Summary
Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.
Abstract
Somatischen Zellen kann durch die Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und c-Myc) zwingt in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) umprogrammiert werden, typischerweise durch menschliche embryonale Stammzellen exprimiert (hES) . Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit HES-Zellen, haben iPSCs ein wichtiges Instrument für potenzielle Patienten-spezifischen regenerativen Medizin zu werden, die Vermeidung ethischer Fragen mit HES-Zellen verbunden. Um geeignete Zellen für die klinische Anwendung zu erhalten, müssen Transgen freien iPSCs erzeugt werden, um transgene Reaktivierung veränderte Genexpression und fehlgeleiteten Differenzierung zu vermeiden. Außerdem ist eine hocheffiziente und kostengünstige Anpassung Verfahren notwendig, eine ausreichende iPSCs für therapeutische Zwecke abzuleiten. Angesichts dieser Notwendigkeit, ist eine effiziente Integration von nicht-episomale Plasmid-Ansatz die bevorzugte Wahl für iPSC Ableitung. Derzeit die häufigste Zelltyp für eine Neuprogrammierung Zwecke sind Fibroblasten, die Isolierung von denen erfordert Gewebebiopsie, eine invasive chirurgischen Prozedur für den Patienten. Daher menschlichem peripheren Blut stellt den am besten zugänglichen und am wenigsten invasive Gewebe für iPSC Generation.
In dieser Studie wird ein kostengünstiges und virale freies Protokoll unter Verwendung nicht-integrierenden episomalen Plasmiden zur Erzeugung iPSCs aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC), nachdem Gesamtblut zentrifugiert und ohne Dichtegradiententrennung aus gefrorenen Leukozytenfilmen berichtet wird.
Introduction
In 2006 hat die Gruppe von Shinya Yamanaka 1 gezeigt, zum ersten Mal, dass Körperzellen aus adulten Mäusen und Menschen können durch ektopische Expression von vier Reprogrammierungsfaktoren (Oct-4, Sox-2, Klf-4, und in einem pluripotenten Zustand umgewandelt werden c-Myc), die Erzeugung der sogenannten induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) 2. Patientenspezifische iPSCs ähneln menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) in Bezug auf die Morphologie, Proliferation und die Fähigkeit, in die drei Keimzelltypen (Mesoderm, Endoderm und Ektoderm) differenzieren, während ohne die ethische Bedenken auf die Verwendung von HES-Zellen und Bypass zugeordnet mögliche Immunabstoßung 3. Somit iPSCs erscheinen als eine der wichtigsten Quellen von patientenspezifischen Zellen für die Grundlagenforschung, Drug Screening, Krankheitsmodelle, Bewertung der Toxizität und der regenerativen Medizin Qualität 4.
Es wurden mehrere Ansätze für iPSC Generation verwendet: viralen Integrationsvektoren(Retrovirus 5, Lentivirus 6), virale nicht-Integrationsvektoren (Adenovirus 7), Sendai-Virus-8, BAC Transposons 9, episomale Vektoren 10, 11 Proteine oder RNA-Lieferung 12. Obwohl die Verwendung von Virus-vermittelte Methoden können eine hohe Effizienz Neuprogrammierung führen, in das Genom der Wirtszellen und daher potentielle Zufalls Insertionsmutagenese integrieren virale Vektoren können permanente Veränderung der Genexpression und Reaktivierung von Schweigen Transgenen während der Differenzierung nicht ausgeschlossen werden 13.
Um iPSCs sicherer für die regenerative Medizin zu machen, wurden Anstrengungen unternommen, um iPSCs ohne die Integration von exogener DNA in zelluläre Genome abzuleiten. Obwohl verbrauch viralen Vektoren und Transposons entwickelt wurden, ist es noch unklar, ob die kurze Vektorsequenzen, die zwangsläufig verbleiben in den transduzierten Zellen nach der Exzision und Transposaseexpression könnte Veränderung Zelle induzierendere funktionieren 13. Trotz seiner hohen Effizienz Neuprogrammierung, Sendai-Virus stellt eine teure Vorgehensweise und zu erreichen, durch Lizenz Anliegen mit dem Unternehmen, die dieses System entwickelt, haben das Potenzial, ihre Anwendung in der translationalen Studien zu begrenzen. Darüber hinaus die Notwendigkeit für eine direkte Einführung von Proteinen und RNA erfordert mehrere Lieferung der Neuprogrammierung Moleküle mit den innewohnenden technischen Beschränkungen dieser führt, und die allgemeine Anpassung Effizienz ist sehr gering 14. Zu beachten ist, kosteneffektiv virale frei und nicht-integrierenden Methoden basierend auf der Verwendung von episomalen Plasmiden wurden erfolgreich für die Umprogrammierung der Hautfibroblasten 15 gemeldet. Insbesondere wird in der vorliegenden Arbeit haben wir beschlossen, im Handel erhältlichen Integration freien episomalen Plasmiden verwenden, wie bereits berichtet 10,15.
Bisher Haut-Fibroblasten stellen die beliebtesten Spenderzelle Typ 5. Aber auch andere Zellquellen wurden successfully in iPSCs einschließlich Keratinozyten 16, Knochenmark mesenchymale Stammzellen 17. Fettgewebe Stromazellen 18 umprogrammiert, Haarfollikel 19 und Zahnmark-Zellen 20. Die Isolierung dieser Zellen erfordert chirurgischen Verfahren und mehreren Wochen werden für in vitro-Zellexpansion, um eine primäre Zellkultur zu etablieren benötigt.
In diesem Licht ist die Auswahl der Ausgangszelltyp kritisch und es ist ebenso wichtig, iPSCs von leicht zugänglichen und weniger invasiv Geweben wie Blut erzeugen. Beide Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMNCs) 21,22 und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) 14,22-24 repräsentieren geeignete Quellen von Zellen für die Ableitung iPSCs.
