Protocol
倫理文：実験動物研究所から第八版（ILAR、2011）とした：全ての動物手順は、実験動物の使用およびケアのためのガイドで提供されるガイドラインで定義されているように、良好な動物の練習に厳密に従って実施しましたミシガン大学（PRO0001553）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
1.マウスの外科的処置
注：使用8-10週齢のC57BL / 6マウス。他の年齢、背景、およびマウスの系統は、異なる条件または遺伝的構成をテストするために使用することができます。手続きの腱切除部分については、フェイスマスク、ヘアボンネット、および滅菌ガウン、手袋、および器具を使用して無菌状態を維持します。手術部位は無菌ポビドンヨード及び滅菌ドレープで準備する必要があります。獣医の加熱パッドを使用し、前administraに37℃に蘇生ソリューションを加温することにより低体温を避けまする。
- 2.5％吸入イソフルランを用いてマウスを麻酔。簡単にアクセス背と後肢を残すためにノーズコーンを使用してください。粘膜の適切な呼吸数や着色を維持し、筋緊張、つま先のピンチ、および角膜反射をチェックすることにより、麻酔を確実にするために、イソフルランの投与速度を調整します。手順中にドライアイの怪我を防止するために、マウスの目に当たり障りのない眼軟膏を適用します。手術野の下の獣医の加熱パッドや温水循環装置を使用して、適切な体温を維持。
- 鎮痛のための手術の皮下直前に、ブプレノルフィン、0.1ミリグラム/ kgで投与します。
- 密接膝にかかとからバリカンを使用して、左後足に手術部位を剃ります。
- 密接に背骨の上に始まり、背側正中線の左に剃毛領域を拡張する、火傷に対応するために、地域に少なくとも2cm×3cmをクリアし、マウスの背部を剃ります。
- 3交流ポビドンヨードスクラブを使用して、膝に後足を含め、手術部位を準備します。
- 左アキレス腱の内側面に沿って縦切開を行います。アキレス腱を容易に可視化することができるように、切開部を拡張します。約0.5センチメートル。
- シャープ組織ハサミで中点で腱の鋭い解剖とアキレス腱切除術を行います。腱の下に組織面での組織のはさみの刃を挿入し、ブレードが腱中間点になるまで平面に沿って詳細に分析。急激腱を切断するはさみの刃を閉じます。
注：腓腹筋、ヒラメ筋、および足底腱を含むすべての事後腱を含めることを確認してください。 - 滅菌ガーゼで圧力をかけて止血を達成（最小限の出血があるはずです）と5-0ビクリルステッチで皮膚切開を閉じます。
- おおよそのmeasuremenで35グラムの重さのアルミニウムブロックと背部分層熱傷を行いますTS 2センチメートル×2センチ×3センチメートル17秒間マウスの剃毛背部に適用される水浴中で60℃に加熱しました。
注：ブロックの表面領域全体がマウスに接触している、しかし、ブロックに追加の圧力をかけることを避けることを確認して、麻酔したマウスの上にブロックを休んすることにより、適切な火傷の深さを実現、 すなわち、重力があることを可能にします所定の位置にブロックを保持する唯一の力。ブロックの一方の側に取り付けられた薄いプラスチック製のハンドルは、操作、安定化、および湯浴からの検索に便利です。これは、8〜10週齢のC57BL / 6マウスでは約30％、全体表面積の熱傷を作成します。この接触燃焼が原因で傷の上に火傷の深さの均一性と動物の間の再現に他の方法（火炎や熱傷熱傷）が選択されています。 - ガーゼで熱傷部位を乾燥さテガダームドレッシングを適用します。
- 温め蘇生液を投与：乳酸リンゲル液1ミリリットルを腹腔内注射0.5mlの皮下注射。蘇生のこの1回投与は、火傷や腱切除からの回復のために十分です。
注：マウスを完全に回復するまでの監視の下できれいなケージに個別に、他のマウスと住宅ケージに家を麻酔したマウスを返さないでください。典型的な回復は、1-6時間以内に発生します。熱傷部位は、一般的に2〜4週間以内に治癒するときれいな住宅環境で守ればめったに創傷感染によって複雑にされていません。 - ブプレノルフィンを0.1mg / kgの皮下注射を手順、次の3日間ごとに12時間を管理します。適切な間隔でシリアルμCTスキャンとHOの成長を監視します。異所性骨の成長は、μCTによって術後3週間の周りに最初は明らかです。
