Protocol
Declaración de Ética: Todos los animales procedimientos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales como se define en las directrices establecidas en la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio: Octava edición del Instituto de Investigación de Animales de Laboratorio (ILAR, 2011) y fueron aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Michigan (PRO0001553).
1. Ratón Procedimientos Quirúrgicos
NOTA: El uso de 8-10 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Otros edades, orígenes y cepas de ratones también se pueden utilizar para probar diferentes condiciones o genética. Para la parte tenotomía del procedimiento, mantener condiciones estériles usando mascarilla, capo de cabello y bata estéril, guantes, y los instrumentos. Sitios quirúrgicos se deben preparar de forma estéril con povidona yodada y drapeado estéril. Evite la hipotermia utilizando una almohadilla térmica veterinaria y el calentamiento de soluciones de reanimación a 37 ° C antes de ADMINISTRAción.
- Anestesiar al ratón usando 2,5% de isoflurano inhalado. Use un cono de la nariz para dejar el dorso y extremidades traseras de fácil acceso. Ajustar la velocidad de administración de isoflurano para mantener la tasa respiratoria apropiada y la coloración de las membranas mucosas y para asegurar la anestesia mediante la comprobación del tono muscular, pizca dedo del pie, y el reflejo corneal. Aplicar pomada oftálmica sosa para los ojos del ratón para evitar lesiones en los ojos secos durante el procedimiento. Mantener la temperatura corporal adecuada utilizando una almohadilla térmica veterinaria o caliente de recirculación de agua debajo del campo quirúrgico.
- Administrar buprenorfina, 0.1 mg / kg, por vía subcutánea inmediatamente antes de la cirugía para la analgesia.
- Estrechamente afeitar el sitio quirúrgico en la pata trasera izquierda usando máquinas de cortar desde el talón hasta la rodilla.
- Estrechamente afeitar el dorso del ratón, comenzando sobre la columna vertebral y que se extiende el área afeitada a la izquierda de la línea media dorsal, la limpieza de un área de al menos 2 cm x 3 cm para acomodar la lesión por quemadura.
- Preparar el lugar de la cirugía, incluyendo la pata trasera de la rodilla utilizando 3 alternas friega-povidona yodada.
- Realice una incisión longitudinal a lo largo de la cara medial del tendón de Aquiles izquierdo. Extienda la incisión por lo que el tendón de Aquiles se puede visualizar fácilmente; aproximadamente 0,5 cm.
- Realizar una tenotomía de Aquiles con disección aguda del tendón en el punto medio con unas tijeras afiladas tejido. Inserte una hoja de la tijera de tejido en el plano de tejido debajo de la tendón y diseccionar lo largo del plano hasta que la hoja es en el punto medio del tendón. Cierre las hojas de las tijeras para cortar el tendón bruscamente.
NOTA: Asegúrese de que la inclusión de todos los tendones posteriores incluyendo gastrocnemio, sóleo y tendones Plantaris. - Lograr la hemostasia mediante la aplicación de presión con una gasa estéril (debe haber sangrado mínimo) y cerrar la incisión de la piel con una puntada 5-0 vicryl.
- Realice el dorsal quemadura de espesor parcial con un bloque de aluminio con un peso de 35 g con MEDICIÓN aproximadasts 2 cm x 2 cm x 3 cm se calentó a 60 ° C en un baño de agua aplicada a la dorso afeitada del ratón para 17 seg.
NOTA: Lograr la profundidad de la quemadura apropiado por el bloque descansando en la parte superior del ratón anestesiado, asegurando que toda el área de superficie del bloque se encuentra en contacto con el ratón, sin embargo evitar la aplicación de cualquier presión adicional para el bloque, es decir, permitir que la gravedad para ser la única fuerza que sostiene el bloque en su lugar. Un mango de plástico delgado unido a un lado del bloque es conveniente para la manipulación, la estabilización y recuperación del baño de agua caliente. Esto creará un área de superficie corporal total, aproximadamente el 30% se quema en un 8-10 semanas de edad C57BL / 6 mouse. Esta quemadura contacto fue elegido sobre otros métodos (llama quemadura o escaldadura) debido a la uniformidad de la profundidad de la quemadura sobre la herida y la reproducibilidad entre los animales. - Seque el lugar de la quemadura con una gasa y aplicar un apósito Tegaderm.
- Administrar fluidos de resucitación calentado: Ringer lactato solución de 1 mlinyección intraperitoneal y 0,5 ml de la inyección subcutánea. Esta administración de una sola vez de la reanimación es adecuado para la recuperación de la lesión por quemadura y tenotomía.
NOTA: No devuelva ratones anestesiados a las jaulas de vivienda con otros ratones, casa individualmente en jaulas limpias bajo vigilancia hasta que los ratones están totalmente recuperados. Recuperación típica se produce dentro de 1-6 horas. Sitios de quemaduras generalmente sanan dentro de 2-4 semanas y rara vez se complican por infección de la herida si se mantiene en entornos de vivienda limpias. - Administrar buprenorfina 0,1 mg inyección subcutánea / kg cada 12 horas durante 3 días después del procedimiento. Monitorear el crecimiento HO con exploraciones μCT serie a intervalos apropiados. El crecimiento del hueso ectópico es evidente por primera vez alrededor de 3 semanas después de la operación por μCT.