Obwohl die Effizienz der erwachsenen PBMNC Umprogrammieren 20-50 mal niedriger als die von CBMNCs 22, bleiben sie die bequemste Zelltyp für die Beprobung. InTatsächlich hat PBMNC Probenahme den Vorteil, dass minimal-invasive, und außerdem sind diese Zellen nicht umfangreiche Expansion in vitro vor der Reprogrammierung Experimente erfordern. Bislang wurden unterschiedliche Protokolle berichtet, dass PBMNCs nach Dichtegradienten-Trennung nach dem Gefrieren eingefroren und aufgetaut Tage bis mehrere Monate und für einige Tage expandiert, bevor für die Umprogrammierung in iPSCs 22,23. Dennoch, soweit wir wissen, keine Berichte Umprogrammierung PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats beschrieben. Wichtig ist, dass gefrorene Buffy Coats ohne Dichtegradiententrennung gesammelt stellen die in großem Umfang von Biobanken Bevölkerungsstudien gespeichert und stellt somit eine leicht zugängliche Pool von Material für iPSC Produktion, die weitere Probennahme vermeidet häufigsten Blutproben.
Berichten wir hier zum ersten Mal die Erzeugung von Virusfrei iPSCs aus menschlichen gefrorenen buffy coats, basierend auf einem zuvor beschriebenen Protokoll 22. InAußerdem wurden aus gefrorenen iPSCs PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten erzeugt als Steuerprotokoll für die nicht-Dichtegradienten gereinigt PBMNC Ergebnisse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) wurden aus menschlichen peripheren Blut-Proben nach der unterzeichneten Einverständniserklärung und Zustimmung der Ethikkommission der Provinz Bozen gesunden Spendern isoliert. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki verankerten Grundsätze durchgeführt. Alle Daten wurden gesammelt und anonym ausgewertet.
1. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC)
- PBMNCs aus Buffy Coats nach Vollblut Zentrifugation erhalten, ohne Dichtegradiententrennung.
- Sammeln Sie 8 ml venösen peripheren Blut in eine Natriumcitrat gepuffert Kunststoffrohr, und lagern bei RT (25 ° C). Verfahren Blut innerhalb von 12 Stunden nach der Sammlung.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 xg für 15 min bei 4 ° C in einem Schwingbehälter-Rotor, Ausschalten der Zentrifuge Bremsen.
- Sammeln Sie die bewölkten Buffy-Coat (die Schicht zwischen der oberen Plasmaphase und der unterenPhase, die die meisten Erythrozyten), die das angereicherte PBMNC Fraktion (500 & mgr; l) in ein Kryoröhrchen Röhre.
- Resuspendieren 500 ul Leukozytenmanschette mit 500 ul 2x Gefriermedium, enthaltend 90% FBS und 20% DMSO, um ein Gesamtvolumen von 1 ml mit 10% DMSO-Konzentration zu erhalten.
- Frieren Sie das Fläschchen in einer kontrollierten Rate Gefrierbehälters bei -80 ° C. Speicher-Zellen in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume.
- PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten
- Sammeln Sie 12 ml venöses peripheren Blut in eine Natriumcitrat gepuffert Kunststoffrohr, und lagern bei RT. Verfahren Blut innerhalb von 12 Stunden nach der Sammlung.
- Verdünne das Blut mit steriler PBS auf ein Endvolumen von 35 ml.
- Vorsichtig und langsam, Schicht 35 ml verdünntes Blut auf 15 ml Polysaccharose Lösung (für Dichtegradiententrennung verwendet) (p = 1,077) in einem 50 ml konischen Röhrchen (Verhältnis 3: 1).
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 g für 30 min bei RT ineinem Schwingbecher-Rotor, Ausschalten der Zentrifuge Bremsen.
- Saugen Sie das obere, gelbe Phase, die Plasma- und entsorgen Sie sie. Vorsichtig, übertragen Sie die Deckweiß Zwischenphasenschicht enthält PBMNCs auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
- Bringen Gesamtvolumen auf 30 ml mit steriler PBS verdünnt und bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei RT.
- Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren mit 30 ml PBS. Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen, basierend auf Trypanblau-Ausschluß 25.
- Centrifuge PBMNCs bei 300 × g für 10 min bei RT, den Überstand aspirieren und entsorgen.
- Zellpellet in einer geeigneten Menge an Gefriermedium, enthaltend 90% FBS und 10% DMSO, um eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten.
- Aliquot 1 ml pro Fläschchen (ca. 5 x 10 6 Zellen / ml) und frieren das Fläschchen in einer kontrollierten Rate Gefrierbehälter bei - 80 ° C. Speicher-Zellen in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume.
2. Auftauen und Oberflächen von PBMNC (Tag 0)
- PBMNCs aus Buffy Coats nach Vollblut Zentrifugation erhalten, ohne Dichtegradiententrennung.
- Das Protokoll mit PBMNC aus gefrorenen Leukozytenfilmen starten, auftauen 1 Ampulle von Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C und verdünnt das buffy coat mit steriler PBS auf ein Endvolumen von 2 ml.
- Übertragen Sie die verdünnte Buffy-Coat in eine 50 ml konischen Röhrchen, 10 ml rot Zelllysepuffer und Inkubation für 10 min bei RT.
- Die Bereitstellung 500 ml Erythrozyten Lysepuffer, mit 0,5 g Kaliumbicarbonat, 4,145 g Ammoniumchlorid, 100 & mgr; l von 0,5 M EDTA-Lösung zu 500 ml ultrareinem Wasser, pH 7,2-7,4.
- Bringen Gesamtvolumen auf 50 ml mit sterilem PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei RT.
- Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 50 ml sterilem PBS Zentrifugation der Buffy-Coat bei 300 × g für 10 min bei RT.
- Resuspendieren der Zellen in1 ml PBMNC Medium, wie zuvor beschrieben, 22, aus: IMDM und Hams F-12 (Verhältnis 1: 1), 1% der Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin (ITS-X), 1% der chemisch definierten Lipid-Konzentrat (CDL), 1% Penicillin / Streptomycin, 0,005% L-Ascorbinsäure, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA), 1-Thioglycerin (Endkonzentration 200 uM), Stammzellfaktor SCF (100 ng / ml), Interleukin -3 IL-3 (10 ng / ml), Erythropoietin EPO (2 E / ml), Insulin-like Growth Factor-IGF-1 (40 ng / ml), Dexamethason (1 uM) und Holo-Transferrin (100 ug / ml ).
- Überführen diese in eine Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen mit Standardgewebekultur-behandelten Oberfläche ohne Beschichtung, in einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden, bis die Änderungsmedium Schritt (siehe Abschnitt 3).
- PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erhalten
- Um das Protokoll zu starten mit gefrorenen PBMNCs nachDichtegradiententrennung, Tau-1 Fläschchen von Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C, übertragen Sie die Zellen in 5 ml Medium PBMNC. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei RT.
- Resuspendieren der Zellen in 1 ml Medium PBMNC und sie in eine Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden, bis die Änderungsmedium Schritt (siehe Abschnitt 3).
3. Kultur und Ausbau der PBMNCs (DAY 2-13)
- Sammeln PBMNC in Suspensionskultur mit einer Pipette mit einer 1 ml-Spitze in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 10 min bei RT.
- Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem Medium PBMNC.
- Übertragen Sie die Zellen in 1 auch von 12-Well-Platte mit Standardgewebekultur behandelte Oberfläche, ohne Beschichtung, und inkubieren sie bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
4. Transfektion von PBMNC mit episomalen Plasmiden (Tag 14)
Hinweis: Führen Sie die Isolierung von den vier Handels intergation freien episomalen Plasmiden, die Durchführung der Pluripotenz Gene unter Verwendung eines kommerziellen Kits für Plasmidreinigung und Bewertung der Qualität der gereinigten Plasmide unter Verwendung einer Agarose-Gel-Analyse, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Sammeln PBMNC in 15 ml konischen Röhrchen und die Anzahl der lebensfähigen Zellen (auf der Basis von Trypanblau-Ausschluss) 25.
- Zentrifuge 2 x 10 6 Zellen bei 300 g für 10 min bei RT.
- Resuspendieren 2 x 10 6 Zellen in Transfektionsgemisch, das 100 ul Resuspensionspuffer T und 1 ug jedes Plasmid DNA (ein Plasmid, OCT3 / 4 und shRNA gegen p53, einem Plasmid, SOX2 und KLF4 manPlasmid, das L-MYC und Lin28 und ein Plasmid, EGFP, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen).
- Saugen Sie das Transfektionsgemisch mit den Zellen in eine 100 ul Spitze und legen Sie die Pipette mit der Probe senkrecht in das Rohr, mit 3 ml Elektrolyt-Puffer E2, in der Pipettenstation der Elektroporation Maschine platziert gefüllt ist, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Effizient elektroporieren Zellen mit dem folgenden Programm: 1650 V, 10 ms, 3 Impulse.
- Resuspendieren der elektroporierten Zellen (2 × 10 6 Zellen) in 2 ml des vorgewärmten PBMNC Medium unter Zugabe von 0,25 mM Natriumbutyrat (NaB) und die Anzahl der lebensfähigen Zellen nach der Elektroporation Protokoll (auf der Basis von Trypanblau-Ausschluss) 25.
- Übertragen Sie die Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte ohne Beschichtung, schaukeln die Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Am Tag nach der Elektroporation count die Zahl der GFP-positiven Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie 8-10 Zufallsfeldern, um die Transfektionseffizienz zu beurteilen.
- Pflegen Sie die transfizierten Zellen ohne Splitting für 3 Tage, bis sie auf Plattierung MEFs (siehe Abschnitt 6).
- Ersetzen Sie 2 ml frisches Medium PBMNCs, plus 0,25 mM NaB alle zwei Tage.
5. Bereiten Sie Gerichte mit Feeder-Zellen für die Co-Kultur (TAG 16)
- Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 1 ml Basalmembranmatrix für 15 min bei 37 ° C und die Platte embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / Well mit 2 ml 10% FBS enthielt DMEM (MEF Medium) einen Tag vor der Passage der Elektroporation PBMNCs auf MEF Feeder-Zellen.
6. Plating Transfizierte PBMNCs auf MEFs (DAY 17-19)
- Sammeln PBMNCs in Suspensionskultur, mit einer Pipette mit 1 ml Spitze, in 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren transfiziert PBMNCs bei 300 × g für 10 minbei RT.
- Überstand verwerfen und das Pellet in 2 ml frisches Medium PBMNC, plus 0,25 mM NaB.
- Platte der Zellen auf MEF beschichtet 6 Well-Platte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Nach zwei Tagen, saugen Sie den mittleren und ersetzen Sie es mit 2 ml iPSC Medium aus DMEM knockout (KO-DMEM), 20% KO-Serum Replacement (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L- Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 10 ng / ml FGF (Basic bFGF) und 0,25 mM NaB.
- Ersetzen Sie 2 ml frisches Medium iPSC jeden Tag und überprüfen Sie die Zellen täglich.
Hinweis: Bei etwa 22-25 Tage, sollten die ersten Kolonien iPSCs sichtbar sein.
7. Picking und Ausbau der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) Clones (DAY 30-35)
Hinweis: Bei etwa 30-35 Tage nach der Transfektion sollten iPSC Kolonien bereit für die Kommissionierung und replating sein. Die Umprogrammierung Effizienz sollte esti seingepaart als der Prozentsatz der Anzahl von iPSC Kolonien / Gesamtzahl der elektroporierten Zellen, wie zuvor berichtet 26.
- Am Tag vor der Passage iPSC Kolonien, bereiten Sie die MEF Feeder in einer 12-Well-Platte (1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung).
- Saugen Sie die MEF Medium und ändern mit 1 ml iPSC Medium mit 10 ng / ml bFGF und 10 & mgr; M Y-27632. Manuell sezieren mit einer Nadel eine Kolonie zu jeder Zeit unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube, um ein Raster zu erhalten, sammeln kleineren Klumpen durch Pipettieren und übernehmen diese einzeln jeweils in eine Vertiefung 12-Well-Platte mit MEFs beschichtet.
- Passage und erweitern Sie jede 12-Well-Platte zu einer 6-Well-Platte in einem Verhältnis 1: 2, dann jede 6-Well-Platte in einem Verhältnis 1: 4 für die weitere Vermehrung. Sezieren und zu erweitern iPSCs manuell für die ersten 2-3 Durchgängen (wie in Schritt 7.2 gründlich beschrieben), dann verwenden Sie ein Enzym Dissoziation Verfahren (ab Schritt 7.4).
- Für ein Enzym Dissoziation Protokoll, sauber iPSC colonies durch Absaugen differenzierte Teile unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube.