注：HO開発の大部分は術後9週までに完了しています。私たちは繰り返しμCTとHOボリュームまたは場所の違いは、シングルエンドポイントは15週でスキャンμCTに比べて15週間にわたって隔週をスキャン確認されていません。実験の終了時に、施設のガイドラインに従ってCO 2吸入で全てのマウスを安楽死させると、10分後に頚椎脱臼で死亡を確認。
2.μCT取得および分析
- 腹臥位でスキャナベッドに麻酔をかけたマウスを固定します。呼吸モーションアーチファクトを防ぐために、しっかりと床に後肢をテープで固定します。イメージキャリブレーションのためのマウスの下にファントムを含む空気、水、およびヒドロキシアパタイトを含みます。
- 骨解析ソフトウェアを開き、遠位後肢の先端に近位に股関節から後肢の両方を含む関心領域（ROI）を定義します。以下のパラメータを使用して、画像取得します。80 kVで、500μAと1300ミリ秒露光、48ミクロンのボクセルサイズを14,15
- 3ファントム室の各々にROIを描画するとの適切なフィールドに平均濃度を入力することにより、ハンスフィールド単位（HU）に画像のキャリブレーションソフトウェア。
- 左後肢の脛骨が同所皮質骨構造の描写とHOのための明確な解剖学的ビューを可能にするために、Z軸に沿って平行になるように、ソフトウェアで「グラバー」ツールを使用して、再配向画像。
- HOが発生するまで、膝で始まり、画像スライスを通って遠位方向にスクロールします。マニュアルスプラインツールを使用して、足を介して、またはHOが突破されるまで、遠位に継続ごとに5 回目のスライス上に異所性骨の周りにROIを行います。すべてのHOを含むものROIにまとめたROIを拡張し、ステッチする外挿ツールを使用します。
- 3D ROIを作成し、分析メニューを選択します。最高の骨窓を示す下側および上側の閾値を設定することにより骨量を計算します。すべてのスキャンに同じ固定しきい値を使用してください。
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Representative Results
この本研究では、プロトコルは、外傷/火傷誘発されるHOの以前に公開されたマウスモデルに記載されている。14-17これはアキレス腱切除術と部分層熱傷を持つグローバル炎症侮辱と同時に、ローカライズ筋骨格傷害の作成 が含まれます。これは、シリアル·イメージングで追跡することができる腱切除部位での反応性骨を確実に形成されます。現在までに、アキレス腱切除術の両方を持続し、熱傷したすべてのマウス（50以上）が腱切除部位でHOの測定可能な量を開発しました。異所性骨の形成を定量化するために、キャリブレーション画像μCTプロトコルは、所望の各時点で使用されています。アキレス腱切除術と組み合わせて、火傷の添加は重要なHOの誘導において重要であることが証明されました。両方の怪我が同時に起こっての交流に比べ腱切除部位に形成された異所性骨の量の有意な増加がありますhillesの腱切除単独（ 図1）。17
同時熱傷を伴うまたは伴わないアキレス腱切除術、次の図1のHO開発を。全てのマウスは、左後肢のアキレス腱切除術を受けたマウスの半分はまた背部の30％TBSA部分層熱傷を受けました。 μCTスキャンは5日で完了し、3、5、7、9、および15週目には、損傷を投稿しました。 （A）。代表的な3次元再構成は、同所性骨白とHOが青色で表示されます。赤い丸は、HOのnidusesを示します。異所性骨は、腱切除の面積だけでなく、下肢における損傷部位への遠位端と近位の場所で開発しています。 clnically見HOと同様に、この反応性骨が骨格の骨と連続しているか、軟部組織でリモートで開発することができます。 （B）。 HOの定量化は、COMました較正済み画像プロトコルでpletedグラフに示します。 HOは、15週間を超えて、典型的には5-9週間の間に見られる最大の成長速度で9-15週間の間しかし、開発プラトーを持続しています。データは、平均+/- SD、群あたりn = 4、スチューデントの t検定、* P <0.05であります （これは以前に17から変更されたデータを、公開されていることに注意してください）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
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