NOTA: La mayoría de desarrollo HO es completa por 9 semanas después de la operación. No hemos observado una diferencia en el volumen de HO o ubicación con repetidas μCT escanea dos veces por semana durante 15 semanas en comparación a un solo punto final μCT escanear a las 15 semanas.Al final de los experimentos, la eutanasia de todos los ratones con inhalación de CO2 de acuerdo con las directrices institucionales y comprobar la muerte con dislocación cervical después de 10 min.
2. μCT Adquisición y Análisis
- Asegure el ratón anestesiado en el escáner en la posición prona. Pegue las patas traseras firmemente a la cama para evitar respirar artefacto de movimiento. Incluya el aire, el agua y la hidroxiapatita contiene fantasma bajo el ratón para la calibración de imagen.
- Abra el software de análisis de hueso y definir una región de interés (ROI) que abarca ambas extremidades traseras de la articulación de la cadera proximalmente a la punta de la pata trasera distalmente. Obtener una imagen utilizando los siguientes parámetros:. 80 kV, 500 mu y 1.300 milisegundos de exposición, 48 micras de tamaño voxel 14,15
- Calibre la imagen para unidades Hounsfield (UH) dibujando un retorno de la inversión en cada una de las tres cámaras de fantasmas y la introducción de la densidad media en los campos apropiados enEl software.
- Con la herramienta "capturador" en el software, vuelva a orientar la imagen para la tibia de la extremidad posterior izquierda es paralelo a lo largo del eje Z para permitir la vista anatómico más clara para la delimitación de las estructuras óseas corticales ortotópico y HO.
- Comenzando en la rodilla, desplácese distalmente a través de los cortes de imagen hasta que se encuentre HO. Con la herramienta spline manual, hacer un retorno de la inversión alrededor del hueso ectópico en cada 5º rebanada continua distalmente a través de la pata o hasta HO ha sido superado. Utilice la herramienta de extrapolar para ampliar y unir las regiones de interés juntos en un retorno de la inversión que contiene toda la HO.
- Hacer un ROI 3D y elegir el menú de análisis. Calcule el volumen de hueso mediante el establecimiento de los valores inferior y superior de umbral que mejor muestran la ventana de hueso. Utilice los mismos valores de umbral fijados para todos los análisis.
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Representative Results
En el presente estudio, el protocolo se describe para el modelo previamente publicado ratón del trauma / quemadura inducida. HO 14-17 Esto implica la creación de lesiones musculoesqueléticas localizada concurrente con una tenotomía de Aquiles y el insulto inflamatorio global con un espesor parcial quemaduras. Esto da lugar a la formación fiable de hueso reactivo en el sitio de tenotomía que puede ser seguido con imágenes en serie. Hasta la fecha, todos los ratones (más de 50) que han sostenido tanto de Aquiles tenotomía y quemar lesiones han desarrollado una cantidad medible de HO en el sitio de la tenotomía. Para cuantificar la formación de hueso ectópico, un protocolo de imagen μCT calibrado se utiliza en cada punto de tiempo deseado. La adición de una lesión por quemadura en combinación con la tenotomía de Aquiles ha demostrado ser clave en la inducción de HO significativa. Con ambas lesiones ocurriendo simultáneamente hay un aumento significativo en la cantidad de hueso ectópico que se forma en el sitio de tenotomía en comparación con Accollados tenotomía sola (Figura 1). 17
Figura 1. desarrollo HO siguiente tenotomía de Aquiles con o sin lesión por quemadura concurrente. Todos los ratones recibieron una tenotomía de Aquiles de la extremidad posterior izquierda, la mitad de los ratones también recibió una TBSA espesor parcial 30% lesiones por quemadura en el dorso. exploraciones μCT se completaron a los 5 días y 3, 5, 7, 9, y 15 semanas después de la lesión. (LA). Reconstrucciones 3D representativos se muestran con blanco hueso ortotópico y HO color azul. Los círculos rojos indican niduses de HO. Hueso ectópico se desarrolla en el área de la tenotomía, así como lugares distales y proximales al sitio de la lesión en la extremidad inferior. Similar a HO visto clnically, este hueso reactivo puede ser contigua a la médula ósea o desarrollar de forma remota en los tejidos blandos. (B). Cuantificación de HO fue comcompletado con un protocolo de imagen calibrada y se muestra en el gráfico. HO ha persistido más allá de 15 semanas, sin embargo mesetas de desarrollo entre 9-15 semanas con mayor velocidad de crecimiento se observa típicamente entre 5-9 semanas. Los datos son medias +/- SD, n = 4 por grupo, prueba t de Student, * P <0,05 (Tenga en cuenta que este se publica datos modificados desde 17 anteriormente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
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