- IPSCs mit 1 ml Collagenase IV (1 mg / ml) für 10 min bei 37 ° C.
- Saugen Sie das Enzymlösung, spülen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM-KO und sammeln die Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min bei RT.
- Den Überstand aspirieren, zu suspendieren, die Kolonien in 2 ml iPSC Medium mit 10 ng / ml bFGF und 10 & mgr; M Y-27632 und die Platte sie auf MEF beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen (Verhältnis 1: 4).
8. Charakterisierung iPSCs (zwischen 5-15 Passages)
- Alkalische Phosphatase-Färbung
- Kultur IPSC Kolonien für 3-5 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
- Zum Starten eines alkalischen Phosphatase-Färbung Protokoll gründlich iPSCs einmal mit PBS und dann befestigen Sie sie mit 1 ml 4% PFA für 20 min bei RT.
- Mit PBS waschen die Zellen dreimal, um restliche PFA entfernen.
- Stain fixierten Zellen miteinen handelsüblichen alkalischen Phosphatase-Färbung Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Immunfluoreszenz
- Kultur IPSC Kolonien für 3-5 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
- Um eine Immunfluoreszenztest beginnen, waschen iPSCs einmal mit PBS und dann befestigen Sie sie mit 1 ml 4% PFA für 20 min bei RT.
- Mit PBS waschen die Zellen dreimal, um restliche PFA entfernen.
- Behandlung von festen iPSCs mit 1 ml Permeabilisierung / Blockierlösung, die 4% Ziegenserum, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 und 0,05% Natriumazid (NaN 3) für 1 h bei RT.
- Saugen Sie das Blockierungslösung und Inkubation der fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 3% BSA und 0,05% NaN 3 -Lösung O / N bei 4 ° C (überprüfen Sie die Materialtabelle für primäre Antikörper Liste und schlug vor, Antikörperverdünnungsfaktor).
- Am nächsten Tag, waschen iPSCs dreimal mit PBS, dann inkubieren Sie die Zellen mit Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus und Alexa Fluor 555 Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt 1: 1000 in 3% BSA und 0,05% NaN 3 -Lösung für 1 Stunde bei 37 ° C.
- Färben die Kerne mit DAPI (1 ug / ml) für 10 min bei RT im Dunkeln, gefolgt von drei Mal mit PBS gewaschen.
- Differenzierung von iPS-Zellen in Embryoid Bodies (EBS)
- Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
- Entfernen differenzierte Teile von iPSC Kolonien durch Absaugen unter dem Binokular im Kommissionierbereich-Haube.
- IPSCs mit 1 ml Collagenase IV (1 mg / ml) für 10 min bei 37 ° C.
- Saugen Sie das Enzymlösung, spülen Sie die Zellen mit 1 ml DMEM-KO und sammeln die Kolonien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g für 2 min bei RT.
- Absaugen des Überstandes und Resuspendieren der Kolonien in 2 ml EB Medium KO-DMEM, 20 definiert% fötalem Rinderserum (FBS), 1 mM NEAAs, 1% Penicillin / Streptomycin, 20 mM L-Glutamin, 0,1 mM46; -Mercaptoethanol.
- Teller iPSC Kolonien in Suspension für 6 Tage auf ultra-niedrige Befestigung 6-Well-Platten, um die Bildung von Kugel dreidimensionale Embryoidkörpern (EBS) zu ermöglichen. Ändern Sie 2 ml frischem EB Medium alle zwei Tage.
- Am Tag 7, sammeln EBs und platten sie auf 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Platten in 2 ml Medium, EB und beizubehalten EBs Differenzierung für 20 Tage.
- Ändern Sie 2 ml frischem EB Medium alle zwei Tage.
- qRT-PCR für die Genexpressionsanalyse
- Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage in iPS-Medium mit 10 ng / ml bFGF.
- Auszug Gesamt-RNA aus PBMNC, iPSCs oder EVG mit 1 ml der kommerziellen Reagenz gemäß Herstellerangaben.
- Werten Sie RNA-Konzentration und Reinheit durch geeignete Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Spektrophotometers (hochwertige RNA A 260 / A 280 und A 260 / A 230-Verhältnisse> 1,8) 27.
- ScheckRNA-Integrität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll (hochwertige RNA RQI> 9.5) 28.
- Durchführen einer reversen Transkriptionsreaktion von 1 ug Gesamt-RNA unter Verwendung eines kommerziellen reverse Transkriptase-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Sie die qPCR Mischungen, die 5 ng des cDNA-Matrize, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 & mgr; l von 5 & mgr; M Primer (vorwärts: 1 & mgr; l und rückwärts: 1 & mgr; l) und 6 & mgr; l RNase / DNase-freies Wasser für jede Reaktion 29.
- Führen der qRT-PCR unter Verwendung des folgenden Programms: eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 Sekunden und Annealing und Verlängerungsschritt in einen Denaturierungsschritt unterteilt bei 60ºC für 45 sec 29.
- Normalisieren die Expression anderer Gene mit GAPDH als Housekeeping-Gen 28 (siehe die in Tabelle 1 aufgeführten Primer).
- qPCRfür Transgene Ausschluss
- Extrahieren von DNA aus PBMNC oder iPSCs mit 1 ml Lysepuffer, der 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 ug / ml Proteinase K.
- In das gleiche Volumen (1 ml) von 100% Isopropanol, mischen durch Umdrehen dreimal, um DNA-Niederschlag und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 min bei RT ermöglichen.
- Überstand verwerfen, waschen Sie die DNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5 min bei RT. Absaugen und den Überstand verwerfen und resuspendieren sie in RNase / DNase-freiem Wasser.
- Werten Sie die DNA-Konzentration und Reinheit durch geeignete Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung eines Spektrophotometers (hochwertige RNA A 260 / A 280 und A 260 / A 230-Verhältnisse> 1,8) 27.
- Bereiten Sie die qPCR Mischungen, die 5 ng der DNA-Matrize, 7,5 ul SYBR Green Supermix, 2 & mgr; l von 5 & mgr; M Primer (vorwärts: 1 & mgr; l und rückwärts: 1 & mgr; l) und 6 &# 181; l RNase / DNase-freies Wasser für jede Reaktion 29.
