Tegaderm.
- Somministrare fluidi riscaldati rianimazione: Ringer lattato soluzione 1 mliniezione intraperitoneale e 0,5 ml iniezione sottocutanea. Questa amministrazione di una volta di rianimazione è adeguata per il recupero da ustioni e tenotomia.
NOTA: Non tornare topi anestetizzati per gabbie abitative con altri topi, casa individualmente in gabbie pulite sotto controllo fino a quando i topi sono completamente recuperati. Recupero tipica avviene entro 1-6 ore. Siti di masterizzazione in genere guariscono entro 2-4 settimane e raramente sono complicate da infezione della ferita se tenuti in ambienti abitativi puliti. - Somministrare buprenorfina 0,1 mg iniezione sottocutanea / kg ogni 12 ore per 3 giorni dopo la procedura. Monitor crescita HO con scansioni seriali μCT a intervalli appropriati. Crescita ossea ectopica è il primo evidente circa 3 settimane dopo l'intervento per μCT.
NOTA: La maggior parte dello sviluppo HO è completata entro 9 settimane post-op. Non abbiamo osservato una differenza di volume HO o posizione con ripetute μCT scansioni bi-settimanale per 15 settimane rispetto a un unico end-point μCT scansione a 15 settimane.Al termine degli esperimenti, tutti i topi eutanasia con CO 2 inalazione secondo le linee guida istituzionali e verificare la morte con dislocazione cervicale dopo 10 min.
2. μCT Acquisizione e analisi
- Fissare il mouse anestetizzato sul piano dello scanner in posizione prona. Nastro arti posteriori saldamente al letto per evitare di respirare artefatti da movimento. Includere l'aria, l'acqua, e idrossiapatite contenente fantasma sotto il mouse per la calibrazione dell'immagine.
- Aprire il software di analisi Bone e definire una regione di interesse (ROI) che comprende entrambi gli arti posteriori dal anca prossimale alla punta della zampa posteriore distale. Ottenere un'immagine utilizzando i seguenti parametri:. 80 kV, 500 μA e 1.300 esposizione msec, 48 micron dimensioni voxel 14,15
- Calibrare l'immagine di unità Hounsfield (HU) disegnando un ROI in ciascuna delle tre camere fantasma e inserendo la densità media nei campi appropriatiil software.
- Con lo strumento "grabber" nel software, riorientare l'immagine in modo tibia del arto posteriore sinistro è parallelo lungo l'asse Z per consentire la più chiara vista anatomico per la delineazione di strutture ossee corticali ortotopico e HO.
- Cominciando al ginocchio, scorrere distalmente attraverso le fette di immagine fino a quando si incontra HO. Utilizzando lo strumento spline manuale, fare un ROI attorno all'osso ectopica su ogni 5 ° fetta continuando distale attraverso la zampa o fino HO è stato superato. Utilizzare lo strumento estrapolare per estendere e cucire le ROI in un unico ROI che contiene tutte le HO.
- Fare un ROI 3D e scegliere il menu analisi. Calcolare il volume osseo impostando i valori di soglia inferiore e superiore che meglio mostrano la finestra ossea. Utilizzare gli stessi valori soglia fissati per tutte le scansioni.
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Representative Results
In questo studio, il protocollo è descritto per il modello precedentemente pubblicata murino di trauma / bruciare indotto HO. 14-17 Questo comporta la creazione di una concomitante lesione muscolo-scheletrico localizzata con un tenotomia Achille e insulto infiammatorio globale, con un spessore parziale ustioni. Ciò provoca la formazione di osso affidabile reattivo al sito tenotomia che può essere seguito con l'imaging seriale. Ad oggi, tutti i topi (più di 50) che hanno sostenuto sia Achille tenotomia e masterizzare lesioni hanno sviluppato una quantità misurabile di HO nel sito tenotomia. Per quantificare la formazione di osso ectopico, un protocollo immagine μCT calibrato viene utilizzato in ogni time-point desiderato. L'aggiunta di una ustione in combinazione con la tenotomia di Achille ha dimostrato di essere fondamentale per l'induzione di HO significativo. Con entrambe le lesioni accadendo contemporaneamente vi è un aumento significativo della quantità di osso ectopico che si forma in corrispondenza tenotomia rispetto al AcHilles tenotomia sola (Figura 1). 17
Figura 1. sviluppo HO seguente Achille tenotomia con o senza ustioni concomitante. Tutti i topi ha ricevuto una tenotomia di Achille della cerva arto sinistro, la metà dei topi ha ricevuto anche un TBSA spessore parziale del 30% ustioni sul dorso. scansioni μCT sono stati completati a 5 giorni e 3, 5, 7, 9, a 15 settimane dopo un infortunio. (A). Ricostruzioni 3D rappresentativi sono indicati con l'osso ortotopica bianco e HO colore blu. Cerchi rossi indicano niduses di HO. Ectopica sviluppa nella zona della tenotomia nonché posizioni distali e prossimali al sito della lesione degli arti inferiori. Simile a HO visto clnically, questo osso reattiva può essere contigue a osso scheletrico o sviluppare in remoto nei tessuti molli. (B). La quantificazione di HO era completato con un protocollo immagine calibrata e mostrato nel grafico. HO si è protratto oltre 15 settimane, tuttavia altipiani di sviluppo tra 9-15 settimane con la velocità di crescita più tipicamente visto tra 5-9 settimane. I dati sono mezzi +/- SD, n = 4 per gruppo, di Student t-test, * P <0.05 (Si noti che questo è tradotto dati modificati da 17). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
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