- Normalisieren die Expression spezifischer episomale Plasmid-EBNA-1-Gens mit FBX-15 als Housekeeping-Gen 29 (siehe die in Tabelle 1 aufgeführten Primer).
- Karyotypanalyse
- Kultur IPSC Kolonien für 5-6 Tage auf Feeder-freien Basalmembranmatrix beschichtete Platte mit einer kommerziellen definiert, Feeder freien Erhaltungsmedium für iPSCs nach Herstellerangaben.
- Um die Karyotyp-Analyse-Protokoll zu starten, trennen iPSC Kolonien mit 1 ml Zellablösung Lösung für 5 min bei 37 ° C, bis zum Erhalt Single-Cell-Dissoziation.
- Sammeln Zellen und Zentrifugieren bei 400 xg für 5 Minuten bei RT.
- Resuspendieren iPSCs in 2 ml eines Mediums, insbesondere zur Kultivierung von Zellen zur pränatalen Diagnosetechniken entwickelt. Platte Einzelzell iPSCs auf Basalmembranmatrix beschichtete Glasschalen und inkubieren sie in einem 37 ° C, 5% CO 2 </ Sub> Inkubator.
- Nach 2-4 Tagen, mit 10 ul / ml Colchicin direkt zu den Kulturen und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Absaugen Medium und Inkubation iPSCs in 1 ml eines hypotonischen Lösung (0,6% Natriumcitrat und 0,13% Kaliumchlorid) für 10 min bei RT.
- Spülen Zellen mit 1 ml 5% iger Essigsäurelösung und fixieren iPSCs mit Methanol / Essigsäure-Lösung (Verhältnis 3: 1) in einer Maschine mit kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit (28 ° C, 42% relative Luftfeuchtigkeit).
- Tauchen und schmutz fixierten Zellen mit Quinacrine Lösung für 15-20 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit 30 (Q-Banding zu erhalten).
- Erwerben Zelle Metaphasen unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrßerung 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dieser Studie wurde ein einfaches und wirksames Protokoll für die Erzeugung von Virusfrei iPSCs durch Umprogrammierung PBMNC aus gefrorenen buffy coats, nachdem Gesamtblut zentrifugiert und Vergleich mit Umprogrammierung PBMNCs nach Dichtegradiententrennung wird berichtet, erhalten wurde, isoliert. 1A zeigt eine schematische Darstellung das detaillierte Protokoll. Nach dem Auftauen werden die isolierten PBMNC, welches einen typischen abgerundete Form werden in spezifischen Blutkulturmedium für 14 Tage (1B) entspannt und anschließend mit episomalen Plasmiden transfiziert. Nach 10-15 Tage nach der Transfektion, kleine runde helle Kolonien mit definierten Rändern und embryonalen Stammzellen förmige Morphologie beginnen zu erscheinen (Abbildung 1c). Ca. 20-30 Tage nach der Transfektion iPSC Kolonien werden sehr kompakt, mit scharfen Kanten, erhöhen ihre Größe und sind bereit für die Kommissionierung und die Expansion (1D). Nach den ersten Passagierung Schritte (2-3 Passagen),iPSC Kolonien behalten ihren undifferenzierten Zustand und zeigen eine typische menschliche embryonale Stammzelle-Morphologie. In den ersten Durchgängen ist die manuelle Kommissionierung eine effizientere Expansion Weise gegenüber Dissoziation, um vollständig undifferenzierte, kompakt und dicht gepackten Kolonien (2A) wählen Enzym. Größere Vergrößerung iPSC Kolonien zeigt einzelne Zellen innerhalb der Kolonien und die hohe Zellkern in Zytoplasma-Verhältnis leichter beobachtet (2B). Nach anfänglichen mechanischen sammeln, werden ausgewählt iPSC Klone mit Enzym Collagenase mit Dissoziation IV erweitert. Nach 10-15 Passagen in vitro Expansion wird zytogenetische Analyse auf iPSC Kolonien durchgeführt. Über 20 Metaphasen von mindestens zwei unabhängigen Kulturen, bei etwa 300-400 Bandniveau, werden analysiert und alle Proben zeigen eine normale Karyogramm (2C). Diese Beobachtung legt nahe, dass iPSCs genetisch stabil sind.
AchternER in vitro-Expansion (5-10 Passagen) sind iPSCs für die Expression stemness Markern und ihre Pluripotenz Potential gekennzeichnet. 3A, B zeigen, dass iPSCs positiv für alkalische Phosphatase-Färbung. Verwendung qRT-PCR Analyse haben wir überprüft, dass iPSCs exprimieren endogene pluripotenten Gene (SOX-2, OCT3 / 4, NANOG) bei deutlich höheren Niveau als Ausgangs PBMNC, wobei die Expressionsniveaus des endogenen c-myc und KLF-4 ähnlich sind, vor und nach iPSC Neuprogrammierung (3C). Nach nur 5 Passagen in der Kultur, kann die Expression von exogenen episomal Transgene nicht in iPSCs nachgewiesen werden, was auf die erfolgreiche Aktivierung von endogenen Genen pluripotent. PBMNC 5 Tage nach der Transfektion mit starken Transgen-Expressionsniveau durch episomale spezifische Primer für EBNA-1 bewertet, als positive Kontrolle verwendet. PBMNC, die nie zu Plasmiden, die die 4 exogene Pluripotenz Genen ausgesetzt sind, werden als Negativkontrolle verwendet (FiAbbildung 3D). Schließlich Immunfluoreszenz-Analyse ergibt iPSCs exprimieren Pluripotenzmarker wie OCT3 / 4, SOX-2, SSEA-4, TRA-1-60 und TRA-1-81 (Abbildung 4).
iPSCs in embryonale Körper (EBs) unter Verwendung eines spontanen Differenzierung Protokolls differenziert wird, wie in 5A gezeigt ist, um ihre in vitro Pluripotenz Potential auszuwerten. qRT-PCR-Experimente zeigen, dass iPS-Zellen sind in der Lage, in Zellen der drei Keimblätter differenzieren; in der Tat, erhalten EBs nach 20 Tagen der Differenzierung Display signifikante Hochregulation der Linie Marker Vertreter der Endoderm (SOX-7, AFP), Mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) und Ektoderm (KTR 14, TH, GABRR-2) (5B). Konfokale Mikroskopie Analyse zeigt, dass einzellige dissoziiert schlagen Cluster auszudrücken typischen Kardiomyozyten Marker wie Troponin I (Tn-I) und α-Actinin, in einer klaren sarcomeric Muster organisiert (Abbildung6A). Außerdem Immunfluoreszenzanalyse der EBs zeigt eine positive Färbung für die Neuronen-spezifischen Marker der Klasse III β-Tubulin (TuJ1) sowie für die dopaminergen neuronalen Marker Tyrosin-Hydroxylase (TH) (6B).
Abbildung 1. Das Protokoll für die Erzeugung von iPS-Zellen aus menschlichem peripherem Blut und Zell morphologischen Veränderungen während des Protokolls. (A) Schematische Darstellung des Protokoll zum iPSCs aus gefrorenen PBMNCs erhalten zu erzeugen, nachdem DGS und PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats isoliert, unter Verwendung eines einzigen Transfektion der nicht-integrierenden episomalen Plasmiden. (B) Repräsentative Bilder von wuchernden PBMNCs von DGS und Buffy Coats nach dem Auftauen und Expansion in Kultur für 14 Tage erhalten, bevor sie transfiziert. Maßstabsleiste 100 um. (C) Beispiele für iPSC Kolonien 1 Woche nach dem die Zellen PLATED auf MEFs. Maßstabsleiste 500 um. (D) Repräsentative Bilder der iPSC Kolonien bei 30-35 Tage nach der erneuten Beschichtung auf einem MEF Feeder-Schicht. Maßstabsleiste 500 um. iPSCs = induzierte pluripotente Stammzellen; DGS = Dichtegradiententrennung; PBMNC = periphere mononukleäre Blutzellen; MEFs = embryonalen Maus-Fibroblasten; GF = Wachstumsfaktoren; bFGF = basischer Fibroblastenwachstumsfaktor; NaB = Natriumbutyrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Morphologie und Karyotyp-Analyse. (A) Repräsentative Bilder der iPSC Kolonien nach 2-3 Handbuch Passagieren Schritte. Maßstabsleiste 500 um. (B) Größere Vergrößerung iPSC Kolonien. Maßstabsleiste 200 um. (C) representative normalen Karyogramme von iPS-Zellen nach 10-15 Passagen in vitro Expansion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. iPSC Charakterisierung: alkalische Phosphatase-Aktivität, Wieder Expression endogener Gene von Pluripotenz iPSCs und Auswertung Verstummen des Transgens (A) und (B) Repräsentative Bilder, die die positive Färbung für alkalische Phosphatase.. Maßstabsleiste 500 um. (C) Das Balkendiagramm, das Re-Expression von endogenen Genen Pluripotenz (C-MYC, KLF-4, SOX-2, OCT3 / 4 und NANOG) in beiden iPSCs von DGS und Buffy Coats erzielt werden, mit qRT-PCR-Analyse ( n = 4, Student t-Tests: * p <0,05, § p <0,005 vs entsprechenden PBMNCs). (D) qRT-PCR mit episomalen-spezifischen Primern (EBNA-1) (bezogen auf FBOX15 Primer Kontrolle) zeigt kein Genom-Integration von episomalen Vektoren. (N = 4, Student t-Tests: * p <0,001 vs entsprechenden PBMNCs 5-Tage-Transfektion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Immunfluoreszenz-Analyse von embryonalen Stammzellen Pluripotenz Marker. Repräsentative Immunfluoreszenzfärbung, die signifikante Expression von Proteinen Pluripotenz SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, OCT3 / 4 und SOX-2. Kerne mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsleiste 200 um für iPSC DGS (A) und iPSC Buffy coat (B). Maßstabsleiste 100 um für iPSC Buffy coat (A), iPSC DGS (B strong>) und (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Protokoll zur Differenzierung von iPS-Zellen und die Expression von drei Keimschicht Gene in EBs aus iPSCs erhalten. (A) Schematische Darstellung des Protokolls induziert die spontane Differenzierung von iPS-Zellen aus PBMNCs nach DGS und Buffy Coats in EBs. (B) qRT-PCR-Experimente, die die Expression aller drei Keimschicht Gene: Endoderm (SOX-7, AFP), Mesoderm (CD31, ACTA-2, CDH-5, RUNX-1) und Ektoderm (KRT-14, TH, GABRR-2) in EBs nach 20 Tagen der Differenzierung (n = 4, Student t-Tests: * p <0,05 vs entsprechenden iPSCs Gegenstück). EBs = Embryoidkörpern./52885/52885fig5large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Die konfokale Mikroskopie Analyse der Herz-und neuronale Proteine in EBs an Tag 20 der Differenzierung nach der DGS und Buffy Coats stamm iPSCs von PBMNCs erhalten. (A) Repräsentative Bilder (maximal Projektion konfokale Bildstapel) für die Herz sarcomeric Proteinen α-Actinin und Troponin I (Tn-I) in Einzelzell dissoziiert schlagen Bereiche (Maßstab 10 & mgr; m) und (B) für das Neuron-spezifischer Marker-Klasse III β-Tubulin (TuJ1) und der dopaminergen neuronalen Marker Tyrosin-Hydroxylase (TH) (Skala Bar 20 um). Kerne mit DAPI gegengefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Zahl.
| Grundierung | Reihenfolge | ||
| C-MYC fw | 5'-AGAAATGTCCTGAGCAATCACC-3 ' | ||
| C-MYC rev | 5'-AAGGTTGTGAGGTTGCATTTGA-3 ' | ||
| KLF-4 fw | 5'-ATAGCCTAAATGATGGTGCTTGG-3 ' | ||
| KLF-4 rev | 5'- AACTTTGGCTTCCTTGTTTGG-3 ' | ||
| SOX-2 fw | 5'- GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3 ' | ||
| SOX-2 rev | 5'TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3 | ||
| OCT3 / 4 fw | 5'- GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3 ' | ||
| OCT3 / 4 rev | 5'- CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3 ' | ||
| NANOG fw | 5'-TGCAAGAACTCTCCAACATCCT-3 ' | ||
| NANOG rev | 5 &# 8242; -ATTGCTATTCTTCGGCCAGTT-3 ' | ||
| SOX-7 fw | 5'-TGAACGCCTTCATGGTTTG-3 ' | ||
| SOX-7 rev | 5'-AGCGCCTTCCACGACTTT-3 ' | ||
| AFP fw | 5'-GTGCCAAGCTCAGGGTGTAG -3 ' | ||
| AFP rev | 5'-CAGCCTCAAGTTGTTCCTCTG-3 ' | ||
| CD31 fw | 5'-ATGCCGTGGAAAGCAGATAC-3 ' | ||
| CD31 rev | 5'-CTGTTCTTCTCGGAACATGGA-3 ' | ||
| ACTA-2 fw | 5'-GTGATCACCATCGGAAATGAA-3 ' | ||
| ACTA-2 rev | 5'-TCATGATGCTGTTGTAGGTGGT-3 ' | ||
| CDH-5 fw | 5'-GAGCATCCAGGCAGTGGTAG-3 ' | ||
| CDH-5 rev | 5'-CAGGAAGATGAGCAGGGTGA-3 ' | ||
| RUNX-1 fw | CCCTAGGGGATGTTCCAGAT-3 ' | RUNX-1-rev | TGAAGCTTTTCCCTCTTCCA-3 ' |
| KRT-14 fw | 5'-CACCTCTCCTCCTCCCAGTT-3 ' | ||
| KRT-14 rev | 5'-ATGACCTTGGTGCGGATTT-3 ' | ||
| TH fw | 5'-TGTACTGGTTCACGGTGGAGT-3 ' | ||
| TH rev | 5'-TCTCAGGCTCCTCAGACAGG-3 ' | ||
| GABBR-2 fw | 5'-CTGTGCCTGCCAGAGTTTCA-3 ' | ||
| GABBR-2 rev | 5'-ACGGCCTTGACGTAGGAGA-3 ' | ||
| EBNA-1 fw | 5'-ATCAGGGCCAAGACATAGAGATG-3 ' | ||
| EBNA-1 rev | 5'-GCCAATGCAACTTGGACGTT-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-GCCAGGAGGTCTTCGCTGTA-3 ' | ||
| FBX-15 fw | 5'-AATGCACGGCTAGGGTCAAA-3 ' | ||
| GAPDH fw | 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3 ' | ||
| GAPDH rev | 5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTG-3 ' |
Tabelle 1: Liste der qRT-PCR-Primer Primer-Sequenzen für die Bewertung der endogenen Pluripotenz Genexpression, Verstummen des Transgens und die Expression von drei Keimschicht Marker verwendet..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In der Vergangenheit war die einzige Möglichkeit, menschlichen pluripotenten Stammzellen, die einen bestimmten genetischen Mutation zu erhalten war, die Eltern unterziehen vor der Implantation genetische Diagnose zu rekrutieren und zu erzeugen embryonale Stammzellen aus ihrem verworfen Blastozysten 31,32. Unter Verwendung einer Neuprogrammierung Ansatz können die Forscher nun iPS von Patienten trägt nahezu jeder Genotyp zu erzeugen. Die Möglichkeit, von einem patientenspezifischen Zelllinie beginnen und eine leicht zugängliche Quelle ist sehr wichtig, da sie eine Untersuchung der Pathophysiologie von Erkrankungen und die anschließende Identifizierung neuer therapeutischer Ansätze ermöglicht.
In der vorliegenden Studie, kombinierten wir ein Plasmid Ansatz 15 mit einer Methode bereits angewendet, um iPSCs von PBMNCs zuvor nach Dichtegradiententrennung 22 eingefroren und erfolgreich generiert virenfrei iPSCs aus gefrorenen Leukozytenfilm PBMNCs produzieren. Die Verwendung von Buffy Coats statt Dichtegradienten getrennt PBMNCs alleows uns Kosten, Arbeitszeit und manuellen Schritte für die Betreiber bei der Probenverarbeitung zu reduzieren. Der Aufbau eines Low-Cost-Protokoll unter Verwendung von PBMNC aus gefrorenen Buffy Coats ist wichtig für Studien mit erhöhten Zahl der Teilnehmer und für Musterkollektionen in multizentrischen Studien. Wichtig ist, dass die Fähigkeit, iPSCs aus gefrorenen Buffy Coats produzieren ermöglicht den Zugriff auf zahlreiche gefrorene Bioproben bereits in Blutbanken gespeichert sind, mit Hilfe eines einfachen, kosteneffektiven und nicht so zeitaufwendig Verfahren zur Probenentnahme.
Diese Induktionsverfahren kann für die Ableitung von patientenspezifischen Integration freien iPSCs gegebenen Kolonien werden durch das Fehlen von episomalen Transgen nach wenigen Passagen (≥5 Passagen) gekennzeichnet, in beiden Ausgangsmaterialien sein. Bemerkenswert ist, beobachteten wir, dass alle ausgewählten iPSC Kolonien von beiden Arten von Ausgangsmaterial Display vergleichbar Pluripotenz Merkmale und die Erhaltung der zellulären und molekularen Ähnlichkeiten mit HES-Zellen, indica erhaltenTing ein erfolgreicher iPSC Ableitung und eine konsistente Reproduzierbarkeit des Protokolls.
Darüber hinaus haben wir erfolgreich generiert iPSCs von mehr als 10 menschliche Haut-Fibroblasten und 3 Herz mesenchymalen Stromazellen Leitungen (sowohl von gesunden Spendern und Patienten mit Herz- und Skelettmuskelerkrankungen) mit dieser Methode (Daten nicht gezeigt), was darauf schließen lässt, dass die beschriebenen Protokoll kann für die erfolgreiche Anpassung verschiedener Zelltypen verwendet werden. Jedoch ist die Wahl von Blut als Ausgangsmaterial vorteilhaft im Vergleich zu Fibroblasten, insbesondere wenn man bedenkt, dass umfangreiche Erweiterung von Fibroblasten in vitro kann die Effizienz der Umprogrammierung zu beeinflussen, basierend auf Fibroblasten Passagezahl und Proliferationsrate 33,34. Unser Protokoll ermöglicht auch die Erzeugung von gentechnikfreien iPSCs aus gefrorenen Buffy Coats nach einer minimalen Kulturzeit, damit Verringerung um etwa 3-4 Wochen die Zeit für die Ableitung von iPS-Zellen im Vergleich zu anderen Quellen, wie fi erforderlichFibroblasten. Darüber hinaus offenbart die jüngsten Studien, dass Blutzellen stamm iPSCs zeigen eine epigenetische Signatur, die ähnelt mehr hESCs als die aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) / 14,35 Fibroblasten erhalten.
Trotz der erfolgreichen Generation von iPSCs aus gefrorenen Buffy Coats, müssen einige Einschränkungen in diesem Protokoll berücksichtigt werden. Vor der erneuten Programmierung Induktion könnte die Verstärkung der PBMNCs aus gefrorenen Buffy Coats einen kritischen Schritt des Protokolls darstellen. Die Qualität des Ausgangsmaterials kann einen starken Einfluss auf die Auswahl und Isolierung von PBMNC, um ausreichende Zellzahlen zum Umprogrammieren Verfahren (mindestens 2 x 10 6 Zellen für die Elektroporation) zu erzielen. Dies ist vor allem aufgrund intrinsischer biologische Variabilität der Proben, sondern auch technische Probleme. Tatsächlich ist die Verstärkung des PBMNC aus gefrorenen Leukozytenfilmen weniger effizient im Vergleich zu PBMNCs aufgrund einer starken de aus Dichtegradiententrennung, erhaltenkeit auf manuelle Bedien Variabilität. Um die Reproduzierbarkeit und Effizienz der Amplifikation aus PBMNC gefrorenen Leukozytenfilmen ohne Dichtegradiententrennung zu verbessern, ist die Verwendung von automatisierten Systemen dringend empfohlen Leukozytenmanschette Fraktionen zu sammeln. Obwohl es schwieriger ist, eine ausreichende Anzahl von PBMNC aus buffy coats als PBMNCs nach Dichtegradiententrennung erweitern, ist die Effizienz der Umprogrammierung (etwa 0,001-0,0005%) der beiden Ausgangsmaterialien vergleichbar sind, nach Anpassung Effizienz Blut bereits berichtet 14, 23. Da die Umprogrammierung Effizienz gering für die regenerative Medizin Zwecke, die Verwendung von verbesserten EBNA1 / OriP (von Epstein-Barr-Virus, EBV) episomalen Vektoren können Sie die Anzahl der Kolonien iPSC für zukünftige Zelltherapie Entwicklung 22,36 erhöhen. Zusätzlich wird ein MEF Feeder-Schicht für iPSC Erzeugung und Aufrechterhaltung in unserem Protokoll verwendet. Um klinischem iPSCs zu erhalten, könnte eine Feeder-freie Kultur eine alte seinrnative Verfahren für weitere Studien.
Abschließend Dieses Protokoll stellt eine gültige Methode zur iPSCs von einer leicht zugänglichen Patienten Zellquelle mit dem großen Vorteil der Verwendung eines nicht-Integrations-System, die möglicherweise für die Ableitung von klinischem iPSCs, nicht nur für Krankheitsmodelle, sondern verwendet werden können erzeugen auch für einen künftigen personalisierten Medizin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube | Terumo | VF-054SBCS07 | |
| Ammodium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Potassium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| EDTA disodium powder | Sigma-Aldrich | E5134 | 0.5 M solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Life Sciences | 17-5442-02 | Polysucrose solution for density gradient centrifugation |
| Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) | Gibco | 21056-023 | No phenol red |
| Ham's F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X) | Gibco | 51500-056 | 1X (Stock: 100X) |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | 1X (Stock: 100X) |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Final Concentration at 200 µM |
| Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 300-07 | 100 ng/ml (Stock:100 µg/ml) |
| Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3) | PeproTech | 200-03 | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1) | PeproTech | 100-11 | 40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml) |
| Recombinant Human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | 2 U/ml (Stock: 50 U/ml) |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | 1 μM (Stock: 1 mM) |
| Human Holo-Transferrin | R&D Systems | 2914-HT | 100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml) |
| Amniomax II | Gibco | 11269016 | Medium for cytogenetic analysis |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 5850 | Medium for iPSC feeder-free culture |
| Knockout DMEM | Gibco | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | 0.1 mM (Stock: 50 mM) |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | 0.25 mM (Stock: 0.5 M) |
| Recombinant Human FGF basic, 145 aa | R&D Systems | 4114-TC | 10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml) |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | 10 µM (Stock: 10 mM) |
| Fetal Defined Bovine Serum | Hyclone | SH 30070.03 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Merck-Millipore | ES-006-B | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | |
| Collagenase, Type IV | Gibco | 17104-019 | 1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml) |
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | Cell detachment solution |
| Mouse Embryonic Fibroblast (CF1) | Global Stem | GSC-6201G | 1*106 cells/6 well plate |
| Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Plasmid pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | 1 µg (Stock: 1 µg/µl) |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit | Stemgent | 00-0009 | |
| Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody | Merck-Millipore | MAB4304 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Merck-Millipore | MAB4360 | 1/250 |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Merck-Millipore | MAB4381 | 1/250 |
| Anti-Oct-3/4 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-9081 | 1/500 |
| Anti-Nanog Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | 1/500 |
| Anti-Troponin I Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15368 | 1/500 |
| Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody | Sigma-Aldrich | A7732 | 1/250 |
| Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody | Covance Research Products Inc | MMS-435P-100 | 1/500 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Calbiochem | 657012 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse | Molecular Probes | A-11029 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit | Molecular Probes | A-21429 | 1/1000 |
| Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate | Corning | 3471 | |
| Trizol Reagent | Ambion | 15596-018 | reagent for RNA extraction |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754050 | Reverse transcriptase kit |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5124 | |
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 185-5195 | |
| Experion Automated Electrophoresis System | Bio-Rad | 700-7000 | Instrument to check RNA integrity |
| Experion RNA Highsense Analysis kit | Bio-Rad | 7007105 | Reagent kit to check RNA integrity |
| Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 ) | Zeiss | 495007 | |
| NeonTransfection System 100 µl Kit | Invitrogen | MPK10025 | Reagent kit for electroporation |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | Instrument used for electroporation |
| NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Instrument for DNA/RNA quantification |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid purification kit |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657 (2012).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
- Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
- Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
- Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
- Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565 (2010).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
- Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
- Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
- Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
- Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
- Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
- Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).
